Ćwiczenie 2

Ćwiczenie 2. Analiza kinetyki denaturacji białka przy pomocy różnicowej
mikrokalorymetrii skanningowej
2.1 Podstawy teoretyczne mikrokalorymetrii
1. Alan Cooper, Chemia biofizyczna, PWN 2010 – rozdział dotyczący termodynamiki
białek.
2. Obowiązkowe
zapoznanie
się
z
plikiem
PDF:
http://www.chem.gla.ac.uk/staff/alanc/dsc.pdf zawierającym podstawy teoretyczne i
praktyczne techniki DSC.
3. Informacje dotyczące obsługi, budowy i funkcjonowania mikrokalorymetru N-DSCIII zamieszczone na stronie producenta: www.tainstruments.com. Strona zawiera
pełną instrukcję obsługi urządzenia oraz oprogramowanie wraz z instrukcją służące do
analizy termogramów. Na stronie zawarte są również materiały poglądowe w postaci
plików video.
2.2. Praktyczne zastosowanie mikrokalorymetrii DSC i ITC w badaniach biomolekuł
http://www.chem.gla.ac.uk/staff/alanc/ oraz rozdział 5 poz. 1 z p. 2.1.
2.3. Eksperymenty
Eksperyment 1. Wyznaczenie wpływu stabilizacyjnego mostka disiarczkowego na strukturę
białka DraE – podjednostki strukturalnej fimbrii Dr uropatogennych szczepów E. coli.
Białko DraE posiada strukturę immunoglobulonopodobną (Ig-podobną) tworzoną przez dwie
antyrównoległe beta-kartki o układzie spłaszczonej β-beczki. Białko jest monomerem o
zwartej budowie jedno-domenowej. Charakteryzuje się ono temperaturą topnienia równą
87°C i czasem połowicznego rozpadu w temperaturze 25°C wynoszącym 106 lat. W efekcie
jest ono jednym z najstabilniejszych białek scharakteryzowanych do tej pory w literaturze.
Cechą charakterystyczną białka DraE jest obecność mostka disiarczkowego, który w obrębie
pojedynczej β-kartki łączy sąsiednie nici A i B. Taki układ mostka disiarczkowego jest
unikalny w kontekście przynależności białka DraE do superodziny białek typu Ig. W
klasycznej strukturze Ig mostek disiarczkowy łączy ze sobą nici B i F znajdujące się w
sąsiednich β-kartkach – klasycznym przykładem są przeciwciała.
Materiały
1. Białko DraE (m.cz. 14 kDa) o stężeniu w zakresie od 1 do 2 mg/ml w buforze
fosforanowym (20 mM bufor fosforanowy, 100 mM NaCl, pH 7,2).
2. Białko DraE-delta-SS o stężeniu w zakresie od 1 do 2 mg/ml w buforze
fosforanowym (20 mM bufor fosforanowy, 100 mMNaCl, pH 7,2). Jest to
rekombinantowa forma białka DraE, w którym w strukturze reszty cysteiny tworzące
mostek disiarczkowy zmutowano do reszt cysteiny.
3. Struktura krystalograficzna białka DraE (PDB ID: 1UT1).
4. Materiały niezbędne dla przeprowadzenia pomiaru kalorymetrycznego: wąż
silikonowy o średnicy wewnętrznej 2 mm, silikonowe zatyczki kapilar kalorymetru –
2 sztuki, smar silikonowy, kolba próżniowa, pompa próżniowa, pipety o objętości
roboczej 0,1 – 1 ml, okrągłodenne probówki Eppendorfa o objętości 2 ml.
5. Mikrokalorymetr skaningowy różnicowy N-DSC-III firmy ThermoAnalysis (TA).
Wykonanie eksperymentu
Jedna grupa dokonuje analizy tylko i wyłącznie jednego z porównywanych białek. Dla
przeprowadzenie porównawczej analizy termodynamicznej konieczne jest pobranie wyników
od innej grupy dokonującej analizy drugiego białka (informacje od prowadzącego).
1. Wyjaśnienie budowy, funkcji i obsługi mikrokalorymetru DSC.
2. Wyjaśnienie metodologii wyznaczenia parametrów termodynamicznych procesu
denaturacji białka: ∆Cp, ∆H, ∆S, ∆G z wykorzystaniem programu: NanoAnalyze
Software v.2.2.0 (dostępny darmowo na stronie: www.tainstruments.com).
3. Przedstawienie termogramu dla buforu referencyjnego. Buforem referencyjnym jest
ostatni bufor dializacyjny otrzymany w wyniku preparatyki białka DraE. Bufor
dializacyjny (bufor referencyjny): 20 mM bufor fosforanowy, 100 mM NaCl, pH 7,2.
