BUDOWA I WŁAŚCIWOŚCI AMINOKWASÓW

1
Ć WICZENIE 1
BUDOWA I WŁAŚCIWOŚCI AMINOKWASÓW
1.1. AMINOKWASY BIAŁKOWE
Aminokwasy są związkami organicznymi zawierającymi co najmniej jedną grupę
karboksylową -COOH oraz co najmniej jedną grupę aminową -NH2. W zależności od położenia
grupy aminowej względem karboksylowej wyróżniamy α-, β- i γ-aminokwasy. W przyrodzie
występuje ponad 300 różnych aminokwasów, ale tylko 20 z nich wchodzi w skład białek (tzn. są
kodowane w kodzie genetycznym). Wszystkie aminokwasy białkowe są α-aminokwasami,
w których grupa aminowa znajduje się przy atomie węgla bezpośrednio sąsiadującym z grupą
karboksylową (tzw. atomie węgla α). Wyjątek stanowi prolina, która posiada grupę aminową
wbudowaną w pierścień. Aminokwasy niebiałkowe także często pełnią istotne funkcje biologiczne
np. β-alanina wchodzi w skład koenzymu A, a kwas γ-aminomasłowy jest neuroprzekaźnikiem.
Ciekawym aminokwasem niebiałkowym, który powstaje w wyniku modyfikacji istniejącego
łańcucha
polipeptydowego
jest
hydroksyprolina
występująca
w
niektórych
białkach
(np. w kolagenie). Ogólna struktura α-aminokwasów oraz przykładowe β- i γ-aminokwasy zostały
przedstawione na rys 1.1.
Rys. 1.1 Aminokwasy
Wśród białkowych aminokwasów tylko glicyna (R = H) jest achiralna. Wszystkie pozostałe
aminokwasy mają cztery różne podstawniki przy węglu α (asymetrycznym), są zatem cząsteczkami
chiralnymi, mogącymi występować jako enancjomery określane umownie jako L i D (projekcja
Fischera). Wszystkie chiralne aminokwasy białkowe należą do szeregu L (wyjątek stanowi prolina).
Z punktu widzenia konfiguracji absolutnej (projekcja Newmana wg zasady Cahna, Ingolda i Preloga)
wszystkie aminokwasy mają konfigurację (S) (z wyjątkiem (R)-cysteiny) (rys. 1.2). Chiralne
aminokwasy wykazują czynność optyczną, czyli skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego o pewien
Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW
2
kąt, charakterystyczny dla danego aminokwasu. Znak skręcalności ((+) lub (-)) jest jedyną wielkością,
która pozwala rozróżnić enancjomery danego aminokwasu, ponieważ wszystkie pozostałe właściwości
fizyczne i chemiczne są identyczne.
Rys. 1.2. Konfiguracja aminokwasów na przykładzie alaniny
L-aminokwasy, zależnie od zdolności organizmu do syntezy, dzieli się na endogenne oraz
egzogenne. Człowiek może syntezować jedynie część podstawowego zestawu aminokwasów, które są
nazywane
aminokwasami
endogennymi.
Pozostałe
(egzogenne)
muszą
być
dostarczane
z pożywieniem. Są to walina, leucyna, izoleucyna (o rozgałęzionych łańcuchach bocznych),
fenyloalanina, tryptofan (zawierające pierścień aromatyczny), lizyna, treonina i metionina, a u dzieci
także histydyna i arginina. D-aminokwasy występują w stanie wolnym, ścianie komórkowej bakterii oraz
w antybiotykach peptydowych i są nieprzyswajalne przez zwierzęta i człowieka.
Właściwości chemiczne aminokwasów wynikają z jednoczesnej obecności dwóch grup
funkcyjnych – aminowej i karboksylowej. Powoduje to, że aminokwasy są związkami
amfoterycznymi, czyli mogą reagować zarówno jak kwasy i jak zasady. W roztworach wodnych
cząsteczki aminokwasów występują w formie niezjonizowanej tylko w ilości 0,1%, natomiast reszta
cząsteczek to jony. Sumaryczny ładunek cząsteczki aminokwasu zależy od pH środowiska.
