Ćwiczenie nr 2

Ćwiczenie nr 2
KINETYKA HYDROLIZY SACHAROZY
I. Kinetyka hydrolizy sacharozy – reakcja chemiczna
Zasada:
Sacharoza
w
środowisku
kwaśnym
ulega
hydrolizie
z
wytworzeniem
-D-glukozy i -D-fruktozy. Jest to reakcja pseudo-I-rzędowa.
H+
sacharoza + H2O
-D-glukoza +
-D-fruktoza
Prędkość początkową V0 wyznaczamy badając przyrost stężenia produktów w czasie
trwania reakcji. Stężenie powstającej glukozy oznacza się metodą kolorymetryczną.
Odczynniki:
 0,08% roztwór sacharozy
 6 mol/L roztwór HCl
 10% roztwór NaOH
 nasycony roztwór kwasu pikrynowego
 równomolowy roztwór glukozy i fruktozy zawierający glukozę w stężeniu
0,83 mM/L (wzorcowy roztwór glukozy)
ĆWICZENIE PRAKTYCZNE
Wykonanie:
Doświadczenie wykonywane jest w 3 zespołach, z których każdy przeprowadza
reakcję w innej temperaturze (30 C, 35 C, 40 C).
1. Hydroliza sacharozy
a) Do 7 przygotowanych, suchych probówek umieszczonych w statywie dodać
po 1,5 ml roztworu NaOH.
b) Do probówki nieoznaczonej numerem odmierzyć:
5 ml roztworu sacharozy,
5 ml roztworu HCl
c) Probówkę z mieszaniną reakcyjną zakorkować i wymieszać jej zawartość.
1
Uwaga! Czynności opisane w punktach d), e) i f) należy wykonywać równocześnie!!!
d) Z probówki pobrać pipetą automatyczną 0,5 ml mieszaniny reakcyjnej
i umieścić ją w probówce nr 1 (zawierającej roztwór NaOH).
e) Rozpocząć pomiar czasu.
f) Probówkę z mieszaniną reakcyjną umieścić w termostatowanej łaźni wodnej:
Zespół I
– temp. 30 C
Zespół II
– temp. 35 C
Zespół III – temp. 40 C
Uwaga! Probówka z mieszaniną reakcyjną pozostaje w łaźni wodnej do zakończenia
doświadczenia!!!
g) Po czasie podanym w tabeli pobrać po 0,5 ml mieszaniny reakcyjnej i dodawać
je do probówek zawierających roztwór NaOH (probówki nr: od 2 do 6).
Dokładnie wymieszać zawartość probówek.
Nr probówki
Czas [min]
1
2
3
4
5
6
0,0
2,5
5,0
10,0
15,0
20,0
7
wzorzec
-
Absorbancja przy 550 nm
Stężenie glukozy [mM/L]
0,83
2
2. Oznaczenie stężenia glukozy
Zasada:
Glukoza redukuje kwas pikrynowy (2,4,6-nitrofenol) do kwasu pikraminowego
(2-amino-4,6-dinitrofenol).
Reakcja
zachodzi
w
środowisku
zasadowym,
w temp.100 C. Natężenie barwy powstającego, czerwonego związku jest wprost
proporcjonalne do stężenia glukozy.
a) Do probówki nr 7 (zawierającej już 1,5 ml roztworu NaOH) dodać 0,5 ml
wzorcowego roztworu glukozy i dokładnie wymieszać.
b) Do wszystkich probówek (nr: od 1 do 7) dodać po 1 ml roztworu kwasu
pikrynowego. Zawartość po zakorkowaniu dokładnie wymieszać. Usunąć
korki, a probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej i gotować przez 8 minut.
c) Probówki ochłodzić pod bieżącą wodą i uzupełnić ich objętość wodą
destylowaną z butelki do 10 ml (czyli dodać do każdej probówki 7 ml wody
destylowanej). Probówki zatkać korkami i dokładnie wymieszać zawartość.
d) Odczytać absorbancję przy długości fali światła równej 550 nm wobec próby
nr 1 (nie zawiera glukozy).
e) Obliczyć stężenie glukozy w poszczególnych probówkach, stosując wzór:
–
Cw
Epróby badanej –
Cx
Ewzorca
Epróby badanej
Cx =
x
Cw
Ewzorca
gdzie:
Cw – stężenie wzorca glukozy
Cx – stężenie glukozy w próbie
Opracowanie wyników:
1) Każdy zespół sporządza wykres zmiany stężenia glukozy w czasie c = f(t),
a następnie wyznacza graficznie szybkość początkową reakcji V 0. Jej wartość jest
równa tangensowi kąta nachylenia stycznej do krzywej w punkcie t = 0.
2) Sporządzić wykres zależności prędkości początkowych V 0 od temperatury V0=
f(T) na podstawie wartości uzyskanych przez wszystkie pracujące zespoły.
3
Hydroliza sacharozy katalizowana przez inwertazę drożdżową
II.
Inwertaza (sacharaza, ß-D-fruktofuranozydaza) należy do hydrolaz i podklasy
glikozydaz. Ułatwia ona zerwanie wiązania glikozydowego w sacharozie, rozkładając ją
na glukozę i fruktozę. Enzym ten występuje głównie w komórkach roślinnych, gdzie
związany jest ze ścianą komórkową.
