Wyodrębnianie wielopierścieniowych

UNIWERSYTET GDAŃSKI
WYDZIAŁ CHEMII
Pracownia studencka
Katedry Analizy Środowiska
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych
Ćwiczenie nr 4
Wyodrębnianie wielopierścieniowych węglowodorów
aromatycznych (WWA) z gleby
MONITORING ŚRODOWISKA
Gdańsk, 2015
Monitoring środowiska – Ćwiczenie 4
2
1. Wstęp
Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) to obszerna grupa związków chemicznych
o budowie pierścieniowej, charakteryzujących się zbliżonymi własnościami fizykochemicznymi.
Chociaż znanych jest ponad 100 różnych WWA najczęściej w środowisku występuje około
17 związków chemicznych. Struktury i nazewnictwo wybranych WWA,
toksyczność i źródła emisji przedstawiono w teorii do ćwiczeń z monitoringu środowiska.
WWA nie występują w środowisku w postaci pojedynczych związków – zawsze tworzą
mieszaniny wieloskładnikowe. Skład ilościowy i jakościowy tych mieszanin zależy od rodzaju
materiału spalanego oraz warunków, w jakich zachodzi proces spalania i jest dowodem na źródło
emisji.
2. Wydzielanie WWA z próbek gleby
We współczesnej analizie śladowej mamy do czynienia z wykrywaniem substancji na poziomie
ppm i ppb. Aby oznaczyć tak małe ilości substancji chemicznych w skomplikowanej matrycy, jaką
są próbki środowiskowe, niezbędne jest przygotowanie procedury składającej się z kilku etapów:
•
pobieranie próbki,
•
przechowywanie,
•
wstępne przygotowanie obejmujące wyodrębnienie z matrycy, zatężanie czy
przekształcanie analitu w postać bardziej trwałą lub dogodną do końcowego
oznaczania, •analiza właściwa,
•
obróbka danych.
2.1 Chromatografia adsorpcyjna
Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne wydziela się z gleby najczęściej poprzez ekstrakcję
niepolarnym rozpuszczalnikiem organicznym. Proces ten nie jest selektywny. W ekstrakcie, poza
węglowodorami, znajdują się inne grupy związków, poza tym węglowodorów alifatycznych jest
zdecydowanie więcej niż aromatycznych co, w zdecydowanej większości
przypadków,
uniemożliwia wykorzystanie ekstraktu do analizy właściwej.
Skuteczną i często stosowaną na skalę preparatywną metodą rozdzielania mieszanin związków
organicznych jest cieczowa chromatografia adsorpcyjna. Rozdzielenie następuje w wyniku
wielokrotnych, selektywnych procesów adsorpcji zachodzących na aktywnych powierzchniach
sorbentów. Szczególnie cenne usługi oddaje kolumnowa chromatografia adsorpcyjna w przypadku
złożonych mieszanin stosunkowo niewielkich ilości substancji, których rozdzielenie za pomocą
krystalizacji czy destylacji jest praktycznie nieosiągalne, zwłaszcza gdy chodzi o związki
Monitoring środowiska – Ćwiczenie 4
3
wysokowrzące i wrażliwe na działanie temperatury. Z tych samych powodów metodę kolumnowej
chromatografii adsorpcyjnej stosuje się do rozdzielania szczególnie złożonych mieszanin związków
pochodzących ze źródeł naturalnych.
W chromatografii cieczowej występują konkurencyjne oddziaływania między próbką (analit i
matryca) a fazą stacjonarną (adsorbent), między próbką a fazą ruchomą (rozpuszczalnik
wymywający próbkę z adsorbentu) i między fazą ruchomą a stacjonarną. Mechanizm adsorpcyjny
polega na zatrzymywaniu cząsteczek substancji na powierzchni adsorbentu (zwykle porowatego).
W procesie tym biorą udział następujące oddziaływania międzycząsteczkowe:
•
siły wynikające z oddziaływań między cząsteczkami mającymi trwały moment dipolowy
(oddziaływania dipol-dipol),
•
siły wynikające z oddziaływań między cząsteczkami mającymi dipol i cząsteczkami, w których
dipol jest indukowany przez sąsiadujące cząsteczki (oddziaływanie dipol-dipol indukowany),
•
oddziaływania związane z tworzeniem wiązań wodorowych, specjalny rodzaj oddziaływania
dipol-dipol między atomem wodoru a atomem pierwiastka elektroujemnego, np. O, N, F.
