Aktywność i stężenie katepsyny D osocza i surowicy krwi

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2011 • Volume 47 • Number 2 • 177-179
Praca oryginalna • Original Article
Aktywność i stężenie katepsyny D osocza i surowicy krwi
– doniesienie wstępne
Activity and concentration of cathepsin D in the blood plasma
and serum – a preliminary report
Marta Siergiejuk, Michał Chlabicz, Marek Gacko
Klinika Chirurgii Naczyń i Transplantacji, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku
Streszczenie
Oznaczono aktywność i stężenia katepsyny D w osoczu i w surowicy krwi. Zarówno aktywność jak i stężenie tej peptydazy jest
niższe w osoczu niż w surowicy krwi. Źródłem zwiększonej aktywności/stężenia katepsyny D w surowicy są rozpadające się
płytki w czasie krzepnięcia krwi. Ze względu na możliwość wystąpienia obniżonej/zwiększonej liczby płytek we krwi w różnych
chorobach ilościową ocenę katepsyny D należy wykonywać w osoczu krwi.
Summary
The activity and concentration of cathepsin D were determined in blood plasma and serum. Both the activity and the concentration of this peptidase are lower in the plasma than in the serum. Blood platelets disintegrating during clotting are the source
of increased activity/concentration of serum cathepsin D. Since the decreased/increased platelet counts may be found in
various diseases, the quantitative assessment of cathepsin D should be performed in blood plasma.
Słowa kluczowe:katepsyna D, osocze, surowica
Key words:cathepsin D, plasma, serum
Wstęp
Osocze uzyskuje się przez wirowanie krwi pobranej do wiążącego jony wapnia cytrynianu sodu lub soli sodowej EDTA
oraz inaktywującej trombinę heparyny. Stanowi ono roztwór
związków chemicznych występujących we krwi zubożony
o kationy wapniowe albo wzbogacony o heparynę. Surowica krwi nie zawiera fibrynogenu, ale zawiera zaktywowane/
zinaktywowane czynniki krzepnięcia oraz wykazuje wyższą
aktywność niektórych enzymów, w tym glikozydaz i peptydaz uwolnionych z płytek po wynaczynieniu krwi, w czasie jej
krzepnięcia [10, 11, 14]. Występują także różnice w składzie
i strukturze wielu innych białek między osoczem a surowicą
krwi [1, 2, 7].
Celem pracy jest porównanie aktywności i stężenia aktywnych cząsteczek katepsyny D (EC 3.4.23.4) w osoczu i surowicy krwi człowieka.
Materiał i metody
Globina otrzymana z erytrocytów wołu metodą frakcjonowania kwasem solnym i acetonem (12); katepsyna D z wątroby wołu i pepstatyna A, Sigma, USA; odczynnik biuretowy,
POCh, Gliwice.
Osocze otrzymano z krwi pobranej z żyły łokciowej od 10
zdrowych osób dorosłych (5 kobiet i 5 mężczyzn) do 0,25
mol/l cytrynianu sodu w stosunku 1:9 v/v. Krew poddano
wirowaniu przy 1500 x g, w temperaturze 4ºC, w ciągu 30
minut. Surowicę otrzymano z krwi pobranej od tych samych
osób do 0,15 mol/l NaCl w stosunku 1:9 v/v, inkubowanej
w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut, poddanej wirowaniu j.w. Do oznaczeń posłużono się środkową 1/3 objętością
osocza i surowicy unikając w ten sposób aspiracji flotującej
warstwy lipoproteinowej i sedymentującej warstwy płytek
krwi.
Aktywność katepsyny D oznaczano przy użyciu globiny wołu
[12]. Stężenie aktywnych cząsteczek katepsyny D oznaczano metodą Knighta [9] i metodą Turka i wsp. [18]. W metodzie Knighta stężenie katepsyny D odczytywano z wykresu
kalibracyjnego opisującego zależność ilości produktów degradacji globiny od stężenia wysokooczyszczonego preparatu tej peptydazy firmy Sigma. W metodzie Turka i wsp. stężenie katepsyny D odczytywano z wykresu kalibracyjnego,
w którym wyznaczono stężenie pepstatyny A hamujące 50%
jej aktywności. Szczegóły metodyczne w/w metod są omówione w pracach ich autorów [9, 18] i szczegółowo dyskuto177
Aktywność i stężenie katepsyny D osocza i surowicy krwi – doniesienie wstępne
wane w pracy przeglądowej Minarowskiej i wsp. [12]. Liczbę
płytek krwi oznaczano metodą automatyczną przy użyciu
aparatu Picoscale P,S-4. Białko w osoczu i w surowicy oznaczano metodą biuretową [6].
