PLATELIATM VZV IgG - Bio-Rad

PLATELIATM VZV IgG
48 testów
72684
TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgG
PRZECIWKO WIRUSOWI VARICELLA-ZOSTER W LUDZKIEJ SUROWICY
Polski 1/9
SPIS TREŚCI
1. ZASTOSOWANIE
2. ZNACZENIE KLINICZNE
3. ZASADA TESTU
4. SKŁAD ZESTAWU
5. PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ ODCZYNNIKÓW
6. ZALECENIA I OSTRZEŻENIA
7. PRÓBKI
8. PROCEDURA
9. SCHEMAT PROCEDURY TESTU
10. WALIDACJA TESTU
11. INTERPRETACJA WYNIKÓW
12. OGRANICZENIA METODY
13. SWOISTOŚĆ ANALITYCZNA
14. CZUŁOŚĆ I SWOISTOŚĆ DIAGNOSTYCZNA
15. PRECYZJA
16. NAJCZĘSTSZE PROBLEMY
17. LITERATURA
Polski 2/9
1. ZASTOSOWANIE
TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgG PRZECIWKO
WIRUSOWI VARICELLA-ZOSTER W LUDZKIEJ SUROWICY
2. ZNACZENIE KLINICZNE
Wirus ospy wietrznej-półpaśca (VZV) jest czynnikiem etiologicznym ospy wietrznej (varicella) i
półpaśca (zoster). Wirus należy do rodziny herpeswirusów. Zakażenie przenosi się przez kontakt
bezpośredni.
Ospa wietrzna jest wysoce zakaźną chorobą wieku dziecięcego, będącą wynikiem zakażenia
pierwotnego wirusem VZV. Zakażenie kobiety w ciąży może spowodować wady rozwojowe u dziecka;
jeśli występuje w końcowym okresie ciąży, może prowadzić do śmierci noworodka.
Półpasiec najczęściej występuje u dorosłych i jest wynikiem reaktywacji wirusa, pozostającego w
stanie latencji w zwojach czuciowych osób, które przebyły ospę wietrzną. Objawem jest bardzo
bolesna wysypka pęcherzykowa, występująca wzdłuż przebiegu zajętych nerwów.
Metody serologiczne pozwalają określić stopień uodpornienia i podatność na zakażenie (zwłaszcza
pacjentów podlegających immunosupresji) oraz umożliwiają pre- i postnatalną diagnostykę zakażeń
wewnątrzmacicznych.
3. ZASADA TESTU
Test PLATELIATM VZV IgG jest oparty na immunoenzymatycznej technice ELISA.
Częściowo oczyszczony i zinaktywowany antygen wirusa VZV jest związany z fazą stałą (paski po 8
studzienek). Podczas inkubacji z rozcieńczoną ludzką surowicą, z antygenem wiążą się swoiste
immunoglobuliny. Po inkubacji, nie swoiste immunoglobuliny i białka surowicy zostają usunięte
podczas płukania. Następnie dodawany jest koniugat, zawierający przeciwciała monoklonalne
przeciwko ludzkim IgG, znakowane peroksydazą. Nadmiar koniugatu jest usuwany podczas płukania.
Wykrycie kompleksu immunologicznego następuje przez dodanie roztworu substratu dla
peroksydazy / chromogenu, wywołującego reakcję barwną. Natężenie niebieskiej barwy jest
proporcjonalne do stężenia swoistych przeciwciał w badane próbce. Po zatrzymaniu reakcji
enzymatycznej przez dodanie roztworu kwasu siarkowego, barwa studzienek zmienia się na żółtą.
Gęstość optyczną odczytuje się spektrofotometrycznie. Uzyskana wartość OD jest proporcjonalna do
ilości przeciwciał IgG anty-VZV.
4. SKŁAD ZESTAWU
Odczynniki wystarczają na 48 oznaczeń.
Przed użyciem przenieść odczynniki do temperatury pokojowej.
MT PLATE Mikropłytka (gotowa do użycia)
3 x 2 paski po 8 studzienek opłaszczonych wirusem Varicella-Zoster.
Użycie: Opakowanie otworzyć po przeciwnej stronie niż kod (ZG + nr serii), potrzebny
do identyfikacji płytki, i wyjąć potrzebną ilość pasków. Pozostałe paski zamknąć
szczelnie w oryginalnej torebce z pochłaniaczem wilgoci, usuwając powietrze przed
zamknięciem.