Oddziaływania międzycząsteczkowe powodują, że rozdzielane substancje w
niejednakowym stopniu zatrzymują się na adsorbencie. Im większe powinowactwo analitu do fazy
stacjonarnej, tym analit jest silniej przez nią zatrzymywany. Analit z adsorbentu wymywany jest
fazą ruchomą. Im silniej zatrzymywany analit, tym później opuszcza kolumnę (większa retencja
czyli opóźnienie w stosunku do przepływu fazy ruchomej). Objętość fazy ruchomej potrzebna
do jego wymycia nazywa sięobjętością retencji, a czas, w jakim analit zostaje wymyty z kolumny czasem retencji. Objętość retencji i czas retencji analitu określa się precyzyjnie, licząc od momentu
naniesienia na kolumnę do momentu opuszczenia kolumny maksimum jego stężenia.
Na Rys. 1 przedstawiono schemat oddziaływań między cząsteczkami analitów Z i X
a powierzchnią adsorbentu – żelu krzemionkowego. Linią przerywaną oznaczono siły wynikające
z różnego rodzaju oddziaływań występujących w chromatografii adsorpcyjnej i powodujących
retencję. Przedstawiono substancję Z, która silniej oddziałuje z powierzchnią adsorbentu niż
substancja X.
W stanie równowagi, stosunek stężenia Z w fazie stacjonarnej (3 x Z) do stężenia Z w fazie
ruchomej (1 x Z) jest większy {(3 x Z)/(1 x Z) = 3} niż analogiczny stosunek dla X {(3 x X)/(2 x
X)=1,5}. Skoro substancji X jest relatywnie więcej w fazie ruchomej niż substancji Z, pierwsza
opuści kolumnę substancja X ( objętość retencji X, czas retencji X - mniejsze niż objętość retencji
Z, czas retencji Z).
Monitoring środowiska – Ćwiczenie 4
Z
4
X
X
X
Z
X
Z
S
Z
X
H
H
H
H
H
H
H
O
O
O
O
O
O
O
ŻEL KRZEMIONKOWY
Rys. 1. Schemat mechanizmu adsorpcji na żelu krzemionkowym. Strzałką oznaczono przepływ fazy ruchomej
„S”, kwadracikami substancje rozdzielane ”Z” (k=3) i „X” (k=1,5), k=ns/nm, ns -liczba moli substancji
rozdzielanej w fazie stacjonarnej, nm – liczba moli substancji rozdzielanej w fazie ruchomej, k - współczynnik
retencji.
2.2. Adsorbenty
W chromatografii cieczowej używa się adsorbentów porowatych o powierzchniach od setek
do tysiąca m2/g. Adsorbenty dzieli się na polarne i niepolarne. Do niepolarnych należą węgiel
aktywny, węglowodory nasycone, polimery; do polarnych – żel krzemionkowy, krzemian magnezu,
tlenek glinu.
Żel krzemionkowy o ogólnym wzorze SiO2·nH2O jest najczęściej stosowanym adsorbentem. O jego
szerokim zastosowaniu decyduje łatwość otrzymywania przez polikondesację kwasu krzemowego,
jak również możliwość łatwej modyfikacji jego właściwości powierzchniowych, takich jak
struktura geometryczna porów czy modyfikacja chemiczna. Na powierzchni żelu krzemionkowego
występują grupy -OH (silanolowe) o różnych właściwościach, w zależności od wzajemnej
odległości i przestrzennego rozmieszczenia oraz grupy siloksanowe (Rys. 2).
Rys. 2. Grupy silanolowe (aktywne, bliźniacze, swobodne i związane) i siloksanowa, występujące na powierzchni
żelu krzemionkowego.
Grupy silanolowe swobodne oraz aktywne stanowią centra silnie protonodonorowe, grupy
silanolowe bliźniacze są centrami o słabych właściwościach protonodonorowych, a grupy
Monitoring środowiska – Ćwiczenie 4
5
związane, połączone ze sobą wiązaniem wodorowym mają właściwości protonoakceptorowe.
