Izolacja WWA z gleby

UNIWERSYTET GDAOSKI
WYDZIAŁ CHEMII
Pracownia studencka
Zakładu Analizy Środowiska
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych
Ćwiczenie nr 1
IZOLACJA WIELOPIERŚCIENIOWYCH
WĘGLOWODORÓW AROMATYCZNYCH
(WWA) Z GLEBY
CHROMATOGRAFIA
Gdańsk, 2013
1. Wstęp
Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) to obszerna grupa związków chemicznych
o budowie pierścieniowej, charakteryzujących się zbliżonymi własnościami fizykochemicznymi.
Chociaż znanych jest ponad 100 różnych WWA najczęściej w środowisku występuje około
17 związków chemicznych.
WWA nie występują w środowisku w postaci pojedynczych związków – zawsze tworzą mieszaniny
wieloskładnikowe. Skład ilościowy i jakościowy tych mieszanin zależy od rodzaju materiału
spalanego oraz warunków, w jakich zachodzi proces spalania i jest dowodem na źródło emisji.
Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne należą do grupy najpowszechniej występujących,
trwałych zanieczyszczeń organicznych. Głównymi źródłami WWA są: produkty niepełnego
spalania paliw kopalnych, lotne pyły i popioły powstające ze spalania paliw lub utylizacji odpadów
oraz przemysł ciężki związany z przetwarzaniem węgla i ropy naftowej (koksownie, rafinerie, huty
żelaza, aluminium i miedzi, produkcja i wykorzystanie smoły i kreozotu). Szacuje się,
iż szczególnie w okresie zimowym, poważnym źródłem WWA w środowisku jest tzw. niska emisja,
pochodząca z indywidualnych źródeł ciepła. Jednak najpoważniejszy udział w emisji WWA
na terenach zurbanizowanych ma transport samochodowy.
Wśród źródeł naturalnych wymienia się pożary lasów i wybuchy wulkanów oraz procesy przemiany
materii bakterii, glonów i roślin wyższych. Biosynteza WWA prowadzi do tworzenia tych
najbardziej groźnych dla zdrowia człowieka ale w aspekcie ogólnego skażenia, ilości WWA
pochodzące ze źródeł naturalnych i stanowiące "naturalne tło" są niewielkie w porównaniu
z ilościami będącymi wynikiem działalności człowieka. WWA pochodzące ze źródeł
antropogenicznych nie występują w środowisku w postaci pojedynczych związków – zawsze
tworzą mieszaniny wieloskładnikowe. Skład ilościowy i jakościowy tych mieszanin zależy
od rodzaju materiału spalanego oraz warunków, w jakich zachodzi proces spalania.
Najistotniejszym ze zdrowotnego punktu widzenia skutkiem oddziaływania WWA na organizm jest
zdolność niektórych z nich do wywoływania zmian nowotworowych. Z tego względu WWA
podzielono na nieaktywne, mniej aktywne i bardzo aktywne. Liczne badania dostarczyły
dostatecznej ilości danych, by WWA o ilości pierścieni powyżej 3 uznać za rakotwórcze
i
mutagenne.
Do
tych
związków
należą
m.in.:
benzo(a)piren,
dibenzo(a,h)antracen,
benzo(a)antracen, benzo(b)fluoranten, czy dibenzo(a,e)piren (Rysunek 1). WWA są metabolizowane
przez mikrosomalne enzymy cytochromu P 450 do związków mogących tworzyć trwałe połączenia
z DNA (np. epoksydy), co w konsekwencji może prowadzić do wysoce prawdopodobnego procesu
nowotworzenia. W celu systematycznej oceny toksyczności wszystkich rakotwórczych WWA,
wprowadzono tzw. względny współczynnik rakotwórczości (k), odnoszący się do rakotwórczości
benzo(a)pirenu (BaP), dla którego przyjęto wartość równą 1.
Obecnie jako miarę narażenia na wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne przyjmuje się
wskaźnik będący sumą iloczynów stężeń 9 WWA i ich względnych współczynników
rakotwórczości. WWA emitowane z różnych źródeł ulegają stopniowej dystrybucji w środowisku,
gdzie ostatecznie deponowane są w glebach (90%) oraz, ze względu na bardzo słabą
rozpuszczalność w wodzie, w osadach dennych (9%). Oprócz mokrej i suchej depozycji WWA,
związki te trafiają do gleby razem z wodami spływnymi. Wody spływne wymywają
np. nawierzchnię dróg, na których znajdują się duże ilości WWA pochodzące: ze spalin
samochodowych, ze ścierania opon gumowych przy hamowaniu i z samego asfaltu bogatego
we frakcje węglowodorów aromatycznych. Dodatkowym źródłem są także niekontrolowane zrzuty
ścieków przemysłowych i bytowo-gospodarczych, a także odcieki ze składowisk odpadów.
Przykładowe struktury WWA przedstawia Rysunek 1.
Dibenzo(a,h)antracen
Benzo(a)piren
Benzo(a)antracen
Perylen
Benzo(b)fluoranten
Piren
Rysunek 1. Przykładowe struktury WWA
Chryzen
Antracen
Naftalen
2. Wydzielanie WWA z próbek gleby
We współczesnej analizie śladowej mamy do czynienia z wykrywaniem substancji na poziomie ppm
i ppb. Aby oznaczyć tak małe ilości substancji chemicznych w skomplikowanej matrycy, jaką są próbki
środowiskowe, niezbędne jest przygotowanie procedury składającej się z kilku etapów:

pobieranie próbki,

przechowywanie,

wstępne przygotowanie obejmujące wyodrębnienie z matrycy, zatężanie czy
przekształcanie analitu w postać bardziej trwałą lub dogodną dla końcowego
oznaczania,

analiza właściwa,

obróbka danych.
2.1. Chromatografia
Chromatografia to technika analityczna lub preparatywna służąca do rozdzielania, identyfikacji
i oznaczania substancji, czyli badania składu mieszanin związków chemicznych. Podstawy techniki
chromatograficznej powstały na początku XX wieku w Warszawie w wyniku badań rosyjskiego
chemika i biologa Michaiła Cwieta. Zajmował się on badaniem barwników roślinnych. Podczas
przepuszczania roztworu zielonych barwników roślinnych przez kolumnę (rurkę szklaną)
wypełnioną kredą (węglan wapnia),
Cwiet uzyskał rozdział barwników
w postaci szeregu
poziomych barwnych pasm o barwie zielonej i żółtej. Ponieważ Cwiet rozpoznał i prawidłowo
zinterpretował proces rozdziału, jest on powszechnie uważany za wynalazcę tej techniki. Terminu
chromatografia użył dla określenia barwnych stref obserwowanych na kolumnie kredowej podczas
rozdziałów (gr. chromatos = barwa + grapho = pisze).
Układ chromatograficzny składa się z trzech zasadniczych elementów:

fazy stacjonarnej – nieruchoma warstwa substancji o rozwiniętej powierzchni,

fazy ruchomej zwanej eluentem – przepływający przez fazę stacjonarną strumień
rozpuszczalników lub gazu,

substancji rozdzielanej.
Podstawą rozdziału chromatograficznego, niezależnie od techniki chromatograficznej jest proces
podziału składników rozdzielanej mieszaniny, pomiędzy dwie nie mieszające się ze sobą fazy:
stacjonarną i ruchomą. Rozdział substancji następuje w wyniku przepuszczenia roztworu badanej
mieszaniny przez specjalnie spreparowaną fazę rozdzielczą (złoże), zwaną też fazą stacjonarną.
Fazą rozdzielczą są substancje wykazujące właściwości sorpcyjne w stosunku do substancji
przepływających. Jednocześnie podczas przepływu fazy ruchomej – eluentu, przez fazę rozdzielczą
następuje proces wymywania zaadsorbowanych (lub związanych) składników badanej substancji
(rozdzielanej). Intensywność tego procesu jest różna dla poszczególnych składników mieszaniny.
Jedne składniki są więc zatrzymywane w fazie dłużej, a inne krócej, dzięki czemu może następować
ich rozdział. Czas przebywania danego składnika w kolumnie określany jest mianem czasu retencji
Tr i jest podstawowym parametrem umożliwiającym identyfikację (analizę jakościową).
2.2. Chromatografia adsorpcyjna
Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne wydziela się z gleby najczęściej poprzez ekstrakcję
niepolarnym rozpuszczalnikiem organicznym. Proces ten nie jest selektywny. W ekstrakcie, poza
węglowodorami, znajdują się inne grupy związków, poza tym węglowodorów alifatycznych jest
zdecydowanie więcej niż aromatycznych, co w zdecydowanej większości przypadków,
uniemożliwia wykorzystanie ekstraktu do analizy właściwej.
Skuteczną i często stosowaną na skalę preparatywną metodą rozdzielania mieszanin związków
organicznych jest cieczowa chromatografia adsorpcyjna. Rozdział następuje w wyniku
wielokrotnych, selektywnych procesów adsorpcji zachodzących na aktywnych powierzchniach
sorbentów. Szczególnie cenne usługi oddaje kolumnowa chromatografia adsorpcyjna w przypadku
złożonych mieszanin stosunkowo niewielkich ilości substancji, których rozdzielenie za pomocą
krystalizacji czy destylacji jest praktycznie nieosiągalne, zwłaszcza gdy chodzi o związki
wysokowrzące i wrażliwe na działanie temperatury. Z tych samych powodów metodę kolumnowej
chromatografii adsorpcyjna stosuje się do rozdzielania szczególnie złożonych mieszanin związków
pochodzących ze źródeł naturalnych.
W chromatografii cieczowej występują konkurencyjne oddziaływania między próbką (analit
i matryca) a fazą stacjonarną (adsorbent), między próbką a fazą ruchomą (rozpuszczalnik
wymywający próbkę z adsorbentu) i między fazą ruchomą a stacjonarną. Mechanizm adsorpcyjny
polega na zatrzymywaniu cząsteczek substancji na powierzchni adsorbentu (zwykle porowatego).
W procesie tym biorą udział następujące oddziaływania międzycząsteczkowe:

