Białka rekombinowane i ukierunkowana mutageneza (2011/2012)
Transkrypt
Białka rekombinowane i ukierunkowana mutageneza (2011/2012)
INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015) Instrukcja do ćwiczeń nr 1 i 2 Modyfikacja genu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków) CEL Wprowadzenie mutacji punktowych do genu blgB: zamiana kodonu dla Leu 1 na Ala, zamiana kodonu dla Ile 2 na Ser i zamiana kodonu dla Val 92 na Phe. Dodatkowo, wprowadzenie miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych NdeI oraz KpnI, odpowiednio, na początku i na końcu genu. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA 1) Na czym polega metoda Overlap Extension PCR? 2) Czynniki wpływające na wydajność PCR. MATERIAŁY W EKTOR pMAT/blgB – wektor zawierający niezmodyfikowany gen blgB (matryca do reakcji PCR) STARTERY blgB V92F FOR blgB V92F REV blgB NdeI AS FOR blgB KpnI REV ODCZYNNIKI termostabilna polimeraza DNA Pfu (ThermoScientific, http://www.thermoscientificbio.com) bufor Pfu + MgSO4 (ThermoScientific) dNTP (ThermoScientific), mieszanina deoksynukleotydów woda destylowana (Polfa) standard do elektroforezy GeneRulerLowRange DNA Ladder, 25-700 bp (ThermoScientific) bufor obciążający do próbek (ThermoScientific) bufor TAE do elektroforezy DNA agaroza Basica LE (Prona) do przygotowania żeli SPRZĘT LABORATORYJNY pipety automatyczne termocykler termoblok aparat do elektroforezy horyzontalnej z zasilaczem transiluminator mikrowirówka ZESTAWY Gene Elute – Gel Extraction Kit (Sigma) – zestaw do izolacji DNA z żelu agarozowego 1 INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015) WYKONANIE ĆWICZENIA I. W małych probówkach (poj. 0,2 ml) przygotować roztwory do dwóch reakcji PCR. Uwaga: Wszystkie odczynniki należy trzymać w temperaturze około 0°C! PCR 1 woda destylowana bufor Pfu + MgSO4 (10 x stęż.) DNA matrycowy (pMAT/blgB, 50 ng/µl) blgB V92F FOR (50 µM ) blgB KpnI REV (50 µM) dNTP (10 mM) polimeraza Pfu (2,5 u/µl) 36,0 µl 5,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 5,0 µl PCR 2 36,0 µl 5,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 5,0 µl woda destylowana bufor Pfu + MgSO4 (10 x stęż.) DNA matrycowy (pMAT/blgB, 50 ng/µl) blgB V92F REV (50 µM) blgB NdeI AS FOR (50 µM) dNTP (10 mM) polimeraza Pfu (2,5 u/µl) II. Zaprogramować termocykler według poniższego schematu: NR 1 2 3 4 5 TEMPERATURA 95°C 95°C 45°C 72°C 4°C CZAS 3 min 30 s 30 s 30 s ∞ ← Liczba cykli 2 24 III. Przygotować 100 ml 2-procentowego roztworu agarozy w buforze TAE. Złożyć pojemnik do wylania żelu. Rozpuścić agarozę w kuchence mikrofalowej, wylać żel do pojemnika (ok. 70 ml). Do lekko przestudzonego żelu dodać 5 ul roztworu barwnika Midori Green. Zamocować plastikowy grzebień. Pozostawić żel do zastygnięcia. IV. Włączyć termoblok. Ustawić temperaturę grzania na 50°C. V. Po zakończeniu reakcji PCR dodać do próbek 8 µl buforu obciążającego. Umieścić żel w aparacie do elektroforezy. W razie konieczności uzupełnić ilość buforu TAE do wskazanego poziomu. Przenieść próbki do studzienek w żelu. Do osobnej studzienki nanieść 5 µl standardu. Przeprowadzić elektroforezę. VI. Przygotować 2 probówki o pojemności 1,5 ml, zważyć je i podpisać: PCR1 oraz PCR2. VII. Po zakończeniu elektroforezy sfotografować żel. Zdjęcie zapisać w folderze ĆWICZENIA IB1 2014_15. Następnie położyć żel na transiluminatorze i przy pomocy czystego skalpela wyciąć z żelu prążki zawierające produkty PCR o odpowiedniej wielkości. Paski agarozy przenieść do zważonych probówek. 