Uważa się, że największą rolę w procesie adsorpcji odgrywają grupy swobodne i aktywne. Udział
poszczególnych form występowania grup wodorotlenowych na powierzchni żelu krzemionkowego
zależy od struktury geometrycznej porów. Żele szerokoporowate zawierają więcej swobodnych
grup -OH, natomiast na powierzchni wąsko porowatych żeli więcej jest aktywnych i związanych
grup -OH.
Aktywność żelu krzemionkowego jak i innych adsorbentów nieorganicznych jest
większa, gdy usunie się z nich zaadsorbowaną wodę. Usuwanie wody przez ogrzewanie
w temperaturze 120150ºC nazywa się aktywacją adsorbentu. Wyższa temperatura, w przypadku
żelu krzemionkowego może powodować usuwanie grup wodorotlenowych z jego powierzchni.
Siła adsorpcji związków organicznych na żelu krzemionkowym jest większa im większa jest ich
polarność i rośnie w szeregu: węglowodory < halogenki alkilowe, arylowe < etery (ROR)<
aldehydy (RCHO)< ketony(R2CO)< estry (RCOOR)< alkohole (ROH) < fenole (ArOH) < zasady
azotowe (np. C5H5N, C6H5NH2)< aminy III-rz. (R3N)< aminy II-rz. i amidy < kwasy karboksylowe.
2.3. Fazy ruchome w chromatografii adsorpcyjnej
Zdolność rozpuszczalnika do wymywania substancji z adsorbentu zależy od jego siły
oddziaływania z powierzchnią adsorbentu i zwana jest mocą elucyjną rozpuszczalnika (eluentu).
Mechanizm tego oddziaływania jest taki sam jak przedstawiony wyżej dla substancji i adsorbentu.
Silniejsza adsorpcja rozpuszczalnika na fazie stacjonarnej zmniejsza adsorpcję analitu.
Rozpuszczalniki klasyfikuje się zgodnie ze wzrastającą zdolnością wymywania zaadsorbowanych
substancji z adsorbentu (czyli zgodnie ze wzrastającą ich mocą elucyjną), zestawiając (porządkując)
je w tzw. szereg eluotropowy. W chromatografii z fazą stacjonarną polarną, np. z żelem
krzemionkowym, o sile elucji decyduje polarność i polaryzowalność eluentu, więc szereg
eluotropowy rozpuszczalników dla tej chromatografii adsorpcyjnej jest jednocześnie szeregiem
o wzrastającej ich polarności. Wybór odpowiedniego rozpuszczalnika do rozdzielenia wybranej
mieszaniny związków nie jest łatwy. Zwykle stosuje sie najpierw rozpuszczalnik o średniej mocy
elucyjnej, następnie dla uzyskania właściwego rozdzielenia zmienia się rozpuszczalnik na taki,
który ma większą lub mniejszą moc elucyjną. Można mieszać dwa lub więcej rozpuszczalników
dla uzyskania odpowiedniej siły elucji i selektywności rozdzielenia.
Szereg eluotropowy rozpuszczalników wg wzrastającej mocy elucyjnej, dla adsorbentów polarnych
przedstawiono w Tab. 1.
Monitoring środowiska – Ćwiczenie 4
L.p.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
6
Rozpuszczalnik
n-Pentan
Eter naftowy
n-Heksan
L.p.
7.
8.
9.
Rozpuszczalnik
Eter dietylowy
Chloroform
Dichlorometan
L.p
13
14
15
Rozpuszczalnik
Acetonitryl
Pirydyna
Etanol
Cykloheksan
Tetrachlorek węgla
Toluen
10.
11.
12.
Tetrahydrofuran
Aceton
Octan etylu
16
17
18
Metanol
Woda (b. duża siła elucji)
Kwas octowy (b. duża siła elucji)
Tab. 1. Rozpuszczalniki uszeregowane zgodnie ze wzrastającą mocą elucyjną w chromatografii adsorpcyjnej na
żelu krzemionkowym.