W roztworach wodnych występuje równowaga kwasowo–zasadowa pomiędzy kationem i anionem
oraz jonem obojnaczym (zwitterionem) powstałym w wyniku oddziaływania grup funkcyjnych
w obrębie tej samej cząsteczki (rys. 1.3).
Rys. 1.3. Równowaga kwasowo-zasadowa
Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW
3
W środowisku silnie kwasowym aminokwasy występują jako kationy, w środowisku silnie
zasadowym – jako aniony. Stałe równowagi (pKa) tych przemian są charakterystyczne dla
poszczególnych aminokwasów. Dodatkowo aminokwasy zasadowe i kwasowe określa się także pKa
grup bocznych. Istnieje także takie pH roztworu w którym ładunek sumaryczny cząsteczki jest równy
zeru, a aminokwas występuje w formie jonu obojnaczego. Takie pH nosi nazwę punktu
izoelektrycznego (pI). Wartości pI dla większości aminokwasów białkowych są bliskie 6.
W przypadku aminokwasów posiadających dodatkowe grupy aminowe lub karboksylowe punkt
izoelektryczny ulega przesunięciu z uwagi na dodatkową jonizację tych grup (tabela 1.1). Stałe
dysocjacji i wartość punktu izoelektrycznego wyznacza się przez miareczkowanie roztworami
silnych kwasów i zasad.
Tabela 1.1. Przykładowe wartości pI i pKa aminokwasów
aminokwas
Ala
Leu
Ser
His
Arg
Lys
Asp
Glu
pI
6,02
5,98
5,68
7,74
10,76
9,74
2,87
3,22
pKa2
9,87
9,74
9,21
9,33
8,99
9,06
9,90
9,47
pKa1
2,35
2,33
2,19
1,80
1,82
2,16
1,99
2,10
pKa gr. bocz.
6,04
12,48
10,54
3,90
4,07
Stosuje się różne kryteria klasyfikacji aminokwasów. Biorąc pod uwagę budowę łańcuchów
bocznych
aminokwasy
możemy
podzielić
na:
alifatyczne
obojętne,
alifatyczne
hydroksyaminokwasy, siarkowe, zasadowe, kwasowe i ich monoamidy oraz aminokwasy
z pierścieniem aromatycznym. Poza wymienionymi grupami podziału znajduje się pozbawiona
łańcucha bocznego glicyna.
1.1.1. Aminokwasy alifatyczne obojętne
Do tej grupy należą: alanina, walina, leucyna, izoleucyna oraz prolina, których wzory
strukturalne przedstawione są na rys. 1.4. Aminokwasy te zawierają alifatyczny, niepolarny, a zatem
hydrofobowy łańcuch boczny (R).
Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW
4
Rys. 1.4. Aminokwasy alifatyczne obojętne
1.1.2. Alifatyczne hydroksyaminokwasy
Alifatyczne hydroksyaminokwasy to seryna i treonina (rys. 1.5.). Ich łańcuchy boczne są neutralne
(pozbawione ładunku) i polarne dzięki obecności grupy hydroksylowej.
Rys. 1.5. Alifatyczne hydroksyaminokwasy
1.1.3. Aminokwasy siarkowe
Do aminokwasów siarkowych (rys. 1.6.) należą: cysteina (zawierająca grupę tiolową SH)
i metionina (zawierająca grupę tiometylową SCH3). Cysteina pod wpływem łagodnych czynników
utleniających dimeryzuje do cystyny (Cys)2 z utworzeniem wiązania disiarczkowego.
Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW
5
Rys.
1.6. Aminokwasy siarkowe
1.1.4. Aminokwasy zasadowe
Aminokwasami zasadowymi (rys. 1.7) są: lizyna (zawierająca na końcu łańcucha bocznego
grupę aminową), arginina (zawierająca grupę guanidynową) oraz histydyna (posiadająca silnie
zasadowy pierścień imidazolowy).
Rys. 1.7. Aminokwasy zasadowe
1.1.5. Aminokwasy kwasowe i ich amidy
Do aminokwasów kwasowych (rys 1.8.) zalicza się kwas asparaginowy i kwas glutaminowy.
