Pobierz opis

Joanna Dominika Kozak
[email protected]
Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Wydział Farmaceutyczny
„Badania in vitro aktywności biologicznej wybranych substancji jako allosterycznych
inhibitorów neuronalnych receptorów nikotynowych”
Problem uzależnienia od nikotyny dotyka znaczną część populacji ludzkiej.
Każdego roku ponad pięć milionów ludzi na całym świecie umiera z powodu
konsekwencji uzależnienia nikotynowego objawiającego się głównie w postaci
nowotworów płuc. Ogromne zyski koncernów ze sprzedaży wyrobów nikotynowych
nie są w stanie pokryć rosnących kosztów leczenia osób uzależnionych, a tym
bardziej zrekompensować wartości najwyższej jaką jest utrata zdrowia i życia.
Dlatego też uwaga i wysiłek wielu naukowców na świecie, w tym także zespołu
badawczego w którym mam przyjemność pracować, skupione są na opracowywaniu
coraz to lepszych środków leczniczych ułatwiających uzależnionym zerwanie z
nałogiem. W naszym laboratorium prowadzony jest projekt (we współpracy z
renomowanym National Institute on Aging z Baltimore, USA) opracowania nowej
substancji, częściowego antagonisty neuronalnych receptorów nikotynowych o
potencjalnym zastosowaniu jako środek przeciw uzależniający.
Celem realizowanego przeze mnie projektu badawczego jest ocena
aktywności pochodnych dekstrometorfanu przy użyciu elektrofizjologicznej techniki
patch - clamp wobec podtypu receptora nikotynowego α3β4 [Rys 1]. Ponadto
zostanie sprawdzone czy wprowadzone modyfikacje chemiczne wpłynęły na
selektywność tych związków wobec innych podtypów receptorów. Kolejnym celem
prowadzonego
projektu
jest
zoptymalizowanie techniki patch –
clamp tak aby można było dzięki niej w
bardzo
dokładny
sposób
badać
aktywności
różnych
substancji
chemicznych
wobec
szerokiego
spektrum receptorów bramkowanych
ligandem. Badania takie są doskonałym
uzupełnieniem
mulitdyscyplinarnych
projektów prowadzonych w naszym
zespole.
Rys.1
Schemat
nikotynowego.
budowy
receptora
Rys. 2. Struktura dekstrometorfanu.
Przesłanką do podjęcia tego typu badań są
doniesienia literaturowa wskazujące na kluczową rolę
w leczeniu uzależnień częściowego zablokowania
receptorów nikotynowych podtypu α3β4. Częściowym
antagonistą
receptorów
nikotynowych
jest
dekstrometorfan, stosowany od dawna lek na kaszel
[Rys.2]. Charakteryzuje się on jednak niską
selektywnością wobec receptora α3β4. W oparciu o te informacje oraz wyniki
symulacji komputerowych nasz zespół zsyntetyzował serię N - podstawionych
pochodnych dekstrometorfanu w celu poprawienia jego selektywności wobec
podtypu α3β4. Integralną częścią tych multidyscyplinarnych badań jest ocena
aktywności funkcjonalnej opracowanych pochodnych techniką elektrofizjologiczną
patch – clamp.
Technika patch – clamp uważana jest za najlepszą metodę do badań
receptorów jonotropowych. Pozwala na bezpośredni pomiar przepływu jonów
wywołany kontrolowanym przez eksperymentatora czynnikiem. Wyniki uzyskane w
ten sposób są dokładne, bogate w informacje o oddziaływaniach zachodzących
między receptorem a związkiem chemicznym. Całe badanie można przeprowadzić w
warunkach jak najbardziej zbliżonych do fizjologicznych. Ponadto istnieje możliwość
wyboru konkretnego typu komórek i receptorów nad którymi będą prowadzone
badania. Za pomocą szklanej mikroelektrody tworzone jest wysokooporowe (ang.
giga seal) połączenie z błoną komórkową aby następnie przy zastosowaniu
niewielkiego podciśnienia rozerwać skrawek błony (ang. patch) i uzyskać dostęp do
wnętrza komórki (ang. whole – cell) [Rys. 3]. Ruch jonów płynących przez kanały
jonowe obecne w błonie komórkowej
mierzony jest przy stałej wartości
ustalonego potencjału błony (ang.
voltage – clamp).
Rys. 3 Układ pomiarowy patch – clamp.
Prowadzone
przeze
mnie
badania wykonywane są na linii
komórkowej
HEK
293
stabilnie
transfekowanej genami dla receptora
α3β4, otrzymanej dzięki uprzejmości
zespołu
badawczego
profesora
Wainera z NIA, Baltimore, USA. Komórki użyte do eksperymentów w układzie whole
- cell poddane są naprzemiennej stymulacji agonistą, agonistą z badanymi
pochodnymi oraz buforem kontrolnym. W pierwszym etapie badań komórka
znajdująca się w układzie pomiarowym została poddana działaniu szeregu
wzrastających stężeń nikotyny wobec pomiarów kontrolnych. Agonista wywołał
otwarcie badanych kanałów i przepływ przez nie jonów. Zmierzone wartości prądu w
tych eksperymentach posłużyły do wyznaczenia sigmoidalnej zależności odpowiedzi
komórki od logarytmu stężenia nikotyny (ang. dose – response) i określenie wartości
EC50 [Rys. 4]. Kolejnym etapem są oddzielne eksperymenty z użyciem szeregu
rozcieńczeń badanej pochodnej dekstrometorfanu dozowanych w połączeniu ze
stałym stężeniem nikotyny, wyznaczonym w poprzedniej serii eksperymentów.
Substancje te będące antagonistami nAChR powodują spadek odpowiedzi komórki w
stosunku do kontrolnego roztworu
nikotyny.
Wyniki
pozwolą
na
wyznaczenie sigmoidalnej zależności
dose – response, określenie na jej
podstawie wartości IC50 oraz innych
parametrów
charakteryzujących
aktywność antagonistów. Dopełnieniem
badań będzie wykonanie analogicznych
eksperymentów na innych wybranych
podtypach receptorów nikotynowych
(α4β2,
α7)
w
celu
określenia
selektywności
oddziaływań.
Zbiór
otrzymanych istotnie statystycznych
danych pozwoli wysnuć wnioski na
temat
aktywności
biologicznej
badanych
pochodnych
dekstrometorfanu wobec neuronalnych
receptorów nikotynowych i skierować je
na dalsze etapy badań in vivo i in vitro.
Rys. 4 Sigmoidalna zależność odpowiedzi komórki od logarytmu stężenia nikotyny.