Rozpuszczalniki stosowane w chromatografii cieczowej oprócz odpowiednich właściwości
chemicznych muszą spełniać kilka wymogów. Powinny być dostępne w handlu, niedrogie, czyste,
bezpieczne w użyciu, mało reaktywne (nie niszczyć próbki, wypełnienia kolumny i przyrządu),
umożliwiać detekcję próbki i posiadać odpowiednią lepkość i lotność. Rozpuszczalniki niżej
wrzące mają tendencję do tworzenia baniek, mogą odparowywać w czasie rozdzielenia i zmieniać
niekontrolowanie skład fazy ruchomej. Rozpuszczalniki wyżej wrzące mają zwykle dużą lepkość
i wymagają stosowania wysokich ciśnień dla uzyskania odpowiedniej szybkości przepływu,
a po rozdziale, przy odparowywaniu eluatu, mogą powodować straty analitu.
2.4. Rozdział metodą kolumnowej chromatografii adsorpcyjnej
W adsorpcyjnej chromatografii kolumnowej analizowane substancje w postaci roztworu są
nanoszone na adsorbent wypełniający kolumnę. Wybór rozpuszczalnika zależy przede wszystkim
od rozpuszczalności substancji chromatografowanych. Związek organiczny jest zawsze silniej
adsorbowany z rozpuszczalnika niepolarnego niż polarnego – natomiast już zaadsorbowany będzie
tym silniej wypierany im bardziej polarny jest dany rozpuszczalnik. Następnie, przemywając złoże
(adsorbent w kolumnie) rozpuszczalnikiem, rozwijamy chromatogram, czyli dzielimy mieszaninę
na grupy związków lub poszczególne związki chemiczne i wymywamy je (eluujemy) z kolumny,
zbierając kolejne frakcje eluatu (rozpuszczalnika z eluującymi się związkami). Wymywanie można
prowadzić jednym rozpuszczalnikiem lub mieszaniną o stałym składzie (Lucja izokratyczna) lub
kilkoma kolejno, albo mieszaniną rozpuszczalników o wzrastającej polarności (elucja
gradientowa). Spływające z kolumny frakcje zbiera się oddzielnie. W ten sposób uzyskuje się
rozdzielenie badanej mieszaniny na składniki nieadsorbowane i adsorbowane coraz silniej przez
adsorbent. Poszczególne frakcje odparowuje się i bada innymi metodami.
Rozdzielając mieszaniny związków organicznych, a szczególnie substancji pochodzenia
naturalnego, mimo wielu wskazówek, jakie można znaleźć w literaturze, zawsze wskazane jest
wykonanie próby na wzorcach oznaczanych substancji a następnie próby z małą ilością materiału.
Poza tym, jak w przypadku innych metod empirycznych, potrzebna jest zawsze pewna doza
Monitoring środowiska – Ćwiczenie 4
7
inwencji eksperymentatora. Niejednokrotnie selektywne rozdzielenie składników mieszaniny udaje
się bardzo dobrze dopiero po uzyskaniu pewnego doświadczenia.
Zasadniczą częścią każdego zestawu do chromatografii kolumnowej jest kolumna ze szkła
obojętnego, której wymiary są dostosowane do skali przeprowadzanego rozdzielenia. Najczęściej
mieszczą one od 10 do 100 g adsorbentu, co wystarcza do adsorpcji od 0,1 do kilku gramów
substancji. Dla przyspieszenia elucji stosuje się słabe ssanie (pompka wodna) lub słabe tłoczenie.
Napełnianie kolumny adsorbentem można przeprowadzać na sucho i na mokro. W metodzie
na sucho adsorbent wsypuje się małymi porcjami do kolumny i ubija pałeczką szklaną. Następnie
przemywa się adsorbent rozpuszczalnikiem, w którym nanosi się badaną mieszaninę. Metoda
na mokro polega na wprowadzaniu do kolumny zawiesiny adsorbentu w rozpuszczalniku użytym
do rozpuszczania substancji.
W obu metodach napełnianie należy wykonać tak, by złoże adsorbentu było jednorodne,
pozbawione pęcherzyków powietrza i tak ułożone, by nie zmieniało objętości w czasie
rozdziału. Powierzchnia adsorbentu powinna być stale pokryta płynem od chwili
wprowadzenia pierwszych porcji rozpuszczalnika do zakończenia procesu. W przeciwnym
razie złoże na kolumnie może łatwo wyschnąć, co uniemożliwia prowadzenie prawidłowej
adsorpcji i może spowodować utlenianie się niektórych substancji. Na Rys. 3 przedstawiono zestaw
do chromatografii kolumnowej z zastosowaniem tłoczenia.