W łańcuchach bocznych tych aminokwasów znajduje się dodatkowa grupa karboksylowa. Amidami
kwasów asparaginowego i glutaminowego są asparagina i glutamina.
Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW
6
Rys. 1.8. Aminokwasy kwasowe i ich amidy
1.1.6. Aminokwasy z pierścieniem aromatycznym
Do tej grupy należą aminokwasy zawierające podstawnik aromatyczny (rys. 1.9) czyli:
fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan. Obecność pierścienia aromatycznego warunkuje zdolność do
pochłaniania promieniowania UV w zakresie 260 – 290 nm (właściwość ta jest wykorzystywana
w metodach ilościowego oznaczania białka). Tyrozyna zawiera dodatkowo grupę hydroksylową
w pierścieniu. Tryptofan jest aminokwasem heteroaromatycznym.
Rys. 1.9. Aminokwasy aromatyczne
Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW
7
1.2. WYKONANIE ĆWICZENIA
Najbardziej charakterystyczną reakcją barwną α-aminokwasów jest reakcja z ninhydryną.
Jest ona uwarunkowana równoczesną obecnością wolnej grupy aminowej i karboksylowej przy tym
samym atomie węgla. W reakcjach barwnych uwarunkowanych budową łańcucha bocznego
aminokwasu, pozytywne wyniki dają również związki nie będące aminokwasami, których cząsteczki
zawierają takie same lub podobne grupy funkcyjne.
Białka, zawierające z reguły wszystkie rodzaje aminokwasów, dają również pozytywne
odczyny w reakcjach na łańcuchy boczne poszczególnych aminokwasów. Istnieje ponadto szereg
reakcji związanych z charakterystycznymi cechami budowy białek. Do reakcji wykorzystujących
obecność wiązań peptydowych lub specyficzną budowę przestrzenna cząsteczki należą: reakcja
biuretowa i reakcje oparte na wytracaniu białka z roztworu za pomocą różnych czynników
denaturujących.
Schemat postępowania w celu identyfikacji aminokwasów przy wykorzystaniu barwnych
reakcji wskaźnikowych przedstawia rysunek 1.10.
Odczynniki:
1. 1% roztwory aminokwasów: glicyny (Gly), cystyny ([Cys]2), fenyloalaniny (Phe), tyrozyny
(Tyr), tryptofanu (Trp), histydyny (His), argininy (Arg)
2. 1% roztwór białka (albuminy lub kazeiny)
3. 0,2M bufor fosforanowy pH 6,0
4. 6M NaOH
5. 10% NaOH
6. 1% α-naftol w etanolu
7. 1% NaBrO
8. HNO3 stężony
9. H2SO4 stężony
10. 0,5% roztwór CuSO4
11. 20% kwas trichlorooctowy (TCA)
12. 2% roztwór octanu ołowiu(II) (Uwaga! Silna trucizna!)
13. odczynnik Millona: 10 g rtęci metalicznej rozpuścić w 14 ml stężonego HNO3 i rozcieńczyć
dwukrotną objętością wody (Uwaga! Silna trucizna!)
14. roztwór kwasu glioksalowego: roztwór a – 1 g pyłu magnezowego zalać 20 ml wody; roztwór b
– 2,5 g kwasu szczawiowego rozpuścić w 25 ml wody; w celu sporządzenia roztworu kwasu
glioksalowego należy do roztworu b wlać roztwór a, po czym ochłodzić, przesączyć, dodać
2,5 ml lodowatego kwasu octowego i dopełnić wodą do 100 ml
15. 36% aldehyd mrówkowy
16. 10% roztwór NaNO2
17. 1% roztwór kwasu sulfanilowego w 1M HCl
18. 10% roztwór Na2CO3
19. 1% roztwór ninhydryny w etanolu (96%)
Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW
8
Rys. 1.10. Schemat identyfikacji aminokwasów za pomocą reakcji barwnych
Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW
9
1.2.1. REAKCJE OGÓLNE AMINOKWASÓW I BIAŁEK
A. Reakcja z ninhydryną
Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu do amoniaku, dwutlenku węgla i
aldehydu uboższego o jeden atom węgla. W przypadku reakcji z α-aminokwasami istotną rolę
odgrywa grupa karboksylowa. Kondensacja dwóch cząsteczek ninhydryny (zredukowanej i
utlenionej) z amoniakiem w środowisku o pH wyższym niż 4 daje związki o barwie fioletowoniebieskiej (purpura Rühemana), której natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu
aminowego aminokwasu (rysunek 1.11).