CONJ
Koniugat (gotowy do użycia) 1 x 10 ml
Przeciwciała monoklonalne anty-IgG, znakowane peroksydazą chrzanową, w buforze
fosforanowym + 0.05% fenol i 0.02% Bronidox.
CONTROL+ Kontrola dodatnia (gotowa do użycia) 1 x 1.6 ml
Zawartość: Ludzka surowica, zawierająca przeciwciała IgG anty-VZV, rozcieńczona w
0.01 M buforze fosforanowym + 1% BSA + 0.09% azydek sodu.
Barwa: proporcjonalna do względnego miana przeciwciał.
CONTROL Kontrola dodatnia cut-off (gotowa do użycia) 1 x 2.0 ml
CUT-OFF Zawartość: Ludzka surowica, zawierająca przeciwciała IgG anty-VZV, rozcieńczona w
0.01 M buforze fosforanowym + 1% BSA + 0.09% azydek sodu.
Barwa: proporcjonalna do względnego miana przeciwciał
Polski 3/9
CONTROL Kontrola ujemna (PF93910) (gotowa do użycia) 1 x 1.6 ml
IgGWYMIENNA POMIĘDZY SERIAMI
Zawartość: Ludzka surowica nie zawierająca przeciwciał IgG anty-VZV, rozcieńczona w
0.01 M buforze fosforanowym + 1% BSA + 0.09% azydek sodu.
WASH BUF Bufor do płukania (10 x stężony) (PF93603) 1 x 100 ml
10x
WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI
Skład: Sól zbuforowana fosforanem + 0.5% Brij
Przygotowanie: Rozcieńczyć potrzebną ilość w stosunku 1:10 wodą destylowaną. W
przypadku krystalizacji, przed rozcieńczeniem rozpuścić osad w temp. 37°C.
SAMP DIL
50x
Rozcieńczalnik próbek (PF93601) (stężony 50x) 1 x 4.5 ml
WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI
Zawartość: Roztwór białek + 0.05% fenol i 0.02% Bronidox.
Przygotowanie: Rozcieńczyć potrzebną ilość w stosunku 1:50 buforem do płukania.
SUBS TMB Substrat (PF93619) (gotowy do użycia) 12 ml
WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI
Zawartość: Czterometylobenzydyna (0.26mg/ml) i 0.01%
stabilizowana w 0.05 M buforze cytrynianowym (pH 3.8).
H2SO4
0.3 M
nadtlenek
wodoru,
Roztwór zatrzymujący (PF93602) (gotowy do użycia) 1 x 16 ml
WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI
0.3 M kwas siarkowy
Folia adhezyjna (2)
Torebka polietylenowa (1)
INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Cieplarka na 37°C
Czytnik mikropłytek (długość fali 450 lub 450/620 nm; odczyt liniowy co najmniej do OD =
2000).
Płuczka mikropłytek, pobierająca objętość 225-375 µl.
Jałowa woda destylowana lub dejonizowana
Szkło laboratoryjne: cylindry miarowe, próbówki, itp.
Pipety pobierające 10 µl, 100 µl i 1000 µl.
Pojemnik na materiał zakaźny i zanieczyszczone odpady
5% Podchloryn sodu (wybielacz)
Rękawiczki jednorazowe
Timer
Bibuła
5. PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ ODCZYNNIKÓW
Odczynniki należy przechowywać w temp. 2-8°C.
Data ważności jest wydrukowana na każdym odczynniku i na opakowaniu zewnętrznym.
Po otwarciu odczynniki mają określona trwałość:
ODCZYNNIK
Mikropłytka
Surowice wzorcowe
Koniugat
Substrat
Rozcieńczalnik próbek
Bufor do płukania
WARUNKI PRZECHOWYWANIA
5 tygodni w temp. 2-8°C w torebce polietylenowej
5 tygodni w temp. 2-8°C
5 tygodni w temp. 2-8°C
Zgodnie z datą ważności w temp. 2-8°C, 1 tydzień w temp. 15-30°C,
w ciemności
Gotowy do użycia, 2 tygodnie w temp. 2-8°C
2 tygodnie w temp. 2-8°C, 5 dni w temp. 15-30°C
Polski 4/9
Roztwór zatrzymujący
Zgodnie z datą ważności w temp. 2-8°C
6. ZALECENIA I OSTRZEŻENIA
ODCZYNNIKI WYŁĄCZNIE DO DIAGNOSTYKI IN VITRO
Zestaw zawiera materiał pochodzenia ludzkiego, przebadany technikami zatwierdzonymi przez
FDA i określony jako ujemny pod względem antygenu HBs i przeciwciał anty-HIV-1, anty-HIV-2 i
anty-HCV. Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych,
odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego powinny być traktowane jako materiał
potencjalnie zakaźny.
Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki
Laboratoryjnej:
1. Przed użyciem przenieść próbki i odczynniki do temperatury pokojowej (18-30°C). Po użyciu
od razu schować odpowiednie odczynniki do lodówki. Ważne jest zachowanie podczas
pracy odpowiedniej temperatury; nie może ona spadać poniżej 35°C i przekraczać 39°C.
Potrzebne do testu paski wyjąć z opakowania i co najmniej ½ godziny trzymać w temp.
pokojowej.
2. Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności, unikając zanieczyszczenia
mikrobiologicznego.
3. Nie zmieniać opisanej procedury ani nie używać odczynników innych producentów i z innych
serii, o ile odczynnik nie jest oznaczony jako stosowany zamiennie. Nie skracać zalecanego
czasu inkubacji.
4. Używać szkła dokładnie umytego, przepłukanego 2M kwasem solnym, wodą destylowaną lub
wysokiej jakości wodą dejonizowaną, i wysuszonego, lub, co jest wskazane, materiałów
jednorazowych.
5. Podczas przechowywania ani na etapach inkubacji nie eksponować odczynników na światło
lub pary podchlorynu.
6. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki na kolejnych etapach procedury.
7. Unikać krzyżowego zanieczyszczenia odczynników; do każdego używać innej pipety.
8. Uważnie nanosić koniugat, nie dotykając końcówką krawędzi płytki i nie doprowadzać do
przelania się zawartości studzienki.
9. Test immunoenzymatyczny może czasem wykazywać „efekt brzeżny”, który należy
zminimalizować zwiększając wilgotność podczas inkubacji. Płytka podczas inkubacji w temp.
37°C musi być nakryta pokrywką i umieszczona w statywie lub na platformie w łaźni wodnej,
albo inkubowana w cieplarce. Alternatywnie, oznaczenie można wykonywać automatycznie i
wówczas płytka jest inkubowana w aparacie. Nie używać inkubatorów CO2.
10. Przed odczytem dokładnie osuszyć spód mikropłytki i sprawdzić, czy w studzienkach nie ma
pęcherzyków powietrza.
11. Dla próbek silnie zhemolizowanych, niecałkowicie odwłóknionych lub zanieczyszczonych
mikrobiologicznie można uzyskać błędne wyniki.
12. Należy zapoznać się z instrukcją obsługi używanej aparatury:
- instalacja i szczegóły wyposażenia
- zasada działania, instrukcja, ostrzeżenia i zagrożenia
- specyfikacje producenta i charakterystyka aparatu
- serwis i konserwacja.
HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY
• Nie pipetować ustami. Podczas pracy z odczynnikami i próbkami należy używać okularów
ochronnych i rękawiczek jednorazowych, a po pracy dokładnie umyć ręce.
• Następujące odczynniki zawierają niskie stężenie związków szkodliwych lub drażniących:
- bufor do płukania zawiera detergenty
- koniugat zawiera fenol
- substrat ma odczyn kwaśny
- surowice wzorcowe zawierają 0.09% azydek sodu, który może reagować z miedzią i ołowiem
w kanalizacji, tworząc wysoce wybuchowe azydki metali. Po wylaniu do zlewu spłukać dużą
ilością wody.
Polski 5/9
•
•
•
•
Sprzęt wielokrotnego użytku należy wysterylizować po użyciu. Zaleca się autoklawowanie
przez co najmniej godzinę w temp. 121°C; materiały jednorazowe należy autoklawować lub
spalać.
Kwas siarkowy w roztworze zatrzymującym i kwas solny używany do płukania szkła
laboratoryjnego są związkami żrącymi i wymagają ostrożnego obchodzenia się. W przypadku
kontaktu ze skórą lub z oczami, przemyć dużą ilością wody.
Do neutralizacji kwasów i dekontaminacji innych płynnych odpadów używać podchlorynu sodu
w końcowym stężeniu (po zmieszaniu z odpadem) 1.0%. 30-minutowa ekspozycja na 1%
podchloryn sodu jest wystarczająca dla efektywnej dekontaminacji.
Rozlany materiał zakaźny zebrać szybko bibułą, a zanieczyszczoną powierzchnię przemyć
1.0% roztworem podchlorynu i osuszyć, przed kontynuacją pracy. W przypadku rozlania
kwasu należy dokładnie wytrzeć powierzchnię przed zmyciem podchlorynem sodu. Materiał
używany do czyszczenia, w tym rękawiczki, wyrzucić do pojemnika na skażone odpady. Nie
autoklawować roztworów zawierających podchloryn sodu.