Rys. 3. Zestaw do chromatografii kolumnowej z zastosowaniem tłoczenia.
Monitoring środowiska – Ćwiczenie 4
8
2. 5. Rozdział metodą cienkowarstwowej chromatografii (TLC) adsorpcyjnej
Chromatografia cieczowa, polegająca na rozdziale mieszaniny substancji na fazie stacjonarnej
w postaci płaszczyzny, nazywa się chromatografią planarną. Fazą stacjonarną może być bibuła
(chromatografia bibułowa) lub cienka, równomierna warstwa adsorbentu umieszczona na podłożu
szklanym, metalowym czy z tworzywa sztucznego zwana płytką chromatograficzną(chromatografia
cienkowarstwowa). Po zanurzeniu brzegu bibuły czy płytki chromatograficznej w fazie ruchomej,
następuje przepływ fazy ruchomej wymuszony przez siły kapilarne. Substancje naniesione
na płytkę będą przesuwały się wraz z fazą ruchomą (rozwijanie chromatogramu) lub pozostaną
na miejscu naniesienia, jeśli moc elucyjna zastosowanej fazy ruchomej będzie niewystarczająca.
Prędkość , z jaką substancje będą przesuwały się z fazą ruchomą, zależy od ich wzajemnego
oddziaływania z fazą stacjonarną i fazą ruchomą oraz oddziaływania fazy ruchomej z fazą
stacjonarną. Jeśli różnice w prędkości poruszania się poszczególnych substancji będą
wystarczające, po pewnym czasie każda z substancji znajdzie się w innym miejscu płytki
chromatograficznej – nastąpi rozdział.
Miejsce położenia substancji na płytce chromatograficznej określa współczynnik opóźnienia
oznaczany symbolem Rf, a wyrażający stosunek drogi przebytej przez substancję do drogi
przebytej przez fazę ruchomą.
Współczynnik Rf jest wielkością charakterystyczną dla danej substancji i układu
chromatograficznego: fazy stacjonarnej i fazy ruchomej.
Na Rys.4 przedstawiono komorę chromatograficzną z fazą ruchomą oraz prawidłowy sposób
zanurzania w niej płytki z naniesionymi próbkami. Obok przedstawiono rozwinięty i wywołany
chromatogram próbek x, y i z.
Rys.4. Komora chromatograficzna z zanurzoną płytką i chromatogram TLC próbek x, y i z.
Monitoring środowiska – Ćwiczenie 4
9
Współczynniki Rf dla poszczególnych substancji wynoszą:
•
dla substancji 1: Rf = a/F,
•
dla substancji 2: Rf = b/F,
•
dla substancji 3: Rf = c/F,
•
dla substancji 4: Rf = d/F,
•
dla substancji 5: Rf = e/F.
Dla substancji bezbarwnych istnieje szereg metod wizualizacji ich miejsca położenia na płytce
chromatograficznej (wywoływanie chromatogramu). Metody te zależą od właściwości
chemicznych
i fizycznych badanych substancji. Bardzo często wywoływanie chromatogramu
polega na przeprowadzeniu reakcji barwnych. Inną metodą jest zwęglanie substancji, absorpcja par
jodu czy wizualizacja pod lampą UV. Substancje barwne nie wymagają wywoływania.
Na chromatogramie TLC próbek x, y i z (Rys. 4) należy zauważyć, że:
•
plamy od 1 do 5 odpowiadają prawdopodobnie pojedynczym substancjom 1-5,
•
substancja1 znajduje się w próbce x,
•
substancja2 i 4 znajduje się w próbce z,
•
substancja3 znajduje się w próbce x i z (ta sama wartość Rf),
•
substancja5 znajduje się w próbce x i y (ta sama wartość Rf),
•
pozostałe plamy odpowiadają nierozdzielonym substancjom, identyfikacja nie jest możliwa,
•
plamy na starcie pochodzą od substancji nieoddziaływających z fazą ruchomą, za to silnie
adsorbowanych przez fazę stacjonarną,
•
pojedyncza plama nie musi odpowiadać jednej substancji, dopiero gdy plama jest
pojedyncza
na
chromatogramach
TLC
uzyskanych
w
rożnych
układach
chromatograficznych, możemy założyć, że odpowiada jednej substancji.