4. Odgazowanie preparatu białka DraE przez mieszanie z wykorzystaniem mieszadła
magnetycznego przez okres 15 minut pod próżnią o wielkości 0,9 bara.
5. Opróżnienie celki pomiarowej z buforu referencyjnego. Celka pomiarowa jest
oznaczona literą „S”. W celce referencyjnej „R” pozostaje bufor referencyjny.
6. Naniesienie do celki pomiarowej próby analizowanego białka DraE.
7. Założenie silikonowych zatyczek na wloty kapilar – zabezpieczenie przed
„wypchnięciem” roztworów z kapilar w trakcie podnoszenia ciśnienia w czaszy
mieszczącej króćce kapilar.
8. Zamknięcie czaszy kapilar głowicą ciśnieniową i po ustabilizowaniu termicznym
układu zadanie ciśnienia o wartości 3 atmosfer.
9. Rozpoczęcie skanowania w zakresie temperatur od 25°C do 110°C z prędkością
skanowania 2°C/min. Doświadczenie składa się z jednego eksperymentu grzania i
jednego eksperymentu chłodzenia. Przed rozpoczęcie i po zakończeniu skanowania
celki są równoważone odpowiednio w temperaturze początkowej i finalnej przez 10
minut.
10. Określenie stężenia białka przez pomiar absorbancji UV i w oparciu o
współczynnik ekstynkcji policzony na podstawie sekwencji aminokwasowej białka.
Opracowanie wyników
Na podstawie uzyskanych termogramów przy wykorzystaniu oprogramowania NanoAnalyze
Software v.2.2.0 (dostępny darmowo na stronie: www.tainstruments.com) określić
następujące parametry procesu denaturacji białka:
1. DraE:
Entalpia całkowita procesu denaturacji białka DraE – tzw. ∆Hcal.
Temperatura topnienia białka.
Określić czy proces denaturacji białka DraE jest odwracalny.
2. DraE-delta-SS
Entalpia całkowita procesu denaturacji białka DraE-delta-SS – tzw. ∆Hcal.
Temperatura topnienia białka.
Określić czy proces denaturacji białka DraE-delta-SS jest odwracalny i
równowagowy.
Wyznaczenie następujących wartości zmian funkcji termodynamicznych procesu
denaturacji białka DraE-delta-SS w temperaturze 25°C: ∆Cp, ∆H, ∆S, ∆G.
Wyznaczenie funkcji termodynamicznych ∆H, ∆S i ∆G w zakresie temperatur od 0 do
100°C.
Podać wnioski na temat wpływu stabilizacyjnego mostka disiarczkowego na strukturę
białka DraE korzystając dodatkowo z danych publikacyjnych. Podać informacje na
temat mechanizmu denaturacji białek DraE i DraE-delta-SS.
Literatura
1. Piątek R, Bruździak P, Wojciechowski M, Zalewska-Piatek B, Kur J. The noncanonical
disulfide bond as the important stabilizing element of the immunoglobulin fold of the Dr
fimbrial DraE subunit. Biochemistry. 2010 Feb
23;49(7):1460-8.
2. Piątek R, Bruździak P, Zalewska-Piatek B, Kur J, Stangret J. Preclusion of irreversible
destruction of Dr adhesin structures by a high activation barrier for the unfolding stage of the
fimbrial DraE subunit. Biochemistry. 2009 Dec 15;48(49):11807-16.
Eksperyment 2. Wyznaczenie mechanizmu denaturacji oraz termodynamicznych parametrów
stabilizacji struktury białka DraD.
Białko DraD podobnie jak białko DraE jest podjednostką strukturalna fimbrii Dr. Posiada ono
topologię identyczną jak białko DraE, a obie struktury są praktycznie identyczne. Białko
DraD wykazuje jednak całkowicie odmienne parametry stabilizacji termodynamicznej niż
białko DraE. Denaturuje ono w temperaturze 53°C w sposób odwracalny, co pozwala na
przeprowadzenie analizy w oparciu o mechanizm denaturacji równowagowej odwracalnej.
Cechą odróżniającą białko DraD od białka DraE jest lokalizacja mostka disiarczkowego,
który jest usytuowany jak w klasycznej strukturze typu immunoglobulinowego.
Materiały
1. Białko DraD (mcz. 14,3 kDa) o stężeniu w zakresie od 1 do 2 mg/ml w buforze
fosforanowym (20 mM bufor fosforanowy, 100 mM NaCl, pH 7,2).