Rys. 1.11. Reakcja aminokwasu z ninhydryną
Reakcja ta znalazła liczne zastosowania zarówno w próbach jakościowych jak i w metodach
ilościowego oznaczania aminokwasów. Dodatni wynik reakcji z ninhydryną (oprócz aminokwasów,
peptydów i białek) dają także sole amonowe, aminocukry i amoniak. Z tego względu oznaczana
próba musi być wolna od tych związków.
Wykonanie
Do czterech ponumerowanych próbówek odpipetować po 1 ml buforu fosforanowego o pH 6
i dodać po 5 kropli roztworów: 1 – badany; 2 – dowolny aminokwas; 3 – białko; 4 – woda. Następnie
dodać po 2 krople roztworu ninhydryny i ogrzewać przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej.
Zanotować wyniki.
B. Reakcja z kwasem azotowym(III)
Aminokwasy wydzielają azot cząsteczkowy w reakcji z kwasem azotowym(III) w wyniku
deaminacji (rysunek 1.12). Reakcję tę wykorzystuje się w gazometrycznej metodzie ilościowego
oznaczania α-aminokwasów metodą Van Slyke’a.
Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW
10
Rys. 1.12. Schemat reakcji aminokwasów z kwasem azotowym(III)
Wykonanie
Do trzech ponumerowanych próbówek odpipetować po 2 ml 10% NaNO2 i 1 ml 2M
CH3COOH. Następnie dodać po 0,5 ml roztworów: 1 – badanego, 2 – glicyny, 3 – wody. Dokładnie
zamieszać. Wydzielanie się pęcherzyków gazu świadczy o powstawaniu azotu cząsteczkowego.
C. Reakcja biuretowa (reakcja Piotrowskiego)
Białka i peptydy zawierające co najmniej 2 wiązania peptydowe tworzą z jonami miedzi(II)
w środowisku zasadowym połączenia kompleksowe o barwie fioletowej (Rys.1.13.), natomiast
produkty kompleksowego powiązania jonów miedzi(II) z aminokwasami są niebieskie. Wyjątkiem
jest histydyna, która ze względu na budowę swego łańcucha bocznego, daje produkt o barwie
fioletowo-niebieskiej. Reakcja biuretowa znalazła zastosowanie w wielu metodach ilościowego
oznaczania białek. Nazwa reakcji pochodzi od biuretu – najmniejszego związku dającego pozytywny
wynik w tej próbie (rys. 1.14.).
Rys 1.13. Kompleks jonów miedzi z białkami
Rys.1.14. Biuret
Wykonanie
Do 0,5 ml badanego roztworu dodać 10 kropli 6 M NaOH i 2 krople 0,5% roztworu CuSO4.
Przeprowadzić próby z wodą oraz roztworami histydyny, glicyny i albuminy. Zanotować wyniki.
D. Wytrącanie białka za pomocą kwasu trichlorooctowego
Jednym z powszechniej stosowanych odczynników odbiałczających jest kwas trichlorooctowy
(TCA), który w stężeniu 2-10% powoduje wytrącenie większości białek z roztworu.
Wykonanie
Do 0,5 ml badanego roztworu dodać 3 krople 20% roztworu TCA. Przeprowadzić próby
z roztworem albuminy i dowolnego aminokwasu. Zanotować wyniki.
Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW
11
1.2.2. REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE NIEKTÓRYCH AMINOKWASÓW
A. Reakcja na obecność aminokwasów siarkowych
Związki posiadające grupy sulfhydrylowe (utlenione lub zredukowane), jak cysteina i
cystyna, ogrzewane w środowisku zasadowym ulegają rozkładowi, a powstały anion siarczkowy daje
z solami ołowiu(II) czarny lub szary osad siarczku ołowiu(II). Metionina, której atom siarki
uczestniczy w utworzeniu wiązania tioeterowego, nie daje tej reakcji. Schematyczny przebieg reakcji
cysteiny z jonami ołowiu(II) przedstawia rysunek 1.15.
Rys. 1.15. Schemat przebiegu reakcji cysteiny z jonami ołowiu(II)
Wykonanie
Do czterech ponumerowanych próbówek odmierzyć po 5 kropli roztworów: 1 – badanego,
2 – cystyny, 3 – dowolnego aminokwasu, 4 – białka. Następnie dodać po 10 kropli 6M NaOH i 5
kropli roztworu (CH3COO)2Pb. Próbkę ogrzewać przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej.
Zanotować wyniki.
B. Reakcja ksantoproteinowa na obecność pierścienia benzenowego
Pierścienie benzenowe różnych związków ulegają nitrowaniu (rysunek 1.16) pod wpływem
tzw. mieszaniny nitrującej (stężony kwas azotowy i stężony kwas siarkowy w stosunku 1:3).
Produkty nitrowania mają barwę od jasnożółtej do brązowej, znacznie intensywniejszą po
zalkalizowaniu próby. Reakcja zachodzi z różną szybkością i wydajnością w zależności od budowy
związku i warunków reakcji. Tyrozyna, tryptofan i białka zawierające te aminokwasy nitrują się
łatwo, natomiast do nitrowania fenyloalaniny niezbędne jest intensywne ogrzewanie próbki.
Rys. 1.16. Schemat reakcji ksantoproteinowej z udziałem tyrozyny
Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW
12
Wykonanie
Ponumerować 6 próbówek i odpipetować po 0,5 ml roztworów: 1 – badanego, 2 – tyrozyny,
3 – tryptofanu, 4 – fenyloalaniny, 5 – białka, 6 – glicyny. Dodać 2 krople stężonego kwasu
azotowego i 6 kropli stężonego kwasu siarkowego. Mieszaninę ogrzewać przez kilka minut we
wrzącej łaźni wodnej, a następnie ostudzić i ostrożnie dodać 2 ml 6M roztworu NaOH (wlot
probówki skierować pod wyciąg). Gdyby zabarwienie nie wystąpiło, reakcję powtórzyć, ogrzewając
próbę w płomieniu mikropalnika do momentu pojawienia się brązowych par tlenków azotu (kilka
minut). Zanotować wyniki.
C. Reakcja Millona na obecność fenoli
Związki zawierające grupy fenolowe tworzą w środowisku kwasu azotowego w temperaturze
40°C czerwone kompleksy nitrofenoli z jonami rtęci(II) i rtęci(I). Jest to reakcja charakterystyczna
dla monofenoli, a więc spośród aminokwasów tylko dla tyrozyny. Służy do ilościowego oznaczania
tyrozyny metodą fotometryczną.
Wykonanie
Ponumerować cztery próbówki i dodać po 10 kropli roztworów: 1 – badanego, 2 –tyrozyny, 3
– dowolnego aminokwasu, 4 – białka. Następnie dodać po 5 kropli odczynnika Millona i ogrzać
kilka minut we wrzącej łaźni wodnej. Zanotować wyniki.
D. Wykrywanie układu indolowego w tryptofanie
W środowisku kwaśnym tryptofan reaguje z aldehydami, między innymi z kwasem
glioksalowym HOOC-CHO (rekcja Adamkiewicza-Hopkinsa (inna nazwa reakcja Hopkinsa-Colé))
lub aldehydem mrówkowym (reakcja Voisseneta), dając barwne produkty kondensacji (Rys.1.17).