Pytania:
O Czy istnieją różnice między WWA a węglowodorami alifatycznymi w powinowactwie
do żelu krzemionkowego (uzasadnij)?
O Do wymycia frakcji WWA z żelu krzemionkowego stosuje się mieszaninę rozpuszczalników
niepolarnych, eteru naftowego i toluenu. Dlaczego?
Monitoring środowiska – Ćwiczenie 4
10
o Co można powiedzieć o polarności związków 1-5 (Rys.4), jeśli fazą stacjonarną jest żel
krzemionkowy a fazą ruchomą mieszanina cykloheksanu i dichlorometanu (10 : 0,5; v:v)?
o Jak będą wyglądały pod lampą UV plamki WWA i węglowodorów alifatycznych?
3. Wykonanie ćwiczenia
3.1. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest przygotowanie próbki glebydo oznaczenia toksycznych zanieczyszczeń,
jakimi są wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA).
Przygotowanie próbki do analizy obejmuje następujące etapy:
- ekstrakcję węglowodorów z gleby,
- wydzielenie z ekstraktu frakcji węglowodorów alifatycznych i frakcji wielopierścieniowych
węglowodorów aromatycznych (WWA) za pomocą adsorpcyjnej chromatografii cieczowej,
- ocenę rozdzielenia za pomocą chromatografii cienkowarstwowej.
3.2. Pobór próbek gleby
Glebę pobrano metalową łopatką i umieszczono w szklanych pojemnikach. Po przyniesieniu
do laboratorium próbki rozłożono cienką warstwą na folii aluminiowej, usuwając duże cząstki
roślinne i kamienie, i pozostawiono do wysuszenia. Tak wysuszona gleba nazywa się glebą
powietrznie suchą.
3.3. Ekstrakcja gleby i przygotowanie ekstraktu do rozdziału
Powietrznie suchą glebę należy rozetrzeć w moździerzu, a następnie odważyć próbkę o masie około
20 g (proszę zanotować dokładną masę próbki). Naważkę gleby umieścić w kolbie stożkowej
o pojemności 100 ml, dodać 50 ml mieszaniny eteru naftowego i dichlorometanu (3:2, v:v). Kolbę
umieścić w łaźni ultradźwiękowej na 15 min. Następnie osad zdekantować, ekstrakt przesączyć
przez bezwodny siarczan sodu umieszczony na sączku z bibuły filtracyjnej do kolbki gruszkowej
o pojemności 200 ml. Do gleby dodać świeżą porcję 25 ml mieszaniny eteru naftowego i
dichlorometanu (3:2, v:v) i ekstrahować w łaźni ultradźwiękowej (przez 10 min), następnie
przesączyć przez ten sam sączek. Ten etap należy wykonać dwukrotnie. Do połączonych
ekstraktów dodać 0,2 ml toluenu i odparować na odparowywaczu obrotowym, w temperaturze łaźni
wodnej nieprzekraczającej 30 ºC, do objętości poniżej 0,5 ml (warstwa „oleju” na ściankach
kolbki). Do ekstraktu dodać 1 ml eteru naftowego. W razie trudności w rozpuszczeniu ekstraktu
Monitoring środowiska – Ćwiczenie 4
11
można lekko podgrzać zawartość kolbki w łaźni wodnej, w ostateczności próbkę można nanieść na
kolumnę w postaci zawiesiny.
3.4. Przygotowanie kolumny do rozdziału
W kolbce stożkowej o pojemności 25 do 50 ml umieścić ok. 4 g żelu krzemionkowego (żelu nie
należy ważyć, proszę czekać na wskazówki prowadzącego), zalać go taką ilością eteru naftowego,
aby słup cieczy nad zawiesiną wynosił ok. 1 cm. Zawartość kolbki mieszać ruchem łagodnym tak,
by usunąć pęcherzyki powietrza z zawiesiny.
W kolumnie chromatograficznej na przegrodzie ze szkła umieścić watę szklaną, a na niej 1 krążek
bibuły filtracyjnej. Następnie przygotować zlewkę na rozpuszczalnik z przemywania kolumny.