siły wynikające z oddziaływań między cząsteczkami mającymi trwały moment dipolowy
(oddziaływania dipol-dipol),

siły wynikające z oddziaływań między cząsteczkami mającymi dipol i cząsteczkami,
w których dipol jest indukowany przez sąsiadujące cząsteczki (oddziaływanie dipol-dipol
indukowany),

oddziaływania związane z tworzeniem wiązań wodorowych, specjalny rodzaj oddziaływania
dipol-dipol między wodorem a atomem elektroujemnym, np. O, N, F.
Oddziaływania międzycząsteczkowe powodują, że rozdzielane substancje w niejednakowym
stopniu zatrzymują się na adsorbencie. Im większe powinowactwo analitu do fazy stacjonarnej tym
analit jest silniej przez nią zatrzymywany. Analit z adsorbentu wymywany jest fazą ruchomą. Im
silniej zatrzymywany analit, tym później opuszcza kolumnę (większa retencja czyli opóźnienie w
stosunku do przepływu fazy ruchomej). Objętość fazy ruchomej potrzebna do jego wymycia
nazywa się objętością retencji, a czas, w jakim analit zostaje wymyty z kolumny - czasem
retencji. Objętość retencji i czas retencji określa się precyzyjnie, licząc od momentu naniesienia na
kolumnę do momentu opuszczenia kolumny (maksimum stężenia analitu) przez analit o najwyższej
wartości stężenia.
Na Rysunku 2 przedstawiono schemat oddziaływań między cząsteczkami analitów Z i X, a powierzchnią
adsorbentu – żelu krzemionkowego. Linią przerywaną oznaczono siły wynikające z różnego rodzaju
oddziaływań występujących w chromatografii adsorpcyjnej i powodujących retencję. Przedstawiona
substancja Z silniej oddziałuje z powierzchnią adsorbentu niż substancja X.
W stanie równowagi, stosunek stężenia Z w fazie stacjonarnej (3 x Z) do stężenia Z w fazie ruchomej
(1 x Z) jest większy {(3 x Z)/(1 x Z) = 3} niż analogiczny stosunek dla X
{(3 x X)/(2 x X)=1,5}. Skoro substancji X jest relatywnie więcej w fazie ruchomej niż substancji Z,
pierwsza opuści kolumnę substancja X (objętość retencji X, czas retencji X mniejsze niż objętość
retencji Z, czas retencji Z).
Z
X
X
X
Z
X
Z
S
Z
X
H
H
H
H
H
H
H
O
O
O
O
O
O
O
ŻEL KRZEMIONKOWY
Rysunek 2. Schemat mechanizmu adsorpcji na żelu krzemionkowym. Strzałką oznaczono przepływ fazy
ruchomej „S”, kwadracikami substancje rozdzielane ”Z” (k=3) i „X” (k=1,5), k=ns/nm, ns -liczba moli substancji
rozdzielanej w fazie stacjonarnej, nm – liczba moli substancji rozdzielanej w fazie ruchomej, k - współczynnik
retencji
2.3. Adsorbenty
W chromatografii cieczowej używa się adsorbentów porowatych o powierzchniach od setek
do tysiąca m2/g. Adsorbenty dzieli się na polarne i niepolarne:
 niepolarne – węgiel aktywny, węglowodory nasycone, polimery;
 polarne – żel krzemionkowy, krzemian magnezu, tlenek glinu.
Żel krzemionkowy o ogólnym wzorze SiO2
.
nH2O jest najczęściej stosowanym adsorbentem.
O jego szerokim zastosowaniu decyduje łatwość otrzymywania przez polikondensację kwasu
krzemowego, jak również możliwość łatwej modyfikacji jego właściwości powierzchniowych,
takich jak struktura geometryczna porów czy modyfikacja chemiczna. Na powierzchni żelu
krzemionkowego występują grupy -OH (silanolowe) o różnych właściwościach, w zależności od
wzajemnej odległości i przestrzennego rozmieszczenia oraz grupy siloksanowe (Rysunek 3).
(a)
(b)
Rysunek 3. Grupy silanolowe aktywne, bliźniacze, swobodne i związane (a) i siloksanowa (b), występujące
na powierzchni żelu krzemionkowego
Grupy silanolowe swobodne oraz aktywne stanowią centra silnie protonodonorowe, grupy
silanolowe bliźniacze są centrami o słabych właściwościach protonodonorowych, a grupy związane,
połączone ze sobą wiązaniem wodorowym mają właściwości protonoakceptorowe. Uważa się,
że największą rolę w procesie adsorpcji odgrywają grupy swobodne i aktywne. Udział
poszczególnych form występowania grup wodorotlenowych na powierzchni żelu krzemionkowego
zależy od struktury geometrycznej porów. Żele szerokoporowate zawierają więcej swobodnych
grup -OH, natomiast na powierzchni wąskoporowatych żeli więcej jest aktywnych i związanych
grup -OH.
Aktywność żelu krzemionkowego jak i innych adsorbentów nieorganicznych zwiększa się przez
