Ćwicz._4_Immobilizacja biomasy

ĆW. 4
IMMOBILIZACJA BIOMASY (2) - ZASTOSOWANIE
1. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie studenta z możliwością wykorzystania mikroorganizmów
do oczyszczania ścieków w układach innych niż wynikające z potrzeb bytowo-gospodarczych.
2. Literatura
Klimiuk Ewa, Łebkowska Maria (2005). Biotechnologia w ochronie środowiska. Wydawnictwo
Naukowe PWN.
Alper Nuhoglu, Beste Yalcin, (2005). Modelling of phenol removal in a batch reactor, Process
Biochemistry 40 1233–1239
C.I. Nair, K. Jayachandran, S. Shashidhar, (2008). Biodegradation of phenol, African Journal of
Biotechnology Vol. 7 (25), pp. 4951-4958
Czesław Olczak. Biologiczno-chemiczne oczyszczanie ścieków koksowniczych w skojarzeniu
z oczyszczaniem ścieków komunalnych. Zakłady Koksownicze „Zdzieszowice” Sp. z o.o.
3. Zakres wymaganych wiadomości
Biodegradacja fenolu, biochemiczne szlaki biodegradacji fenolu, kinetyka biodegradacji fenolu,
właściwości fenolu, zanieczyszczenia fenolem, skład i rodzaje podprocesowych wód koksowniczych,
przebieg oczyszczania ścieków koksowniczych, charakterystyka biologicznych etapów oczyszczania
ścieków koksowniczych.
4. Materiały
 Syntetyczne ścieki fenolowe (o stężeniu 0,04% fenolu);
 Mikroorganizmy zimmobilizowane na wybranym sorbencie mineralnym;
 Sprzęt lab.: 2 cylindry miarowe 100 ml, 2 kolby 500 ml;
 Immobilizacja w alginianie wapnia
 Inokulum bateryjne,
 Alginian sodu 3%,
 1,5 % roztwor chlorku wapnia,
 roztwór soli fizjologicznej (0,9 % NaCl) – opcjonalnie,
 Sprzęt lab.: Zlewka 50 ml, zlewka 250 ml, sitko.
 Oznaczenie zawartości fenoli metodą Martina
 bufor amonowy (pH = 10)
 roztwór 4-amino-antypiryny (2%)
 roztwór żelazicyjanku potasu (8 %)
 Sprzęt lab.: cylindry Nesslera, pipeta 1 ml lub 5 ml, 6 probówek wirówkowych, kuwety,
spektrofotometr.
5. Wykonanie ćwiczenia
Doświadczenie wykonać w dwóch wariantach: w jednej kolbie użyć mikroorganizmów
immobilizowanych w strukturze alginianu, w drugim immobilizowanych na wybranym sorbencie
mineralnym.
Przygotowanie próby z komórkami immobilizowanymi na sorbencie mineralnym:
Do cylindra miarowego o pojemności 100 cm3 należy odmierzyć 100 cm3 gęstej zawiesiny sorbentu.
Po sedymentacji objętość osadu powinna wynosić około 25 cm3, w przypadku niedoboru należy
skorygować różnicę i zanotować dokładną objętość osadu. Po sedymentacji ciecz nadosadową zlać
ponownie do kolby z zawiesiną sorbentu. Po zlaniu cieczy znad osadu do cylindra należy wlać 50 cm3
ścieków fenolowych zawartość wymieszać i przelać do kolby o pojemności 500 cm3. Następnie
cylinder przepłukać kolejną porcją (50 cm3) ścieków fenolowych przenosząc i przelać zawartość
cylindra do kolby.
Przygotowanie próby z komórkami immobilizowanymi w alginianie wapnia:
Alginian sodu wykorzystywany jest jako nośnik, na którym immobilizuje się biomasę. Jego
spolimeryzowana postać zbudowana jest z bloków jednostek kwasu mannurowego i guluronowego.
Jonowe usieciowanie prowadzące do polimeryzacji następuje w obecności jonów metali
dwuwartościowych. W niniejszym ćwiczeniu wykorzystywany będzie roztwór chlorku wapnia.
Do zlewki o pojemności 50 ml dodać 10 ml 3 % roztworu alginianu sodu oraz mieszając – 10 ml
inokulum bakteryjnego. Jednolity roztwór pobrać strzykawką i dozować po kropelce do drugiej zlewki
o pojemności 250 ml zawierającej 100 ml 1,5 % roztworu chlorku wapnia. Powstałe kulki alginianu
wapnia przefiltrować przez sitko i przemyć zimną wodą wodociągową, a następnie destylowaną.
Do cylindra miarowego o pojemności 100 cm3 należy odmierzyć 50 cm3 roztworu soli fizjologicznej
(0,9 % NaCl). Następnie dodać przygotowane kulki alginianu wapnia w objętości równej 25 cm3
(obserwuj poziom cieczy w cylindrze). Roztwór fizjologiczny należy zlać z powrotem do tej samej
kolby. Do drugiej kolby, o pojemności 500 cm3 odmierzyć 100 ml ścieków fenolowych i przenieść
kulki alginianu wapnia z cylindra do kolby ze ściekami. W razie trudności z przeniesieniem materiału
cylinder można spłukać przygotowanymi w kolbie ściekami.
Kolby pozostawić na wytrząsarce (140 obr./min.) lub użyć mieszadła magnetycznego. Po 20, 40, 60
i 80 minutach oznaczać zawartość fenolu w obu zlewkach. W przypadku eksperymentu
z sorbentem mineralnym z kolb należy pobierać po 2 ml cieczy, którą należy odwirować (3 min, 6000
obr/min). Ponadto zawartość fenoli należy oznaczyć również w próbie ścieków przed inkubacją.
Oznaczenie zawartości fenoli metodą Martina
Przenieść 1 cm3 próbki z eksperymentu z alginianem/ supernatantu z probówki wirówkowej do
cylindra Nesslera i uzupełnić wodą destylowaną do kreski (do objętości 50 cm3). Następnie dodać 0,5
cm3 buforu amonowego (pod dygestorium), 1 cm3 roztworu 4-amino-antypiryny (2 %), 1 cm3
roztworu żelazicyjanku potasu (8 %) i dokładnie wymieszać. Dokładnie po 15 minutach zmierzyć
absorbancję przy długości fali λ=510 nm względem próby ślepej (zawierającej wszystko poza próbą
badaną).
Stężenie fenolu wyznaczyć ze wzoru:
𝐶𝑓 =
1000 𝐸
𝑉
[mg/dm3]
gdzie: E – zawartość fenolu w próbce, mg
V – objętość pobranej próby, cm3
5. Wyniki
Wyniki należy przedstawić na wykresie
Cf = f(t)
Gdzie:
Cf – stężenie fenoli [mg/dm3], t – czas, min.
Uwzględnić kontrolę oraz ilość białka w immobilizowanym materiale oznaczoną we wcześniejszym
ćwiczeniu. Wyjaśnić przebieg krzywej, jeśli odbiega od spodziewanego przez ciebie kształtu zastanów
się dlaczego. Uzasadnij.