7. PRÓBKI
• Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą, z wkłucia dożylnego.
• Z próbkami postępować przestrzegając zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej.
• Jeśli test będzie wykonany w ciągu 4 dni, próbki można przechować w temp. +2-8°C.
• Jeśli test będzie wykonany później, lub próbki będą transportowane, należy je zamrozić w
temp. -20°C lub niższej.
• Próbki można zamrozić i rozmrozić najwyżej 3 razy.
• Po rozmrożeniu próbki należy dokładnie wymieszać przed oznaczeniem.
• Inaktywacja termiczna i zanieczyszczenie mikrobiologiczne może powodować błędne wyniki.
• Należy unikać próbek silnie lipemicznych, żółtaczkowych i zanieczyszczonych.
•
Do testu nie nadaje się osocze.
8. PROCEDURA
- Przygotować potrzebną liczbę pasków.
- Przygotować bufor do płukania rozcieńczając stężony bufor 10x (100 ml + 1100 ml wody).
- Przygotować potrzebną ilość rozcieńczalnika próbek, dodając 1 część rozcieńczalnika stężonego
50x do 49 części rozcieńczonego buforu do płukania (np. 2 ml + 98 ml rozcieńczonego buforu do
płukania).
Rozcieńczyć próbki 1:101 dodając 10 µl surowicy do 1 ml rozcieńczalnika. Do studzienek nanieść po
100 µl rozcieńczonych próbek (zaleca się oznaczenie w duplikacie). Do kolejnych studzienek nanieść
po 100 µl NIEROZCIEŃCZONYCH surowic wzorcowych: co najmniej 1 kontrolę ujemną, 2 kontrole
cut-off i 1 kontrolę dodatnią. Jedną studzienkę pozostawić na ślepą próbę, jaką jest 100 µl mieszaniny
substratu.
Studzienki zakryć folią adhezyjną i inkubować przez 45 minut w temp. 37°C. Przepłukać 4 razy przez
30 sekund (300 µl) i dodać do każdej studzienki 100 µl koniugatu (z wyjątkiem ślepej próby). Zakryć
szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną i inkubować przez 45 minut w temp. 37°C. Ponownie przepłukać
4 razy jak poprzednio. Następnie do każdej studzienki dodać 100 µl substratu.
Po 15 minutach inkubacji w temp. pokojowej zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do
każdej studzienki 100 µl roztworu zatrzymującego. Odczytać wartość absorbancji (OD) przy długości
fali 450 nm lub 450/620 nm w czasie 30 minut po zatrzymaniu reakcji.
TM
9. Schemat procedury testu Platelia
VZV IgG
ETAP 1
Do studzienek nanieść po 100 µl rozcieńczonych próbek/ nierozcieńczonych kontroli
Inkubować przez 45 minut w temp. 37°C
Przepłukać 4 razy przez 30 sekund (300 µl)
ETAP 2
Do każdej studzienki nanieść 100 µl koniugatu (oprócz ślepej próby)
Inkubować przez 45 minut w temp. 37°C
Polski 6/9
Przepłukać 4 razy przez 30 sekund (300 µl)
ETAP 3
Do każdej studzienki nanieść 100 µl substratu
Inkubować przez 15 minut w temp. pokojowej
ETAP 4
Do każdej studzienki nanieść 100 µl roztworu zatrzymującego
Odczytać absorbancję przy 450 nm w czasie 30 minut
10. WALIDACJA TESTU
Od odczytanych wartości OD odjąć wartość OD dla ślepej próby (≤ 150). Żadna z wartości OD kontroli
cut-off, oznaczonej w tryplikacie, nie może odbiegać od średniej o 25%. Wartość, która odbiega o
ponad 25%, należy pominąć i obliczyć średnią dla dwóch pozostałych.
Aby wyniki testu były ważne, muszą być spełnione odpowiednie kryteria - uzyskanie wartości gęstości
optycznej:
OD kontroli dodatniej ≥ 1.5 x OD kontroli cut-off.
OD kontroli ujemnej / OD kontroli cut-off < 0.6
OD kontroli cut-off ≥ 0.2 przy 450 nm i ≥ 0.16 przy 450/620 nm
Jeśli nie spełnione są kryteria kontroli jakości, test należy powtórzyć.
