Wyniki i opis analizy jakościowej
Transkrypt
Wyniki i opis analizy jakościowej
ANALIZA FITOCHEMICZNA I OCENA AKTYWNOŚCI ANTYOKSYDACYJNEJ EKSTRAKTÓW Z COCHLOSPERMUM ANGOLENSE (WELW.) Tomasz Baj1, Agnieszka Najda2, Karolina Mikulska1, Elwira Sieniawska1, Kazimierz Głowniak1 1 Katedra i Zakład Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2 Katedra Warzywnictwa i Roślin Leczniczych, Laboratorium Jakości Warzyw i Surowców Zielarskich, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie WSTĘP Cochlospermum angolense (C. angolensis), zwane także Maximilianea angolensis (Welw. ex Oliv.) lub Borututu, to drzewo występujące na obszarze Angolii (zachodnia Afryka), osiągające od 3 do 6 metrów wysokości, szeroko rozgałęzione. Liście są łykowate, lancetowate lub podłużnie-lancetowate, spiczaste i drobnoząbkowane. Kwiaty mają intensywnie żółte, zebrane w większą grupkę, działki kielicha są niemal zupełnie nagie. Owoce są obłe, spłaszczone u góry, gdy dojrzeją rozdzielają się na cztery cienkie, łykowate i prążkowane części. Nasiona są nerkowate, czarne i błyszczące, otoczone jedwabnymi kosmkami. Borututu od wielu dziesięcioleci znane było ze swoich silnych właściwości oczyszczających i detoksykacyjnych. Potocznie określane przez mieszkańców „darem natury dla wątroby”. Napar z korzenia używany był w najróżniejszych kuracjach, zarówno do picia jak i mycia. Cochlospermum angolense (Welw.) jest bogate w chinony, katechiny, kwas galusowy oraz biflawonoidy. W XX wieku ogromnym propagatorem oraz entuzjastą Borututu został Portugalczyk – Julio de Sousa Lopes. Jego spostrzeżenia rozpoczęły proces pozyskiwania korzenia Cochlospermum angolense na skalę przemysłową i dystrybuowania jako suplement diety. WYNIKI i OMÓWIENIE Materiał badany Wyniki analizy jakościowej kwasów fenolowych metodą HPLC przedstawiono na ryc 2. Ekstrakcja chloroformem Ekstrakcja metanolem Ekstrakt metanolowy 0,35 Oddestylowanie rozpuszczalnika Wytrawianie wrzącą wodą Sączenie Ekstrakcja eterem dietylowym Warstwa eterowa Wyciąg eterowowodny MATERIAŁ I METODY Substancją roślinną wykorzystaną w badaniach był korzeń Cochlospermum angolense (Welw.). Materiał do badań został zebrany w środkowej części Angoli, w maju 2008 roku. Suszony był na otwartej przestrzeni, zawieszony na sieciach rybackich umocowanych pod strzechą. Proces suszenia trwał 3 miesiące – od czerwca do końca sierpnia, następnie korzenie zostały umyte, wyczyszczone i wysuszone ponownie. Oczyszczanie próbek metodą SPE (Solid-Phase Extraction) Dalsze oczyszczenie próbki zostało przeprowadzone metodą SPE na kolumience oktadecylowej C18. Etapy oczyszczania: kondycjonowanie metanolem i 50% wodnym roztworem metanolu. Z roztworu (SOX) pobrano określoną ilość i rozcieńczono w znanej objętości wody dejonizowanej. Tak przygotowaną próbkę zaaplikowano na kolumienkę i wymywano jej zawartość metanolem 50%. Otrzymany eluat przeniesiono do kolbki miarowej o pojemności 10 ml i uzupełniono do kreski 50% metanolem. Z tak otrzymanego roztworu pobrano próbki do analizy HPLC. 0,15 1 2 3 0,05 -0,05 Wytrząsanie z 5% roztworem wodorowęglanu sodu 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Retention Time (min) Warstwa eterowa Wyciąg eterowowodnowęglanowy Warstwa wodno-wodorowęglanowa Zakwaszenie do pH=3 Ekstrakcja eterem dietylowym Warstwa eterowa Ryc. 2. Chromatogram HPLC wolnych kwasów fenolowych wyizolowanych z ekstraktów Cochlospermum angolense: 1: kwas galusowy, 2: kwas protokatechowy, 3: kwas elagowy, 4: kwas p-hydroksybenzoesowy, 5: kwas ferulowy. Analiza HPLC na podstawie porównania czasów retencji otrzymanych pików z wzorcowymi kwasami fenolowymi wykazała obecność 5 kwasów fenolowych. Z których 3 były już wcześniej wyizolowane i zidentyfikowane w gatunku Cochlospermum, zaś kwasy: elagowy i p-hydroksybenzoesowy zostały zidentyfikowane raz pierwszy w Cochlospermum angolense. Wyniki analizy aktywności antyoksydacyjnej ekstraktów otrzymanych przy użyciu 100% i 80% roztworu metanolu przedstawiono na ryc. 3 i 4. Ryc. 1. Schemat zolacji wolnych kwasów fenolowych Warunki analizy jakościowej wolnych kwasów fenolowych metodą HPLC Analizę jakościową kwasów fenolowych metodą HPLC przeprowadzono