2. Struktura krystalograficzna białka DraD (PDB ID: 2AXW).
3. Materiały niezbędne dla przeprowadzenia pomiaru kalorymetrycznego: wąż
silikonowy o średnicy wewnętrznej 2 mm, silikonowe zatyczki kapilar kalorymetru –
2 sztuki, smar silikonowy, kolba próżniowa, pompa próżniowa, pipety objętości
roboczej 0,1 – 1 ml, okrągłodenne probówki Eppendorfa o objętości 2 ml.
4. Mikrokalorymetr skaningowy różnicowy N-DSC-III firmy ThermoAnalysis (TA).
Wykonanie eksperymentu
1. Wyjaśnienie budowy, funkcji i obsługi mikrokalorymetru DSC.
2. Wyjaśnienie metodologii wyznaczenia parametrów termodynamicznych procesu
denaturacji białka: ∆Cp, ∆H, ∆S, ∆G z wykorzystaniem programu: NanoAnalyze
Software v.2.2.0 (dostępny darmowo na stronie: www.tainstruments.com).
3. Przedstawienie termogramu dla buforu referencyjnego. Buforem referencyjnym jest
ostatni bufor dializacyjny otrzymany w wyniku preparatyki białka DraD. Bufor
dializacyjny (bufor referencyjny): 20 mM bufor fosforanowy, 100 mM NaCl, pH 7,2.
4. Odgazowanie preparatu białka DraD przez mieszanie z udziałem mieszadła
magnetycznego 15 minut pod próżnią o wielkości 0,9 bara.
5. Opróżnienie celki pomiarowej z buforu referencyjnego. Celka pomiarowa jest
oznaczona literą „S”. W celce referencyjnej „R” pozostaje bufor referencyjny.
6. Naniesienie do celki pomiarowej próby analizowanego białka DraD.
7. Założenie silikonowych zatyczek na wloty kapilar – zabezpieczenie przed
„wypchnięciem” roztworów z kapilar w trakcie podnoszenia ciśnienia w czaszy
kapilar.
8. Zamknięcie czaszy kapilar głowicą ciśnieniową i po ustabilizowaniu termicznym
układu zadanie ciśnienia o wartości 3 atmosfer. Eksperyment denaturacji jest
przeprowadzany pod zwiększonym ciśnieniem w celu zabezpieczenia roztworów
znajdujących się w kapilarach przed wydzielaniem pęcherzyków gazu. Jest to
szczególnie istotne w temperaturach ok. 100°C
9. Rozpoczęcie skanowania w zakresie temperatur od 15°C do 90°C z prędkością
skanowania 2°C/min. Doświadczenie składa się z jednego eksperymentu grzania i
jednego eksperymentu chłodzenia. Przed rozpoczęcie i po zakończeniu skanowania
celki są równoważone w temperaturze początkowej i finalnej przez 10minut.
10. Określenie stężenia białka przez pomiar absorbancji UV, w oparciu o
współczynnik ekstynkcji policzony na podstawie sekwencji aminokwasowej białka.
Opracowanie wyników
Na podstawie uzyskanych termogramów przy wykorzystaniu oprogramowania NanoAnalyze
Software v.2.2.0 (dostępny darmowo na stronie: www.tainstruments.com) określić
następujące parametry procesu denaturacji białka DraD:
Entalpia całkowita procesu denaturacji białka DraD – tzw. ∆Hcal.
Temperatura topnienia białka.
Określić czy proces denaturacji białka DraD jest odwracalny i równowagowy.
Wyznaczenie następujących wartości zmian funkcji termodynamicznych procesu
denaturacji białka DraD w temperaturze 25°C: ∆Cp, ∆H, ∆S, ∆G.
Wyznaczenie funkcji termodynamicznych ∆H, ∆S i ∆G w zakresie temperatur od 0 do
100°C.
Na podstawie danych literaturowych skonfrontować uzyskane wyniki opisujące
stabilność białka DraD z wynikami charakteryzującymi stabilność homologicznego
białka DraE.
Literatura
1. Piątek RJ, Bruździak P, Zalewska-Piątek BM, Wojciechowski MA, Namieśnik JM,Kur JW.
Analysis of the unique structural and physicochemical properties of the DraD/AfaD invasin in
the context of its belonging to the family of chaperone/usher type fimbrial subunits. BMC
Struct Biol. 2011 May 16;11:25.
2. Piątek R, Bruździak P, Wojciechowski M, Zalewska-Piatek B, Kur J. The noncanonical
disulfide bond as the important stabilizing element of the immunoglobulin fold of the Dr
fimbrial DraE subunit. Biochemistry. 2010 Feb
23;49(7):1460-8.
3. Piątek R, Bruździak P, Zalewska-Piatek B, Kur J, Stangret J. Preclusion of irreversible
destruction of Dr adhesin structures by a high activation barrier for the unfolding stage of the
fimbrial DraE subunit. Biochemistry. 2009 Dec 15;48(49):11807-16.