Wyniki oznaczeń poddano analizie statystycznej posługując
się testem t-Studenta; wartość p<0,05 przyjęto jako istotną
statystycznie.
Wyniki
Aktywność katepsyny D jest niższa w osoczu krwi (258,4 ±
18,4 Tyr nmol/ml/h) niż w surowicy krwi (321,8 ± 23,8 Tyr
nmol/ml/h) (tabela I). Także stężenie aktywnych cząsteczek
katepsyny D, wyznaczone zarówno metodą Knighta jak
i metodą Turka i wsp. jest niższe w osoczu niż w surowicy
krwi. Istnieje ścisła zależność pomiędzy wynikami oznaczeń
aktywności i stężenia katepsyny D w osoczu i w surowicy
krwi, a także wyników oznaczeń jej stężenia otrzymanych
dwoma metodami. Liczba płytek krwi wynosiła 232,4 ± 52,6
/ml i mieści się w zakresie ogólnie przyjętej normy. Stężenie
białka w osoczu krwi wynosiło 76,4 ± 7,8, a w surowicy krwi
72,0 ± 7,0.
Tabela I.
Aktywność i stężenie katepsyny D w osoczu i surowicy krwi.
Katepsyna D
Osocze
Surowica
Istotność
Aktywność, Tyr nmol/ml/h
258,4 ±
18,4
321,8 ±
23,8
p < 0,01
Stężenie (metoda Knighta),
ng/ml
1,6 ± 0,3
2,1 ± 0,4
p < 0,05
Stężenie (metoda Turka i
wsp.), ng/ml
1,5 ± 0,3
2,2 ± 0,5
p < 0,05
Dyskusja
Niższą aktywność katepsyny D w osoczu niż w surowicy potwierdzają wcześniejsze doniesienia [14, 17]. Różnice powyższe wykazano także oznaczając stężenie łączne
cząsteczek aktywnych i nieaktywnych katepsyny D metodą
immunologiczną [4]. W osoczu/surowicy katepsyna D jest
wiązana i inaktywowana przez α2-makroglobulinę, co ma
miejsce w pH 4,5 i wyższym. Natomiast w pH 3,5 połączenie to ulega rozdysocjowaniu i peptydaza ta wykazuje pełną
aktywność. W tym pH ulega także gwałtownej autoaktywacji
prokatepsyna D. Większą aktywność w surowicy w niż w osoczu wykazano także w przypadku glikozydaz [11]. Źródłem
zwiększonej aktywności katepsyny D w surowicy są rozpadające się płytki krwi [3, 8, 14, 15, 16]. W czasie krzepnięcia
krwi zachodzi gwałtowny rozpad płytek krwi, z uwolnieniem
do surowicy zawartych w ich ziarnistościach specyficznych
i w lizosomach różnych związków chemicznych i enzymów.
Równoczesne oznaczanie aktywności i stężenia katepsyny D w osoczu i w surowicy krwi, pozwala z wielkości
różnicy określić aktywność/ilość tej peptydazy uwolnionej
z płytek, po wynaczynieniu krwi. Ilość/aktywność katepsyny
D uwolnionej z płytek zależy od ich liczby oraz od spraw178
ności mechanizmów płytkowej reakcji uwalniania (release
reaction). Porównanie aktywności katepsyny D w surowicy
i w osoczu może być cennym wskaźnikiem sprawności tej
reakcji. Uwalnianie in vivo z płytek katepsyny D ma miejsce
w miejscu powstania skrzepliny. Peptydaza ta uczestniczy
w solubilizacji skrzeplin żylnych i tętniczych. Można na podstawie różnicy jej aktywności w osoczu i surowicy wnioskować
o szybkości upłynnienia skrzeplin żylnych i tętniczych in
vivo. Krwinki białe zawierają również lizosomy i peptydazy
lizosomalne ale nie ulegają jednak rozpadowi w krwi wynaczynionej. Inne katepsyny i inne peptydazy, np. katepsyny
G, nie trawią globiny w pH 3,5, a ich aktywność nie jest hamowana przez pepstatynę. Czyni to wynik oznaczenia aktywności katepsyny D wolnym od wpływu innych peptydaz.
Najliczniejsze elementy morfotyczne jakimi są erytrocyty nie
zawierają lizosomów i nie zawierają katepsyny D.