Wykonanie
Ponumerować cztery próbówki i dodać po 10 kropli roztworów: 1 – badanego, 2 – tryptofanu, 3 –
dowolnego aminokwasu, 4 – białka oraz po 4 krople roztworu kwasu glioksalowego lub aldehydu
mrówkowego. Następnie wprowadzić ostrożnie po wewnętrznej ściance probówki około 0,5 ml
stężonego kwasu siarkowego tak, aby nie wymieszać kwasu z roztworem wodnym. W obecności
pochodnych indolu na granicy faz powstanie fioletowe zabarwienie. Zanotować wyniki.
Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW
13
Rys. 1.17. Schemat kondensacji tryptofanu z kwasem glioksalowym i aldehydem mrówkowym
E. Reakcja Pauly’ego na obecność histydyny
Pochodne imidazolu, jak również fenole i aminy aromatyczne, dają z solami diazoniowymi
w środowisku zasadowym barwne produkty sprzęgania. Pauly zastosował w tym celu kwas
diazobenzenosulfonowy, który przygotowuje się bezpośrednio przed użyciem przez diazowanie
kwasu sulfanilowego kwasem azotowym(III) na zimno. Histydyna, tyrozyna i białka dają w reakcji
Pauly’ego jednakowe, krwistoczerwone zabarwienie.
Wykonanie
Zmieszać w probówce po 2 ml roztworów kwasu sulfanilowego i azotanu(III) sodu
i zawartość probówki wytrząsać przez kilka minut chłodząc ją jednocześnie pod bieżącą wodą.
Następnie ponumerować pięć próbówek i odmierzyć do każdej po 5 kropli odczynnika diazowanego
i kolejno po 5 kropli roztworów: 1 – badanego, 2 – histydyny, 3 – tyrozyny, 4 – dowolnego
aminokwasu, 5 – białka oraz po 10 kropli roztworu Na2CO3. Zanotować wyniki.
F. Reakcja na obecność argininy (Sakaguchi)
Grupa guanidynowa argininy z α-naftolem w obecności utleniacza bromianu(I) sodu w
środowisku zasadowym tworzy czerwono-pomarańczowy kompleks (Rys. 1.18). W razie dłuższego
działania bromianu(I) sodu następuje odbarwienie roztworu, ponieważ barwny produkt ulega
dalszym przemianom. Dodatek mocznika może stabilizować utworzony barwnik.
Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW
14
Rys. 1.18. Schemat reakcji argininy z α-naftolem
Wykonanie
Ponumerować 4 próbówki i odpipetować po 1 ml roztworów: 1 – badanego, 2 – argininy, 3dowolnego aminokwasu, 4 – białka. Następnie dodać kolejno po 0,5 ml 10% NaOH, 2 krople 1%
etanolowego roztworu α-naftolu oraz 2 krople roztworu NaBrO. Wymieszać zawartość i zanotować
wyniki.
1.3. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW
Uzyskane podczas wykonanych doświadczeń wyniki należy przedstawić w formie
zestawienia (tabela 1.2). Uwaga! Wszystkie reakcje należy wykonywać dla roztworu badanego
(otrzymanego od prowadzących zajęcia) oraz dla odpowiednich roztworów wzorcowych.
Tabela 1.2
Reakcja
Gly
(Cys)2
Phe
…
…
Badana
próbka
Z ninhydryną
…
…
1.4. PYTANIA I ZADANIA
2. Dokonaj klasyfikacji aminokwasów w oparciu o różne kryteria ich podziału: (np.
białkowe/niebiałkowe, egzogenne/endogenne, budowa łańcucha bocznego).
3. Narysuj formę L i D wskazanego aminokwasu.
4. Wyjaśnij co to jest punkt izoelektryczny. Podaj przykłady aminokwasów znacznie różniących się
od siebie wartościami pI.
5. Narysuj wzory aminokwasów: chiralnego i achiralnego. Podaj ich nazwy i skróty trzyliterowe.
6. Opisz reakcję wykorzystywaną w ilościowym oznaczaniu aminokwasów metodą Van Slyke’a.
7. Wyjaśnij na czym polega reakcja Pauly’ego i jakie aminokwasy można przy jej użyciu
wykrywać.
8. Zaproponuj schemat postępowania służący do wykrycia tryptofanu w próbie badanej.
Laboratorium Biochemii, Wydział Chemiczny PW