ogrzewanie w temperaturze 120-150ºC, aby częściowo usunąć zaadsorbowaną wodę. Wyższa
temperatura
w
przypadku
żelu
krzemionkowego
może
powodować
usuwanie
grup
wodorotlenowych z jego powierzchni.
Siła adsorpcji związków organicznych na żelu krzemionkowym jest większa im większa jest ich
polarność i rośnie w szeregu:
węglowodory < halogenki alkilowe, arylowe < etery (ROR) < aldehydy (RCHO) < ketony (R2CO)
< estry (RCOOR) < alkohole (ROH) < fenole (ArOH) < zasady azotowe (np. C5H5N, C6H5NH2)
< aminy III-rz. (R3N) < aminy II-rz. i amidy < kwasy karboksylowe.
2.4. Fazy ruchome w chromatografii adsorpcyjnej
Zdolność rozpuszczalnika do wymywania substancji z adsorbentu zależy od jego siły
oddziaływania z powierzchnią adsorbentu i zwana jest mocą elucyjną rozpuszczalnika (eluentu).
Mechanizm tego oddziaływania jest taki sam jak przedstawiony wyżej dla substancji i adsorbentu.
Silniejsza adsorpcja rozpuszczalnika na fazie stacjonarnej zmniejsza adsorpcję analitu.
Rozpuszczalniki klasyfikuje się zgodnie ze wzrastającą zdolnością wymywania zaadsorbowanych
substancji z adsorbentu (czyli zgodnie ze wzrastającą ich mocą elucyjną) zestawiając je w tzw.
szereg eluotropowy. W chromatografii z fazą stacjonarną polarną (np. z żelem krzemionkowym)
o sile elucji decyduje polarność i polaryzowalność eluentu, więc szereg eluotropowy
rozpuszczalników dla tej chromatografii adsorpcyjnej jest jednocześnie szeregiem o wzrastającej
ich polarności.
Wybór odpowiedniego rozpuszczalnika do rozdziału wybranej mieszaniny związków nie jest łatwy.
Zwykle stosuje się najpierw rozpuszczalnik o średniej mocy elucyjnej, następnie dla uzyskania
właściwego rozdziału zmienia się rozpuszczalnik na taki, który ma większą lub mniejszą moc
elucyjną. Można mieszać dwa lub więcej rozpuszczalników dla uzyskania odpowiedniej siły elucji i
selektywności rozdziału.
Szereg eluotropowy rozpuszczalników wg wzrastającej mocy elucyjnej, dla adsorbentów polarnych
przedstawiono w Tabeli 1.
Tabela 1. Rozpuszczalniki uszeregowane zgodnie ze wzrastającą mocą elucyjną w chromatografii adsorpcyjnej
na żelu krzemionkowym
L.p.
Rozpuszczalnik
L.p.
Rozpuszczalnik
L.p.
Rozpuszczalnik
1.
n-Pentan
7.
Eter dietylowy
13.
Acetonitryl
2.
Eter naftowy
8.
Chloroform
14.
Pirydyna
3.
n-Heksan
9.
Dichlorometan
15.
Etanol
4.
Cykloheksan
10.
Tetrahydrofuran
16.
Metanol
5.
Tetrachlorek węgla
11.
Aceton
17.
Woda (b. duża siła elucji)
6.
Toluen
12.
Octan etylu
18.
Kwas octowy (b. duża siła elucji)
Rozpuszczalniki stosowane w chromatografii cieczowej oprócz odpowiednich właściwości
chemicznych muszą spełniać kilka wymogów: powinny być dostępne w handlu, niedrogie, czyste,
bezpieczne w użyciu, mało reaktywne (nie niszczyć próbki, wypełnienia kolumny i przyrządu),
umożliwiać detekcję próbki i być o odpowiedniej lepkości i lotności.
Rozpuszczalniki niżej wrzące mają tendencję do tworzenia baniek, mogą odparowywać w czasie
rozdziału i zmieniać niekontrolowanie skład fazy ruchomej.
Rozpuszczalniki wyżej wrzące mają zwykle dużą lepkość i wymagają stosowania wysokich ciśnień
dla uzyskania odpowiedniej szybkości przepływu, a po rozdziale, przy odparowywaniu eluatu,
mogą powodować straty analitu.
2.5. Rozdział metodą kolumnowej chromatografii adsorpcyjnej
W adsorpcyjnej chromatografii kolumnowej analizowane substancje w postaci roztworu nanosimy
na adsorbent wypełniający kolumnę. Wybór rozpuszczalnika zależy przede wszystkim
od rozpuszczalności substancji chromatografowanych. Związek organiczny jest zawsze silniej
adsorbowany z rozpuszczalnika niepolarnego niż polarnego. Natomiast już zaadsorbowany będzie
tym silniej wypierany im bardziej polarny jest dany rozpuszczalnik. Następnie przemywając złoże
(adsorbent w kolumnie) rozpuszczalnikiem rozwijamy chromatogram, czyli dzielimy mieszaninę
na grupy związków lub poszczególne związki chemiczne i wymywamy je (eluujemy) z kolumny
zbierając kolejne frakcje eluatu (rozpuszczalnika z eluującymi się związkami). Wymywanie można
prowadzić jednym rozpuszczalnikiem (elucja izokratyczna) lub kilkoma kolejno, albo mieszaniną
rozpuszczalników o wzrastającej polarności (elucja gradientowa). Spływające z kolumny frakcje
