Laboratorium 05

Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
ĆWICZENIE 5
BIOLOGICZNE PROCESY ROZKŁADU MATERII ORGANICZNEJ.
BIOLOGICZNE OCZYSZCZANIE ŚCIEKÓW. KOMPOSTOWANIE.
/Opiekun merytoryczny: dr hab. Teodora M. Traczewska, prof. nadzw. PWr
modyfikacja: dr inż. Agnieszka Trusz-Zdybek i mgr inż. Maciej Bełcik/
1.
Zagadnienia szczegółowe:
- Znajomość pojęć: biodegradacja, biokumulacja, enzymy adaptacyjne, kometabolizm,
ksenobiotyk.
- Rozkład substancji naturalnych: celuloza, ksylan, skrobia, pektyny, chityna, lignina,
węglowodory, białka.
- Rozkład syntetycznych związków organicznych: chlorowcowane fenole, detergenty.
- Mikrobiologiczne przemiany metali ciężkich.
- Czynniki wpływające na podatność substancji organicznych na rozkład biologiczny.
2.
Literatura zalecana
- Schlegel G. Hans: Mikrobiologia ogólna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa
2000, s.500-535.
- Duvigneand Paul: Biosfera jako środowisko człowieka, s. 91-96
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
Zad. 1: Rozkład fenolu przez drobnoustroje wyizolowane z wody powierzchniowej oraz
przez szczep bakterii Psedomonas fluorescens - pokaz.
Materiały:
- Zawiesina drobnoustrojów wyizolowanych z wody powierzchniowej oraz szczepu
bakterii
- Psedomonas fluorescens,
- kolby płaskodenne z podłożem minimalnym 80 cm3,
- 0,1% roztwór fenolu,
- kolbki miarowe o pojemności 50 cm3,
- bufor fosforanowy,
- roztwór 4-aminoantypiryny, roztwór
1
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
- żelazicyjanku potasowego.
Przygotowanie:
Do kolby płaskodennej o objętości 250 cm3 zawierającej 80 cm3 sterylnego podłoża
minimalnego dodać sterylnie 10 cm3 0,1% roztworu fenolu i zaszczepić
drobnoustrojami
wyizolowanymi z
wody
powierzchniowej
oraz bakteriami
Psedomonas fluorescens. Jednocześnie przygotować zestawkontrolny zawierający
sterylne podłoże minimalne i fenol w takiej ilości jak w próbie zaszczepionej
bakteriami. Kolby ustawić na wytrząsarce i inkubować w temperaturze pokojowej
przez 72 h. Po tym czasie pobrać 10 cm3 hodowli, odwirować przez 10 minut z
prędkością 10 tys. obr./min i oznaczyć zawartość fenolu w 1 cm3 supernatantu.
Jednocześnie oznaczyć zawartość fenolu w próbce kontrolnej.
Oznaczanie fenolu – metoda 4-aminoantypirynowa:
Fenole lotne z parą wodną reagują przy pH=4 w obecności żelazicyjanku
potasowego z 4-aminoantypiryną tworząc pochodne indofenolowe o zabarwieniu od
żółtego do czerwonego, wzależności od stężenia fenolu. Do kolbki miarowej o poj. 50
cm3 wprowadzić 1 ml badanej próby, dodać 20 ml buforu fosforanowego (pH=7,9),
dobrze wymieszać. Następnie dodać 0,5 ml r-ru 4-aminoantypiryny, dobrze
wymieszać. Dodać 0,5 ml r-ru żelazicyjanku potasowego, dobrze wymieszać. Po 15
minutach odczytać absorpcję przy długości fali 500 nm względem próby kontrolnej.
Określić stężenie fenoli w próbce z krzywej wzorcowej.
Sporządzenie krzywej wzorcowej.
Do kolejnych czterech kolbek miarowych o poj. 50 ml wprowadzić 1, 2, 5, 10 ml
roztworu fenolu zawierającego w 1ml 0,01 mg fenolu (100-krotnie rozcieńczony
0,1% r-r fenolu). Dalej postępować jak podano wyżej przy oznaczaniu fenoli w
badanej próbce. Odczytać absorpcję kolejnych wzorców i sporządzić krzywą
wzorcową.