Zawiesinę żelu krzemionkowego lekko wymieszać i wlać przez lejek do kolumny, unikając
zbędnego napowietrzania. Wlać tyle zawiesiny, aby złoże adsorbentu po ułożeniu się w kolumnie
miało wysokość ok. 6 cm. Po napełnieniu i ułożeniu adsorbentu w kolumnie na wierzch złoża
nałożyć krążek bibuły, następnie przemyć zawartość kolumny 6 ml eteru naftowego ( lub więcej aż
do osiągnięcia stałej wysokości złoża w kolumnie) i zamknąć wypływ z kolumny.
Należy pamiętać, by warstwa adsorbentu była stale pokryta rozpuszczalnikiem!
3.5. Nanoszenie ekstraktu na kolumnę
Jeśli ekstrakt był podgrzewany, należy go schłodzić do temperatury pokojowej. Wypuścić
z kolumny nadmiar eteru naftowego tak, by wysokość cieczy nad złożem wynosiła 1-2 mm.
Nanieść roztwór analizowany na czoło kolumny, wlewając go powoli pipetą najlepiej po ściance
kolumny tuż nad powierzchnią żelu.
Od momentu naniesienia ekstraktu na kolumnę rozpoczyna się zbieranie frakcji.
Gdy roztwór znajdzie się w złożu a wysokość cieczy nad złożem wyniesie ok. 1-2 mm, wlać
ostrożnie po ściance kolumny 1 ml eteru naftowego i odczekać jak poprzednio (można przyspieszyć
przepływ fazy ruchomej, stosując lekkie nadciśnienie). Czynność tę powtórzyć jeszcze raz,
używając następną, 1 ml porcję eteru naftowego. Gdy składniki ekstraktu są zaadsorbowane na
złożu, można dodać pozostałą objętość eteru naftowego, wynikającą z rozmiarów złoża i warunków
rozdziału podanych poniżej i prowadzić wymywanie frakcji węglowodorów alifatycznych i WWA.
3.6. Warunki rozdzielenia:
•
adsorbent - żel krzemionkowy MN-Kieselgel 60 o wielkości ziarna poniżej 0,08 mm,
•
wymiary złoża adsorbentu - 1 cm x 6 cm,
•
elucja:
I frakcja – 12 ml eteru naftowego, zawiera węglowodory alifatyczne,
Monitoring środowiska – Ćwiczenie 4
12
II frakcja – 25 ml mieszaniny eteru naftowego i toluenu (9:1,v:v), zawiera WWA.
Jeśli wysokość złoża jest inna niż 6 cm, objętości frakcji należy proporcjonalnie zmienić.
3.7. Ocena jakości rozdzielenia za pomocą chromatografii cienkowarstwowej
Jeśli stężenie WWA i węglowodorów alifatycznych w glebie jest zbyt małe, by frakcje nanosić
na płytkę bezpośrednio, można je odpowiednio zatężyć na odparowywaczu obrotowym.
Warunki analizy TLC:
płytki z żelem krzemionkowym 60 na foli aluminiowej (TLC Silicagel 60 firmy Merck),
faza ruchoma – cykloheksan : toluen (67:33,v:v), wizualizacja pod lampą UV.
Wykonanie analizy TLC:
- dopasować rozmiary płytki do komory chromatograficznej,
- narysować delikatnie ołówkiem linię startu w odległości ok. 1 cm od brzegu płytki i zaznaczyć
na niej punkty nanoszenia roztworów (punkty opisać delikatnie ołówkiem),
- nanieść na płytkę po kilka mikrolitrów roztworu wzorców WWA, frakcji WWA i frakcji
węglowodorów alifatycznych, uważając, by plamka nie miała średnicy większej niż 5 mm; im
mniejsza średnica, tym mniejsze rozmycie plamki w czasie rozwijania chromatogramu,
- odparować rozpuszczalnik za pomocą ręcznej suszarki,
- wlać do komory chromatograficznej taką objętość fazy ruchomej, by po wstawieniu płytki, plamki
naniesionych substancji nie dotykały lustra cieczy,
- delikatnie, przy pomocy pincety, wstawić płytkę chromatograficzną z naniesionymi substancjami
do komory chromatograficznej; boki płytki nie mogą dotykać ścian komory,
- komorę zamknąć i rozwijać chromatogram,
- płytkę wyjąć z komory, gdy czoło rozpuszczalnika będzie w odległości mniejszej niż 1 cm
od brzegu,
- zaznaczyć ołówkiem czoło fazy ruchomej i odparować fazę ruchomą,
- przy pomocy pincety umieścić płytkę pod lampą UV i ołówkiem obrysować widoczne plamki,
- wyznaczyć współczynnik Rf, dla wszystkich plamek, wyznaczyć zakres współczynników Rf,
dla frakcji II,
- na podstawie chromatogramu TLC ocenić jakość rozdzielenia WWA i węglowodorów
alifatycznych na kolumnie z żelem krzemionkowym.