11. INTERPRETACJA WYNIKÓW
WYNIKI JAKOŚCIOWE
Jeśli absorbancja próbki jest wyższa niż absorbancja kontroli cut-off, próbka jest dodatnia pod
względem swoistych przeciwciał IgG.
Obliczyć iloraz wartości OD próbki i OD kontroli cut-off (INDEX).
Wynik dodatni: iloraz > 1.2
Wynik wątpliwy: ± 20% wartości cut-off
Wynik ujemny: iloraz < 0.8
W przypadku wyników wątpliwych zaleca się powtórzenie testu. Jeśli wynik kolejnego testu jest
wątpliwy, należy pobrać i oznaczyć nową próbkę.
12. OGRANICZENIA METODY
Dla próbek pobranych w ostrej fazie zakażenia, gdy występują jedynie przeciwciała klasy IgM, można
uzyskać wyniki ujemne.
Przeciwciała klasy IgM anty-VZV można wykryć w teście PlateliaTM VZV IgM. Alternatywnie, w drugiej
próbce pobranej 8-14 dni później można równolegle oznaczyć wzrost miana przeciwciał IgG.
Wyniki testu należy interpretować w kontekście danych klinicznych, historii choroby pacjenta i wyników
innych testów laboratoryjnych.
13. SWOISTOŚĆ ANALITYCZNA
Na wynik testu nie wpływają przeciwciała IgG przeciwko innym wirusom: różyczki, Epsteina Barr,
herpes simplex, świnki i odry.
14. CZUŁOŚĆ I SWOISTOŚĆ DIAGNOSTYCZNA
W badaniu klinicznym, prowadzonym w laboratorium szpitalnym, oznaczono 47 próbek, stosując
równolegle inną komercyjną metodę immunoenzymatyczną. Próbki, dla których uzyskano wyniki
niezgodne, testowano referencyjną metodą IFA. Wyniki przedstawia tabela:
Polski 7/9
+
PlateliaTM VZV IgG
-
METODA REFERENCYJNA
+
29
0
3
15
Czułość testu PlateliaTM VZV IgG określono na 90.63%, a swoistość na 100%.
15. PRECYZJA
Powtarzalność wewnątrz-testowa dla odczynników 3 serii
Cut-off n=21
OD
CV%
Seria 029
0.451
10
Seria 030
0.457
7
Seria 031
0.362
5
Powtarzalność pomiędzy-testowa dla odczynników różnych serii
Próbka
1
2
3
Seria nr 029
0.3
1.5
3.0
INDEX
Seria nr 030
0.4
1.0
3.0
Seria nr 031
0.3
1.7
3.3
Średnia
0.3
1.7
3.1
CV%
23
10
5
16. NAJCZĘSTSZE PROBLEMY
PROBLEM
Nieważny test (wszystkie
próbki ujemne)
MOŻLIWA PRZYCZYNA
Jeden lub więcej odczynników
nie dodany lub dodany w
niewłaściwej kolejności
Nieaktywna mikropłytka
Nieważny test (wszystkie
próbki dodatnie)
Zanieczyszczenie substratu
Niska precyzja
Niedostateczne płukanie
studzienek
Niedokładne płukanie studzienek
Niedokładna aspiracja ze
studzienek
Błąd pipetowania
Zbyt wolne dodawanie
odczynników
Obecność pęcherzyków
powietrza
Zanieczyszczenie na drodze
optycznej
Powstanie niewłaściwej
barwy
Nieprawidłowy czas lub
temperatura inkubacji
Dodana nieodpowiednia ilość
substratu
DZIAŁANIE
Sprawdzić procedurę.
Sprawdzić nie używane roztwory.
Powtórzyć test.
Sprawdzić kod na opakowaniu
płytki (patrz p.4 instrukcji)
Sprawdzić wilgotność nie używanej
płytki (pochłaniacz wilgoci – żel
silikonowy musi być jasno-żółty).
Powtórzyć test.
Wziąć nową porcję substratu.
Sprawdzić pracę płuczki.
Sprawdzić pracę płuczki.
Sprawdzić pracę płuczki.
Zmienić ustawienie pipety
Unikać wysuszenia płytki po etapie
płukania. Od razu dodawać
odczynniki.
Unikać powstawania pęcherzyków
podczas pipetowania.
Sprawdzić czystość źródła światła i
detektora. Wytrzeć spód płytki
miękkim materiałem.
Sprawdzić ustawienie termostatu i
monitorowanie czasu.
Zastosować się do instrukcji.
Zmienić ustawienie pipety
Polski 8/9
17. LITERATURA
patrz wersja angielska
05/2012
Polski 9/9