Aktywność katepsyny D w surowicy krwi zależy od liczby
płytek we krwi, jest najniższa w przypadku obniżonej liczby płytek, wyższa w przypadku prawidłowej liczby płytek
i najwyższa w przypadku podwyższonej liczby tych komórek
[14]. Surowica otrzymana z osocza bogatopłytkowego wykazuje większą aktywność katepsyny D od surowicy otrzymanej z osocza ubogopłytkowego. Pozostaje do wyjaśnienia określenie aktywności katepsyny D we frakcji flotujących
lipoprotein oraz wpływ występowania mikrocząsteczek (MP)
w osoczu na aktywność katepsyny D, które można usunąć
przez ultrawirowanie [5, 13].
Wnioski
Do celów diagnostycznych, biorąc pod uwagę zmienną liczbę
płytek krwi i różną sprawność reakcji uwalniania płytkowego,
w patologii narządowej aktywność/stężenie katepsyny D:
1. zaleca się oznaczać w osoczu krwi, wolnym od wpływu
komponenty płytkowej,
2. wyniki oznaczeń w surowicy krwi winny uwzględniać
wpływ tej komponenty.
Piśmiennictwo
1. Anderson NL. The clinical plasma proteome: a survey of clinical
assays for proteins in plasma and serum. Clin Chem 2010; 56:
177-185.
2. Barelli S, Crettaz D, Thadikkaran L i wsp. Plasma/serum proteomics: pre-analytical issues. Expert Rev Proteomics 2007; 4(3):
363-370.
3. Beese J, Farr W, Grüner E i wsp. Proteolytische enzyme in normalen menschlichen blutplätchen. Klin Wsch 1966; 44: 10491053.
4. Gacko M, Guzowski A, Woźniak A i wsp. Stężenie i aktywność
katepsyny D w osoczu krwi i surowicy chorych z tętniakiem aorty brzusznej. Przegl Lek 2006; 65: 265-267.
5. George JN, Thoi LL, McManus LM. Isolation of human platelet
membrane microparticles from plasma and serum. Blood 1982;
60: 834-840.
6. Gornall AC, Bardawill CJ, David MM. Determination of serum
protein means of the biuret reaction. J Biol Chem 1949; 177:
751-766.
7. Issaq HJ, Xiao Z, Veenstra TD. Serum and plasma proteomics.
Chem Rev 2007; 107: 3601-3620.
8. Kehrel BE. Blood platelets: biochemistry and physiology. Hamo-
M. Siergiejuk, M. Chlabicz i M. Gacko
staseologie 2003; 23: 149-158.
9. Knight CG. Active – site titration of peptidases. Meth Enzymol
1995; 248: 85-101.
10. Leoncini G, Balestrero F, Maresca M. Lysosomal enzymes in
human platelets. Cell Biochem Function 1985; 3: 121-125.
11. Lombardo A, Caimi L, Marchesini S i wsp. Enzymes of lysosomal origin in human plasma and serum: assay conditions and
parameters influencing the assay. Clin Chim Acta 1980; 108:
337-346.
12. Minarowska A, Karwowska A, Gacko M. Quantitative determination and localization of cathepsin D and its inhibitors. Folia
Histochem Cytobiol 2009; 47(2): 153-177.
13. Nomura S, Fukuhara S. Platelet microparticles. Methods Mol
Biol 2004; 272: 269-277.
14. Ostrowska H, Worowski K. Płytki krwi źródłem aktywności katepsyny D surowicy. Acta Haematol Pol 1982; 13: 13-16.
15. Polasek J. Platelet secretory granules or secretory lysosomes?
Platelets 2005; 16: 500-501.
16. Rendu F, Brohard-Bohn B. The platelet release reaction: granules’ constituents, secretion and functions. Platelets 2001; 12:
261-273.
17. Solbach HG, Engelhardt A, Merten R. Unterschiede der enzymaktivitäten im serum und plasma und ihre bedeutung für die klinische enzymdiagnostik. Klin Wschr 1962: 40: 1136-1139.
18. Turk V, Lah T, Kregar I. Cathepsin D, cathepsin E, in: Methods of
enzymatic analysis ed. H. U. Bergmeyer. Verglag chemie, Weinheim, 1984; 5: 211-222.
Adres do korespondencji:
Klinika Chirurgii Naczyń i Transplantacji
Uniwersytet Medyczny w Białymstoku
15-276 Białystok, ul. M. Skłodowskiej-Curie 24A
tel. (85) 746 82 77; faks: (85) 746 88 96
e-mail: [email protected]; [email protected]
Zaakceptowano do publikacji: 17.03.2011
179