Monitoring środowiska – Ćwiczenie 4
13
3.8. Sporządzenie sprawozdania
W sprawozdaniu powinno się znajdować:
•
zwięzły opis technik zastosowanych do izolacji WWA i węglowodorów alifatycznych z
gleby,
•
opis próbki,
•
warunki ekstrakcji,
•
warunki rozdzielania na kolumnie,
•
warunki rozdzielania na płytkach TLC,
•
schemat blokowy, ideowy wykonania oznaczenia,
•
ocena jakości rozdzielenia i dyskusja wyników.
3.9. Zakres wymaganych wiadomości
•
etapy procesu analitycznego,
•
pobieranie próbek do analizy,
•
przygotowanie próbek do analizy,
•
adsorpcyjna chromatografia kolumnowa,
•
chromatografia cienkowarstwowa (TLC),
•
WWA.
4. Odczynniki
•
żel krzemionkowy MN-Kieselgel 60 o wielkości ziarna poniżej 0,08 mm, aktywowany
w temp. 150°C przez 10 godzin,
•
roztwory wzorcowych WWA,
•
eter naftowy destylowany,
•
toluen destylowany,
•
cykloheksan destylowany,
•
dichlorometan destylowany,
•
bezwodny siarczan(VI) sodu cz.d.a.,
•
rozpuszczalniki do mycia.
5. Sprzęt i szkło laboratoryjne
•
kolumna szklana z kranikiem,
•
przedłużacz do kolumny,
Monitoring środowiska – Ćwiczenie 4
14
•
kolba stożkowa o poj. 50 ml 2 szt,
•
kolba stożkowa o poj. 100 ml 1 szt,
•
cylindry miarowe o poj. 10 ml - 1 szt., 25 ml - 1 szt., 50 ml - 1 szt,
•
pipeta z tłoczkiem lub strzykawka szklana o poj. 2 ml - 2 szt,
•
lejek szklany - 2 szt,
•
kolbki okrągłodenne lub gruszkowe poj. 50 ml - 3 szt,
•
kolbki gruszkowe poj. 100 ml - 1 szt,
•
zestaw do tłoczenia przez kolumnę - 1 szt,
•
łyżka metalowa - 2 szt,
•
moździerz porcelanowy - 1 szt,
•
sączki z bibuły filtracyjnej,
•
naczynie szklane na próbkę gleby,
•
komora chromatograficzna – 2 szt.,
•
płytki TLC,
•
strzykawka o poj. 10 µl z płasko zakończoną igłą,
•
pinceta,
•
odparowywacz obrotowy,
•
lampa UV,
•
ołówek, linijka,
•
suszarka ręczna,
•
rękawice ochronne, lateksowe.
Literatura
1. Szczepaniak W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej. W-wa, PWN, 1996.
2. Kocjan R. Chemia analityczna, podręcznik dla studentów, W-wa, PZWL, 2000, tom 2.
3. Staszewski R. Kontrola chemicznych zanieczyszczeń środowiska, Podstawy teoretyczne
z ćwiczeniami laboratoryjnymi, Politechnika Gdańska, Gdańsk,1990.
4. Jerzmanowska, Z., Preparatyka organicznych związków chemicznych, PZWL,W-wa,1972.
5. Namieśnik J. Metody instrumentalne w kontroli zanieczyszczeń środowiska. J., Politechnika
Gdańska, Gdańsk,1992.