stosując chromatograf typu LaChrom (Merck, Niemcy) z detektorem diodowym DAD L-7450, pompą L-7100, pętlą dozującą 20 ul, kolumną chromatograficzną LiChrospher 100 RP-C18 o wymiarach 250x4 mm i średnicy ziaren dp = 5 um. Fazą rozwijającą stanowił gradient rozpuszczalników: woda + 1% kwas octowy:metanol:acetonitryl, szybkość przepływu wynosiła 1 ml/min, Tożsamość związków badano porównując czasy retencji oraz widma DAD związków wzorcowych ze związkami badanymi. Warunki analizy HPLC kwasów fenolowych: Temperatura Czas analizy Szybkość przepływu fazy ruchomej Objętość nastrzyku Ryc. 3. Wykres zależności stężenia ekstraktu od % inhibicji wolnego rodnika dla ekstraktu 100% metanolowego. 25ºC 45 min 1 ml/min 10 μl A – 1% kwas octowy w wodzie B – MeOH Izolacja kwasów fenolowych z ekstraktów z korzenia Cochlospermum angolense Zastosowano klasyczną metodę ekstrakcji typu ciecz – ciało stałe w aparacie Soxhleta. Rozdrobniony surowiec - korzeń Cochlospermum angolense wstępnie ekstrahowano chloroformem aby usunąć związki balastowe. Wyciąg chloroformowy odrzucono, gilzę z surowcem dokładnie wysuszono pod wyciągiem i poddano wyczerpującej ekstrakcji metanolem w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika. Schemat izolacji wolnych kwasów fenolowych przedstawiono na ryc. 1. Frakcję wolnych kwasów fenolowych poddano oczyszczaniu metodą SPE. 5 Warstwa wodna Aktualnie, na polskim rynku suplementów diety, obecny jest preparat, będący wysuszonym korzeniem Cochlospermum angolense. Zalecany jest on do stosowania w przypadku takich dolegliwości jak: • marskość wątroby różnego pochodzenia, • niewydolność wątroby, woreczka żółciowego, trzustki i śledziony, • problemy wątroby po usunięciu woreczka żółciowego, • poalkoholowa destrukcja komórek wątroby, • rozprzestrzenianie się trujących metabolitów alkoholowych we krwi i ich akumulacja w komórkach nerwowych (środek na kaca), • polekowa obstrukcja przewodów żółciowych (chemoterapia), • bakteryjne owrzodzenie przewodu pokarmowego (H. Pyllori), • wirus opryszczki (jako płukanki i okłady), • podwyższony poziom cholesterolu. Absorbance (AU) Wyciąg wodny 4 0,25 Skład fazy ruchomej C - acetonitryl Czas Skład gradientu (%) analizy A B C (min.) 0 -10 20 45 35 10,1-15,0 20 40 40 15,1-25,0 20 20 60 25,1-45,0 20 50 30 Oznaczenia aktywności antyoksydacyjnej ekstraktu w teście DPPH Przed ekstrakcją miałko sproszkowaną substancję roślinną macerowano porcjami 20 ml metanolu w czasie 12 godzin. Następnie ekstrahowano surowiec metanolem (równolegle 100% i 80%) pod chłodnicą zwrotną w koszyczku grzewczym w czasie 120 min. Ekstrakty przesączano i przygotowano odpowiednie rozcieńczenia, które poddano pomiarowi potencjału antyoksydacyjnego. Różne ilości badanych ekstraktów (0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4 μl zostały zmieszane z roztworem DPPH. Mieszaniny inkubowano w ciemności przez 30 minut, a następnie zmierzono absorbancję przy długości fali 517 nm, jako odnośnika użyto metanolu (Cary 50 UV-Vis Spectrophotometer, Varian INC, USA). Określono kinetykę reakcji za pomocą oprogramowania Cary WinUV Software. Wszystkie pomiary wykonano w trzech powtórzeniach dla obu stężeń ekstrahenta. Ryc. 4. Wykres zależności stężenia ekstraktu od % inhibicji wolnego rodnika dla ekstraktu 80% metanolowego. Jak przedstawiono na powyższych rycinach, ekstrakty metanolowe otrzymane z korzeni Cochlospermum angolense wykazywały właściwości antyoksydacyjne. Przy czym bardziej aktywny okazał się ekstrakt 80% metanolu IC50 5,62 ug/ml, w przypadku 100% ekstraktu metanolowego IC50 wynosiło 7,97 ug/ml. WNIOSKI Z przeprowadzonych badań fitochemicznych oraz oceny aktywność antyoksydacyjnej ekstraków z korzeni Cochlospermum angolese wynikają następujące wnioski: 1. Analiza HPLC wykazała obecność 5 kwasów fenolowych: galusowego, protokatechowego, elagowego, p-hydroksybenzoesowego i ferulowy. Z których kwasy: elagowy i p-hydroksybenzoesowy zostały zidentyfikowane raz pierwszy w Cochlospermum angolense. 2. Ekstrakty metanolowe wykazywały właściwości antyoksydacyjne – bardziej aktywny okazał się ekstrakt 80% metanolu IC50 5,62 ug/ml, w przypadku 100% ekstraktu metanolowego IC50 wynosiło 7,97 ug/ml.