zbiera się oddzielnie. W ten sposób uzyskuje się rozdział badanej mieszaniny na składniki
nieadsorbowane i adsorbowane coraz silniej przez adsorbent. Poszczególne frakcje odparowuje
się i bada innymi metodami.
Rozdzielając mieszaniny związków organicznych, a szczególnie substancji pochodzenia
naturalnego, mimo wielu wskazówek, jakie można znaleźć w literaturze, zawsze wskazane jest
wykonanie próby na wzorcach oznaczanych substancji, a następnie próby z małą ilością materiału.
Poza tym, jak w przypadku innych metod empirycznych, potrzebna jest zawsze pewna doza
inwencji eksperymentatora. Niejednokrotnie selektywny rozdział składników mieszaniny udaje się
bardzo dobrze dopiero po uzyskaniu pewnego doświadczenia.
Zasadniczą częścią każdego zestawu do chromatografii kolumnowej jest kolumna ze szkła
obojętnego, której wymiary są dostosowane do skali przeprowadzanego rozdziału. Najczęściej
mieszczą one od 10 do 100 g adsorbentu, co wystarcza do adsorpcji od 0,1 do kilku gramów
substancji. Dla przyspieszenia elucji stosuje się słabe ssanie (pompka wodna) lub słabe tłoczenie.
Napełnianie kolumny adsorbentem można przeprowadzać na sucho i na mokro. W metodzie
na sucho adsorbent wsypuje się małymi porcjami do kolumny i ubija bagietką szklaną. Następnie
przemywa się adsorbent rozpuszczalnikiem, w którym nanosi się badaną mieszaninę. Metoda
na mokro polega na wprowadzaniu do kolumny zawiesiny adsorbentu w rozpuszczalniku użytym
do rozpuszczania substancji.
W obu metodach napełnianie należy wykonać tak, by złoże adsorbentu było jednorodne,
pozbawione pęcherzyków powietrza i tak ułożone, by nie zmieniało objętości w czasie
rozdziału. Powierzchnia adsorbentu powinna być stale pokryta płynem od chwili nalania
pierwszych porcji rozpuszczalnika do zakończenia procesu.
W przeciwnym razie złoże na kolumnie może łatwo wyschnąć, co uniemożliwi prowadzenie
prawidłowej adsorpcji i może spowodować utlenianie się niektórych substancji. Na Rysunku 4
przedstawiono zestaw do chromatografii kolumnowej z zastosowaniem tłoczenia.
Rysunek 4. Zestaw do chromatografii kolumnowej z zastosowaniem tłoczenia
2.6. Cienkowarstwowa chromatografia adsorpcyjna (TLC)
Chromatografia cieczowa, polegająca na rozdziale mieszaniny substancji na fazie stacjonarnej
w postaci płaszczyzny, nazywa się chromatografią planarną. Fazą stacjonarną może być bibuła
(chromatografia bibułowa) lub cienka, równomierna warstwa adsorbentu umieszczona na podłożu
szklanym,
metalowym
czy
z
tworzywa
sztucznego
zwana
płytką
chromatograficzną
(chromatografia cienkowarstwowa). Po zanurzeniu brzegu bibuły czy płytki chromatograficznej
w fazie ruchomej, następuje przepływ fazy ruchomej wymuszony przez siły kapilarne. Substancje
naniesione na płytkę będą przesuwały się wraz z fazą ruchomą (rozwijanie chromatogramu)
lub pozostaną na miejscu naniesienia, jeśli moc elucyjna zastosowanej fazy ruchomej będzie
niewystarczająca. Prędkość, z jaką substancje będą przesuwały się z fazą ruchomą, zależy
od ich wzajemnego oddziaływania z fazą stacjonarną i fazą ruchomą oraz oddziaływania fazy
ruchomej z fazą stacjonarną. Jeśli różnice w prędkości poruszania się poszczególnych substancji
będą wystarczające, po pewnym czasie każda z substancji znajdzie się w innym miejscu płytki
chromatograficznej – nastąpi rozdział.
Miejsce położenia substancji na płytce chromatograficznej określa współczynnik opóźnienia
oznaczany symbolem Rf, a wyrażający stosunek drogi przebytej przez substancję do drogi przebytej
przez fazę ruchomą. Współczynnik Rf jest wielkością charakterystyczną dla danej substancji
i układu chromatograficznego: fazy stacjonarnej i fazy ruchomej. Na Rysunku 5 przedstawiono
komorę chromatograficzną z fazą ruchomą oraz prawidłowy sposób zanurzania w niej płytki
z naniesionymi próbkami. Obok przedstawiono rozwinięty i wywołany chromatogram próbek
x, y oraz z.
Rysunek 5. Komora chromatograficzna z zanurzoną płytką i chromatogram TLC uzyskany dla próbek x, y oraz
z (interpretacja poniżej)
Współczynniki Rf dla poszczególnych substancji wynoszą:

dla substancji 1: Rf = a/F,

dla substancji 2: Rf = b/F,

dla substancji 3: Rf = c/F,

dla substancji 4: Rf = d/F,

dla substancji 5: Rf = e/F.
Dla substancji bezbarwnych istnieje szereg metod wizualizacji ich miejsca położenia na płytce
chromatograficznej (wywoływanie chromatogramu). Metody te zależą od właściwości chemicznych
i fizycznych badanych substancji. Bardzo często wywoływanie chromatogramu polega na
przeprowadzeniu reakcji barwnych. Inną metodą jest zwęglanie substancji, absorpcja par jodu czy
wizualizacja pod lampą UV. Substancje barwne nie wymagają wywoływania. Na chromatogramie
TLC próbek x, y oraz z (Rysunek 5) należy zauważyć, że:

plamy od 1 do 5 odpowiadają prawdopodobnie pojedynczym substancjom 1-5,

substancja 1 znajduje się w próbce x,

substancja 2 i 4 znajduje się w próbce z,

substancja 3 znajduje się w próbce x i z (ta sama wartość Rf),

substancja 5 znajduje się w próbce x i y (ta sama wartość Rf),

pozostałe plamy odpowiadają nierozdzielonym substancjom, identyfikacja nie jest możliwa,

plamy na starcie pochodzą od substancji nieoddziaływających z fazą ruchomą, za to silnie
adsorbowanych przez fazę stacjonarną,

pojedyncza plama nie musi odpowiadać jednej substancji, dopiero gdy plama jest
pojedyncza
na
chromatogramach
TLC
uzyskanych
w
rożnych
chromatograficznych, możemy założyć, że odpowiada jednej substancji.
układach
3. Wykonanie ćwiczenia
3.1. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest ekstrakcja wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA)
w próbkach gleby.
Przygotowanie próbki do analizy obejmuje:

ekstrakcję węglowodorów z gleby,

wydzielenie z ekstraktu frakcji węglowodorów alifatycznych i frakcji wielopierścieniowych
węglowodorów aromatycznych (WWA) za pomocą adsorpcyjnej chromatografii cieczowej,

