Przygotowanie ekstraktów z herbat (zielonej, czarnej, aroniowej

Przygotowanie ekstraktów z herbat (zielonej, czarnej, aroniowej) oraz suszonych grzybów. Sporządzenie krzywej wzorcowej z kationorodnikiem
ABTS na glutation
Zdolność antyoksydacyjna ekstraktów z herbat
Wśród produktów roślinnych szczególnie silnymi własciwościami
przeciwutleniającymi wyróżnia się herbata. Zawartość związków fenolowych, głównie
odpowiedzialnych za właściwości przeciwutleniające herbaty, może sięgać nawet 35% suchej
masy liści. Są to przede wszystkim katechiny, teaflawiny i tearubiginy.
W herbacie zielonej występują głównie katechiny, natomiast w herbacie oolong i
czarnej dominują teaflawiny i tearubiginy, powstające w procesie fermentacji liści herbacianych. Aktywność katechin stanowi 90% ogólnej pojemności przeciwutleniającej ekstraktu
zielonej herbaty. Efektywność przeciwutleniającego działania zielonej herbaty zależy od
ilości poszczególnych katechin. Podkreśla się zwłaszcza ich zdolność wiązania, szczególnie
niebezpiecznych dla organizmu, rodników hydroksylowych. Głównym składnikiem frakcji
fenolowej zielonej herbaty jest galusan (-)epigalokatechiny, zawierający w cząsteczce aż 8
wolnych grup OH, decydujących o jego wysokiej aktywności przeciwutleniającej
Czarna herbata wykazuje właściwości przeciwutleniające, co związane jest z obecnością teaflawin. Zawartość teaflawin w handlowych gatunkach herbaty jest znacznie zróżnicowana w zależności od pochodzenia oraz warunków stosowanych w procesie technologicznym.
Aronia
Ostatnio dużym zainteresowaniem cieszą się naturalne antyoksydanty do których zalicza się występujące w roślinach barwniki – flawonoidy w tym antocyjany. Do tych ostatnich
należy m.in. barwnik C3G (3-O-β-D glukozyd cyjnidyny) oraz jego aglikol – cyjanidyna. Są
to związki powszechnie występujące w warzywach i owocach. Duże ilości antocyjanów zawierają owoce o niebieskim bądź fioletowym zabarwieniu. Uważane są one za potencjalne
zmiatacze wolnych rodników tlenowych in vivo. W szczególności dużo antocyjanów zawartych jest w aronii czarnej (Aronia melanocarpa). W literaturze można znaleźć liczne opisy ich
neuro- i cytoprotekcyjnego działania, m.in. w chorobie Alzheimera, udarze mózgu, zawale
serca itp. Ekstrakt z owoców aronii jak i zawarte w niej antocyjany charakteryzują się silnymi
własnościami antyoksydacyjnymi
Grzyby
Wśród produktów spożywczych grzyby mogą być również bogatym źródłem
antyoksydantów. Wykazano że owocniki różnych gatunków grzybów zawierają między
innymi polifenole, karetoindy (likopen, beta-karoten), witaminę A, czyli związki mogące
skutecznie zmiatać RFT. W literaturze wykazano że całokowita zdolność antyoksydacyjna
ekstraktów z różnych gatunków grzybów może różnić się znacznie pomiędzy sobą.
Zasada oznaczania zdolności antyoksydacyjnej
Przeciwrodnikowe właściwości roztworów wodnych można oznaczyć badając ich
zdolności do dezaktywacji kationorodników ABTS•+. Zasada metody polega na bezpośrednim
generowaniu ABTS•+ w wyniku utleniania ABTS przez nadsiarczan potasu. Kationorodnik
ABTS•+ w przeciwieństwie do ABTS-u charakteryzuję się bardzo intensywym zabarwieniem.
Dodatek przeciwutleniacza powoduje redukcję kationorodnika ABTS•+ do ABTS i spadek
intensywności zabarwienia roztworu rodników. Stopień redukcji ABTS •+ określany jest
spektrofotometrycznie przy długości fali 734 nm.