Najłatwiej uzyskać jest inwertazę z komórek drożdży. W organizmie ludzkim
inwertaza, podobnie jak laktaza, znajduje się na wewnętrznej powierzchni komórek
nabłonka wyściełającego jelito cienkie. Inwertaza występuje również w ślinie pszczół,
biorąc udział w przetwarzaniu cukru z nektaru kwiatowego do cukrów prostych.
Inwertaza działa optymalnie przy pH około 4,7 (aktywna jest w szerokim kwasowym
zakresie pH od 4 do 6; przy pH 2 i 9 enzym jest praktycznie nieaktywny).
Wraz ze wzrostem temperatury rośnie również szybkość reakcji enzymatycznej. Po
osiągnięciu określonego optimum w danych warunkach, szybkość reakcji zaczyna maleć
w następstwie denaturacji cieplnej enzymu. Większość enzymów traci nieodwracalnie
aktywność, gdy temperatura przekroczy 650C i tylko nieliczne wytrzymują krótkie
gotowanie (żelatyna, rybonukleaza, czy też pepsyna w pH 1). W zakresie temperatur, w
którym denaturacja enzymu jest praktycznie nieistotna, a więc około 370 C, wzrost
temperatury o 100C powoduje zwiększenie szybkości reakcji mniej więcej 2- krotnie.
Odczynniki:
 ekstrakt z drożdży w 0,1mol/L buforze octanowym (pH=4,7)
 0,18 mol/L sacharoza w 0,1 mol/L buforze octanowym (pH=4,7)
 0,1 mol/L bufor octanowy (pH=4,7)
 10% roztwór NaOH
 nasycony roztwór kwasu pikrynowego
 równomolowy roztwór glukozy i fruktozy zawierający glukozę w stężeniu
0,83 mM/L (wzorcowy roztwór glukozy)

Wykonanie:
Doświadczenie wykonywane jest przez 1 zespół, przeprowadzający reakcję
w temperaturze 30 C.
4
1. Hydroliza sacharozy
a) Przygotować 9 suchych probówek opisując je kolejno od 1 do 6, zaś trzy
ostatnie z nich jako „W” , „R” i „O”
b) Do probówek od 1 do 6 i „W” i „O” dodać po 1,5 ml 10% roztworu NaOH.
c) Do probówki „R” odmierzyć:
1 ml buforu octanowego,
2 ml roztworu sacharozy
i dokładnie wymieszać jej zawartość.
d) Probówkę „R” przenieść do termostatowanej łaźni wodnej (temp.30 C).
Uwaga! Probówka „R” z mieszaniną reakcyjną pozostaje w łaźni wodnej do
zakończenia doświadczenia!!!
e) Po 8 min. do probówki „R” dodać 2 ml ekstraktu z drożdży, zamieszać
energicznie i natychmiast pobrać z probówki „R” pipetą automatyczną 0,5 ml
mieszaniny reakcyjnej i umieścić ją w probówce 1 (zawierającej 1 ml NaOH).
f) Rozpocząć pomiar czasu.
g) Po czasie podanym w tabeli z probówki „R” pobierać po 0,5 ml mieszaniny
reakcyjnej i dodawać ją do danej kolejnej probówki, zawierającej już 1 ml
NaOH (probówki od 2 do 6). Dokładnie wymieszać zawartość probówek.
Nr probówki
Czas [min]
1
2
3
4
5
6
0,0
2,5
5,0
10,0
15,0
20,0
W
wzorzec
-
Absorbancja przy 550 nm
Stężenie glukozy [mM/L]
0,83
5
2. Oznaczenie stężenia glukozy
Zasada:
Glukoza redukuje kwas pikrynowy (2,4,6-nitrofenol) do kwasu pikraminowego
Reakcja
(2-amino-4,6-dinitrofenol).
zachodzi
w
środowisku
zasadowym,
w temp.100 C. Natężenie barwy powstającego, czerwonego związku jest wprost
proporcjonalne do stężenia glukozy.
a) Do probówki „W” (zawierającej już 1,5 ml NaOH) dodać 0,5 ml wzorcowego
roztworu glukozy, a do probówki „O”( zawierającej już 1,5 ml NaOH) dodać
0,5 ml wody destylowanej, po czym zawartość każdej z probówek dokładnie
wymieszać.
b) Do wszystkich probówek (od 1 do 6, „O” i „W”) dodać po 1 ml roztworu
kwasu pikrynowego. Zawartość po zakorkowaniu dokładnie wymieszać.
Usunąć korki, a probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej i gotować przez
8 minut.
c) Probówki ochłodzić pod bieżącą wodą i do każdej z nich dodać 7 ml wody
destylowanej z butli. Probówki zatkać korkami i dokładnie wymieszać ich
zawartość.
d) Odczytać absorbancję przy długości fali światła równej 550 nm wobec próby
odczynnikowej „O”.
e) Obliczyć stężenie glukozy w poszczególnych probówkach, stosując wzór:
–
Cw
Epróby badanej –
Cx
Ewzorca
Epróby badanej
Cx =
x
Cw
Ewzorca
gdzie:
Cw – stężenie wzorca glukozy
Cx – stężenie glukozy w próbie
Opracowanie wyników:
1) Sporządzić wykres zmiany stężenia glukozy w czasie c = f(t), a następnie
wyznaczyć graficznie szybkość początkową reakcji V0. Jej wartość jest równa
tangensowi kąta nachylenia stycznej do krzywej w punkcie t = 0.
6