Wykonanie:
Określić metodą kolorymetryczną stężenie fenolu w badanych próbkach zgodnie z
przygotowanymi wzorcami. Wyznaczyć intensywność rozkładu fenolu w badanych
próbkach.
2
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
Zad. 2: Obserwacja rozkładu celulozy z udziałem mikroflory pochodzącej z różnych
środowisk glebowych.
Materiały:
- Różne rodzaje gleb (piasek, gleba ogrodowa, osad denny, gleba zanieczyszczona),
- gleba wyjałowiona termicznie,
- krążki bibuły,
- pojemniki na glebę,
- folia
Wykonanie:
Napełnić pojemnik do połowy badaną glebą, a następnie na powierzchnię podłoża
położyć sterylnie krążek bibuły (celuloza) i zwilżyć go wodą destylowaną. Pojemnik
przykryć folią. Analogicznie nastawić próbę kontrolną z podłożem wyjałowionym w
wysokiej temperaturze.
Obserwować powierzchnię krążków przez okres paru tygodni.
Zwrócić uwagę na pojawiające się plamy o różnym zabarwieniu i powstające w ich
miejscu ubytki. Pamiętać o tym, aby cały czas powierzchnia krążka pozostawała
wilgotna. Porównać intensywność rozkładu celulozy na badanych podłożach i w
próbie kontrolnej.
Zad. 3: Obserwacja rozkładu wybranych materiałów tekstylnych z udziałem mikroflory
pochodzącej z różnych środowisk glebowych.
Materiały:
- Różne rodzaje gleb (piasek, gleba ogrodowa, osad denny, gleba zanieczyszczona),
- gleba wyjałowiona termicznie,
- próbki tkanin,
- pojemniki na glebę.
Wykonanie:
Napełnić pojemniki do połowy badaną glebą, a następnie wprowadzić do każdej z
gleb badany materiał tak, aby jego część pozostawała ponad powierzchnię gleby i
przetrzymać przez kilka tygodni. Utrzymać wilgotność prób przez skrapianie wodą.
Obserwować powierzchnię krążków przez okres paru tygodni.
Po kilku tygodniach zaobserwować zmiany na powierzchni tkaniny i porównać
wyniki.
3
Zakład Biologii Sanitarnej i Ekotechniki
Porównać intensywność rozkładu różnych materiałów na badanych podłożach i w
próbie kontrolnej.
Zad. 4: Rozkład drewna i celulozy przez grzyby pasożytujące na drzewach.
Materiały:
- Zawiesina grzybni korowicy (Phanerochete sp.),
- pożywka mineralna o pH=4,5,
- krążki bibułowe,
- kawałki drewna,
- kolby stożkowe.
a) Rozkład drewna
Wykonanie:
Do dwóch probówek z pożywką wprowadzić sterylnie kawałek drewna. Jedynie
próbkę badaną zaszczepić 0,5 ml zawiesiny grzybni. Inkubować w temp. 370C min. 7
dób. Po czasie inkubacji zaobserwować rozkład drewna w obu próbach.
Zmiany w drewnie powodowane przez grzyb mogą być widoczne gołym okiem
dopiero po dłuższym czasie biodegradacji, ze względu na obecność w drewnie trudno
rozkładalnych
substancji
ligninowych
(osłaniających
celulozę).
Dlatego
o
dokonującym się procesie rozkładu można tu wnioskować pośrednio, np. na
podstawie wzrostu grzybni. Porastanie przez grzyb drewna świadczy o procesie jego
rozkładu, gdyż w pożywce nie ma innych źródeł węgla.
b) Rozkład celulozy
Wykonanie:
Do dwóch probówek z pożywką wprowadzić sterylnie krążek celulozowy. Jedynie
próbkę badaną zaszczepić 0,5 ml zawiesiny grzybni. Inkubować w temp. 370C min. 7
dób. Po czasie inkubacji zaobserwować rozkład celulozy w obu próbach. Wykonać
preparaty mikroskopowe z obu krążków. Zwrócić uwagę na przerośnięcie włókien
celulozowych strzępkami grzybni.
4