ocenę rozdziału za pomocą chromatografii cienkowarstwowej.
3.2. Pobór próbek gleby
Próby gleby (głębokość 0-5 cm) pobrano w punktach P-1 do P-6, zaznaczonych na planie podanym
poniżej
Glebę pobrano metalową łopatką i umieszczono w szklanych pojemnikach. Po przyniesieniu
do laboratorium próbki rozłożono cienką warstwą na folii aluminiowej, usuwając duże cząstki
roślinne i kamienie, i pozostawiono do wysuszenia. Tak wysuszona gleba nazywa się glebą
powietrznie suchą. Studenci otrzymują do analizy próbkę gleby pobraną w jednym, z pokazanych
na rysunku, punktów.
3.3. Ekstrakcja gleby i przygotowanie ekstraktu do rozdziału
Powietrznie suchą glebę rozetrzeć w moździerzu. Odważyć próbkę o masie od 10 do 30 g,
w zależności od miejsca poboru. Minimalna masa gleby powietrznie suchej dla P–1 i P–4 wynosi
30 g, dla P-3 i P–5–20 g, a dla P-2 i P–6 - 10 g. Naważkę gleby umieścić w kolbie stożkowej
o pojemności 100 ml, dodać 50 ml mieszaniny eteru naftowego i dichlorometanu (3:2, v:v). Kolbę
umieścić w łaźni ultradźwiękowej na 15 min. Następnie osad zdekantować, ekstrakt przesączyć
przez bezwodny siarczan sodu umieszczony na sączku z bibuły filtracyjnej do kolbki gruszkowej
o pojemności 100 ml. Do gleby dodać świeżą porcję 25 ml mieszaniny eteru naftowego
i dichlorometanu i ekstrahować w łaźni ultradźwiękowej 10 min, następnie przesączyć przez ten
sam sączek. Do połączonych ekstraktów dodać 0,2 ml toluenu i odparować na wyparce obrotowej,
przy temperaturze łaźni wodnej nie przekraczającej 30ºC, do objętości poniżej 0,5 ml (warstwa
„oleju” na ściankach kolbki). Do ekstraktu dodać 1 ml eteru naftowego. W razie trudności
w rozpuszczeniu ekstraktu można dodać 1-2 krople toluenu i lekko podgrzać zawartość kolbki
w łaźni wodnej, w ostateczności próbkę można nanieść na kolumnę w postaci zawiesiny.
3.4. Przygotowanie kolumny do rozdziału
W kolbce stożkowej o pojemności 25 do 50 ml umieścić 4 do 6 g żelu krzemionkowego (żelu nie
należy ważyć, proszę czekać na wskazówki prowadzącego), zalać go taką ilością eteru naftowego,
aby słup cieczy nad zawiesiną wynosił ok. 1 cm. Zawartość kolbki mieszać ruchem łagodnym, tak
by usunąć pęcherzyki powietrza z zawiesiny.
W kolumnie chromatograficznej umieścić na przegrodzie ze szkła 1 krążek bibuły filtracyjnej.
Następnie przygotować naczynie na rozpuszczalnik z przemywania kolumny. Zawiesinę żelu
krzemionkowego lekko wymieszać i wlać przez lejek do kolumny unikając zbędnego
napowietrzania. Wlać tyle zawiesiny, aby złoże adsorbentu po ułożeniu się w kolumnie miało
wysokość 6 do 8 cm. Po napełnieniu i ułożeniu adsorbentu w kolumnie na wierzch złoża nałożyć
krążek bibuły, następnie przemyć zawartość kolumny 6 ml eteru naftowego (lub więcej
aż do osiągnięcia stałej wysokości złoża w kolumnie) i zamknąć wypływ z kolumny. Należy
pamiętać, by warstwa adsorbentu była stale pokryta rozpuszczalnikiem!
3.5. Nanoszenie ekstraktu na kolumnę
Jeśli ekstrakt był podgrzewany należy go schłodzić do temperatury pokojowej. Wypuścić
z kolumny nadmiar eteru naftowego, tak by wysokość cieczy nad złożem wynosiła 1-2 mm.
Nanieść roztwór analizowany na czoło kolumny, wlewając go powoli pipetą lub strzykawką
najlepiej po ściance kolumny tuż nad powierzchnią żelu.
Od momentu naniesienia ekstraktu na kolumnę rozpoczyna się zbieranie frakcji.
Gdy roztwór znajdzie się w złożu a wysokość cieczy nad złożem wyniesie ok. 1-2 mm, wlać
ostrożnie po ściance kolumny 1 ml eteru naftowego i odczekać jak poprzednio (można przyspieszyć
przepływ fazy ruchomej stosując lekkie nadciśnienie). Czynność tę powtórzyć jeszcze raz,
używając następną, 1 ml porcję eteru naftowego. Gdy składniki ekstraktu są zaadsorbowane
na złożu, można dodać pozostałą objętość eteru naftowego, wynikającą z rozmiarów złoża
i warunków rozdziału podanych poniżej i prowadzić wymywanie frakcji węglowodorów
alifatycznych i WWA.
3.6. Warunki rozdziału

Adsorbent - żel krzemionkowy MN-Kieselgel 60 o wielkości ziarna poniżej 0,08 mm

Wymiary złoża adsorbentu - 1 cm x 6 cm;

Elucja:
I frakcja - 12 ml eteru naftowego, zawiera węglowodory alifatyczne
II frakcja - 25 ml mieszaniny eteru naftowego i toluenu (9:1, v:v), zawiera WWA.
Wartości podane są dla złoża o wysokości 6 cm. Jeśli wysokość złoża jest inna objętości frakcji
należy proporcjonalnie zmienić.
3.7. Ocena jakości rozdziału za pomocą chromatografii cienkowarstwowej
Jeśli stężenie WWA i węglowodorów alifatycznych w glebie jest małe, frakcje można zatężyć
na odparowywaczu obrotowym.
Warunki analizy TLC:

płytki z żelem krzemionkowym 60 na foli aluminiowej (TLC Silica gel 60 firmy Merck),

faza ruchoma – cykloheksan : toluen (67:33,v:v),

wizualizacja pod lampą UV.
Wykonanie analizy TLC:

dopasować rozmiary płytki do komory chromatograficznej,

narysować delikatnie ołówkiem linię startu w odległości ok.1 cm od brzegu płytki
i zaznaczyć na niej punkty nanoszenia roztworów (punkty opisać delikatnie ołówkiem),

nanieść na płytkę po kilka mikrolitrów roztworu wzorców WWA, frakcji WWA i frakcji
węglowodorów alifatycznych, uważając, by plamka nie miała średnicy większej niż 5 mm;
im mniejsza średnica, tym mniejsze rozmycie plamki w czasie rozwijania chromatogramu,

odparować rozpuszczalnik za pomocą ręcznej suszarki,

wlać do komory chromatograficznej taką objętość fazy ruchomej, by po wstawieniu płytki,
plamki naniesionych substancji nie dotykały lustra cieczy,

delikatnie, przy pomocy pincety, wstawić płytkę chromatograficzną z naniesionymi
substancjami do komory chromatograficznej; boki płytki nie mogą dotykać ścian komory,

komorę zamknąć i rozwijać chromatogram,

płytkę wyjąć z komory, gdy czoło rozpuszczalnika będzie w odległości mniejszej niż 1 cm
od brzegu,

zaznaczyć ołówkiem czoło fazy ruchomej i odparować fazę ruchomą (do zaniku zapachu
toluenu),

przy pomocy pincety umieścić płytkę pod lampą UV i ołówkiem obrysować widoczne
plamki,

wyznaczyć współczynnik Rf, dla wszystkich plamek, wyznaczyć zakres współczynników
Rf, dla frakcji II,

na podstawie chromatogramu TLC ocenić jakość rozdziału WWA od węglowodorów
alifatycznych na kolumnie z żelem krzemionkowym.
3.8. Sporządzenie sprawozdania
W sprawozdaniu powinno się znajdować:

zwięzły opis technik zastosowanych do izolacji WWA i węglowodorów alifatycznych z
gleby,

opis próbki,

warunki ekstrakcji,

warunki rozdziału na kolumnie,

warunki rozdziału na płytkach TLC,

schemat blokowy, ideowy wykonania oznaczenia,

ocena jakości rozdziału i dyskusja wyników.
4. Odczynniki
· żel krzemionkowy żel krzemionkowy MN-Kieselgel 60 o wielkości ziarna poniżej 0,08 mm,
odmyty od plastyfikatorów i aktywowany w temp. 150°C przez 10 godzin,
· roztwory wzorcowych WWA,
· eter naftowy destylowany,
· toluen destylowany,
· cykloheksan destylowany,
· dichlorometan destylowany,
· bezwodny siarczan(VI) sodu cz.d.a.,
· rozpuszczalniki do mycia.
5. Sprzęt i szkło laboratoryjne
· kolumna szklana z kranikiem,
· przedłużacz do kolumny,
· kolba stożkowa o poj. 50 ml 2 szt,
· kolba stożkowa o poj. 100 ml 1 szt,
· cylindry miarowe o poj. 10 ml - 1 szt., 25 ml - 1 szt., 50 ml - 1 szt,
· pipeta z tłoczkiem lub strzykawka szklana o poj. 2 ml - 2 szt,
· lejek szklany - 2 szt,
· kolbki okrągłodenne lub gruszkowe poj. 50 ml - 3 szt,
· kolbki gruszkowe poj. 100 ml - 1 szt,
· zestaw do tłoczenia przez kolumnę - 1 szt,
· łyżka metalowa - 2 szt,
· moździerz porcelanowy - 1 szt,
· sączki z bibuły filtracyjnej,
· naczynie szklane na próbkę gleby,
· komora chromatograficzna – 2 szt.,
· płytki TLC,
· strzykawka o poj. 10 μl z płasko zakończoną igłą,
· pinceta,
· odparowywacz obrotowy,
· lampa UV,
· ołówek, linijka,
· suszarka ręczna,
· rękawice ochronne, lateksowe.
Literatura
1. Behnke M., Szymański J. Problemy Ocen Środowiskowych, Nr 3(26), 2004, EKO KONSULT, Gdańsk-Oliwa.
2. Szczepaniak W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej. W-wa, PWN, 1996.
3. Minczewski J., Marczenko Z., Chemia analityczna. W-wa, PWN, 1985, tom 3.
4. Kocjan R. Chemia analityczna, podręcznik dla studentów, W-wa, PZWL, 2000, tom 2.
5. Staszewski R. Kontrola chemicznych zanieczyszczeń środowiska, Podstawy teoretyczne z
ćwiczeniami laboratoryjnymi, Politechnika Gdańska, Gdańsk,1990.
6. Jerzmanowska, Z., Preparatyka organicznych związków chemicznych, PZWL,W-wa,1972.
7. Namieśnik J. Metody instrumentalne w kontroli zanieczyszczeń środowiska. J., Politechnika
Gdańska, Gdańsk,1992.