2 INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015) VIII. Wyizolować DNA z agarozy stosując zestaw Gel-Out. Procedurę oczyszczania DNA przeprowadzić zgodnie z instrukcją podaną przez producenta zestawu. Do wymywania DNA z kolumny użyć wody destylowanej. Probówki z oczyszczonym DNA dokładnie podpisać z boku na matowym polu wg zamieszczonego wzoru: PCR1 lub PCR2, nr grupy. IX. Zmierzyć stężenie wyizolowanego DNA przy pomocy przystawki NanoQuant do czytnika płytek TECAN Infinite 200 (w przypadku niewystarczającej ilości ta czynność może zostać wykonana przez prowadzącego ćwiczenia). Stężenie DNA zapisać na probówce z próbką. X. Przygotować roztwór dla trzeciej reakcji PCR. PCR 3 woda destylowana x µl produkt PCR1 (V92F–KpnI) (100 ng) x µl produkt PCR2 (NdeI –V92F) (100 ng) x µl blgB NdeI AS FOR (50 µM) 1,0 µl blgB KpnI REV (50 µM) 1,0 µl bufor Pfu + MgSO4 (10 x stęż.) 5,0 µl dNTP (10 mM) 1,0 µl polimeraza Pfu (2,5 u/µl) 5,0 µl XI. XII. XIII. Ponownie uruchomić termocykler, przeprowadzić PCR korzystając z uprzednio wprowadzonego programu: Po zakończeniu reakcji PCR dodać do probówki 8 µl buforu obciążającego. Przeprowadzić elektroforezę produktów PCR 3 wykorzystując do tego żel przygotowany przez prowadzącego ćwiczenia. Wyizolować zmodyfikowany gen blgB z agarozy stosując zestaw Gene Elute – Gel Extraction. Probówki z oczyszczonym DNA dokładnie podpisać z boku na matowym polu wg zamieszczonego wzoru: PCR3 A1S2 V92F, nr grupy. 3 INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015) MATERIAŁY POMOCNICZE MAPA WEKTORA EKSPRESYJNEGO pETDuet-1 4 INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015) SEKWENCJA NUKLEOTYDOWA GENU blgB TTACCCAGAC CAATGGCAGC TTGAAGAACT ATGGTGAATG AAATCGATGC TGCTGTTCTG TTCGTACACC TGCCGATGCA AA ATGCTGATTG TATAGCCTGG CGTGTTTATG AAATGGGAAA GCAGTGTTTA AAAAAATACC CAGTGTCTGG CTGAAAGCCC TGCCATATCT CATGAAAGGT AAGCGATATT GAAACCGACA TGCCCAGAAA CCTGAATGAA CATGGAAAAT GGAAGTTGAT TATTCGTCTG CTGGATATTC AGCCTGCTGG CCGGAAGGTG AAAATCATTG AACAAAGTTC AGCGCAGAAC GATGAAGCAC AGCTTTAATC AGAAAGTTGC ATGCACAGAG ATCTGGAAAT CCGAAAAAAC TGGTTCTGGA CGGAACAGAG TGGAAAAATT CGACCCAGCT AGGCACCTGG CGCACCGCTG TCTGCTGCAG CAAAATTCCG CACCGATTAC CCTGGCATGT CGACAAAGCA GGAAGAACAG SEKWENCJE ROZPOZNAWANE PRZEZ ENZYMY RESTRYKCYJNE NdeI 5'- C A ^ T A T G -3' KpnI 5'- G G T A C ^ C -3' TABELA Z KODEM GENETYCZNYM Pierwszy Drugi U C A G Trzeci U Phe Phe Leu Leu Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Stop Stop Cys Cys Stop Trp U C A G C Leu Leu Leu Leu Pro Pro Pro Pro His His Gln Gln Arg Arg Arg Arg U C A G A Ile Ile Ile Met/Start Thr Thr Thr Thr Asn Asn Lys Lys Ser Ser Arg Arg U C A G G Val Val Val Val** Ala Ala Ala Ala Asp Asp Glu Glu Gly Gly Gly Gly U C A G WYTYCZNE DO SPRAWOZDANIA NR 1 Sprawozdanie (pisane w grupach dwuosobowych) powinno zawierać: a) krótki wstęp teoretyczny (maksimum pół strony) dotyczący białka BLG-B i metody OE PCR oraz cel przeprowadzonych doświadczeń, b) skrótowy opis doświadczeń przeprowadzonych na ćwiczeniach nr 1 i 2, c) wyniki poszczególnych doświadczeń oraz komentarz do wyników (rezultat PCR – zdjęcia żeli, ilość DNA uzyskanego po oczyszczaniu), d) sekwencje i charakterystykę samodzielnie zaprojektowanych starterów wprowadzających 3 mutacje do genu blgB oraz umożliwiających wklonowanie zmodyfikowanych genów do wektora pET DUET-1/dsbC, e) odpowiedzi na pytania zamieszczone poniżej, 5 INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015) f) bibliografię (oraz nazwy programów do projektowania starterów, jeśli takie były wykorzystywane). PYTANIA DO SPRAWOZDANIA NR 1 Dwa bufory najczęściej wykorzystywane w elektroforezie DNA to TAE oraz TBE: a) proszę wymienić ich skład, b) określić rolę poszczególnych związków wchodzących w skład buforów, c) wymienić zalety i wady obu buforów, d) podać informację, na jakiej wysokości należy się spodziewać prążków pochodzących od barwników wykorzystywanych w buforach obciążających t.j. błękitu bromofenolowego i cyjanolu ksylanowego w 2-procentowym żelu agarozowym, odpowiednio – w buforach TBE i TAE. 6