Wykres zależności absorbancji roztworu kationordnika ABTS▪+ od długości fali
Aby wyrazić zdolność antyoksydacyjną roztworów złożonych z wielu różnych
antyoksydantów odnosi się ją najczęściej do małoczasteczkowych antyoksydatnów takich jak
Trolox lub Glutation. W tym celu należy wykonać krzywą wzorcową różnych stężeń tych
antyoksydantów i zmierzyć ich zdolność odbarwiania roztworu kationorodnika ABTS •+.
Reakcję jakie będą zachodzić w roztworze przedstawione są ponieżej.
Literatura:
Zych I and Krzepiłko A. (2010). Pomiar całkowitej zdolności antyoksydacyjnej wybranych antyoksydantów i naparów metodą redukcji
rodnika DPPH. Chemia.
Bronisław K. Głód1 Fotometryczny pomiar Całkowitego Potencjału Antyoksydacyjnego i jego zastosowanie do badania niektórych ziół i
zawartych w nich polifenol
A. Robaszkiewicz, G. Bartosz, M. Ławrynowicz, and M. Soszyński (2010) „The Role of Polyphenols, -Carotene,and Lycopene in the
Antioxidative Action of the Extracts of Dried, Edible Mushrooms” Journal of Nutrition and Metabolism
R., Pellergrini N., Proleggente A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans C (1999).: Antioxidant activity applying an mproved ABTS radical
cation decolorization assay. Free Rad. Biol. Med., ; 9-10: 1231-1237.
ODCZYNNIKI-MATERIAŁY-SPRZĘT
herbaty (czarna, zielona, aroniowa)
suszone grzyby
woda destylowana
roztwór kationorodnika ABTS•+ (kwas 2'2-azynobis-3-etylobenzotiazolin-6sulfonowy)
glutation zredukowany (3 mM)
pipety
spektrofotometr
czajnik
wirówka
moździerz
PROCEDURA
1.
2.
3.
4.
5.
Przygotowanie naparów z herbat
Odważyć na wadzę 1g poszczególnych herbat.
Każdą porcję zalać 25 ml wrzątku i parzyć przez 5 minut.
Po upływie czasu napary schłodzić pod wodą.
Następnie roztwory zwirować 4000 x g przez 10 minut.
Supernatant przelać do nowych probówek i umieścić w zamrażarce do dalszego oznaczenia.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Przygotowanie ekstraktów z grzybów
Dokładnie oczyścić badane fragmenty grzybów z wszelkich zanieczyszczeń.
Zetrzeć w moździerzu owocnik grzyba.
Następnie odważyć 1g rozdrobnionego preparatu.
Każdą porcję zalać 25 ml wrzątku i parzyć przez 5 minut.
Po upływie czasu ekstrakt schłodzić pod wodą.
Następnie roztwory zwirować 4000 x g przez 10 minut
Supernatant przelać do nowych probówek i umieścić w zamrażarce do dalszego oznaczenia.
1.
2.
3.
4.
Wykonanie krzywej wzorcowej zmiatania kationorodnika ABTS▪+ przez glutation
Rozcieńczyć roztwór kationorodnika ABTS ▪+ tak, aby jego absorbancja przy długości
fali λ = 734 nm wynosiła 1. Po przygotowaniu roztwór przechowywać w ciemności.
Wykonać rozcieńczenia w zredukowanego glutationu: 3; 2,5; 2; 1,5; 1; 0,5; 0,25
mM.
Spektrofotometr wyzerować na wodę destylowaną.
Dodać do 7 kuwet po 990 µl uprzednio przygotowanego roztworu ABTS▪+ o absorbancji równej 1.
5. Następnie do kuwet dodawać po 10µl poszczególnych stężeń glutationu, wymieszać
przez odwrócenie i mierzyć absorbancję dokładnie po 15 sekundach przy długości fali
734nm.
6. Z uzyskanych wyników sporządzić wykresy zależności (% inhibicji) od stężenia zredukowanego glutationu oraz absorbancji od stężenia zredukowanego glutationu.
Zdolność glutationu do przeciwdziałania reakcji utleniania można obliczyć ze wzoru:
[% inhibicji] = 100 ▪ (A0 - Aw) / A0
Gdzie:
A0 – absorbancja wyjściowa roztworu kationorodnika ABTS ▪+
Aw – absorbancja właściwa roztworu kationorodnika ABTS ▪+ po inkubacji 15s z antypoksydantem (glutation)