PLATELIATM Mumps IgM - Bio-Rad

PLATELIATM Mumps IgM
48 testów
72689
TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgM
PRZECIWKO WIRUSOWI ŚWINKI W LUDZKIEJ SUROWICY
Polski 1/9
SPIS TREŚCI
1. ZASTOSOWANIE
2. ZNACZENIE KLINICZNE
3. ZASADA TESTU
4. SKŁAD ZESTAWU
5. PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ ODCZYNNIKÓW
6. ZALECENIA I OSTRZEŻENIA
7. PRÓBKI
8. PROCEDURA
9. SCHEMAT PROCEDURY TESTU
10. WALIDACJA TESTU
11. INTERPRETACJA WYNIKÓW
12. OGRANICZENIA METODY
13. SWOISTOŚĆ ANALITYCZNA
14. CZUŁOŚĆ I SWOISTOŚĆ DIAGNOSTYCZNA
15. PRECYZJA
16. NAJCZĘSTSZE PROBLEMY
17. LITERATURA
Polski 2/9
1. ZASTOSOWANIE
TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgM PRZECIWKO
WIRUSOWI ŚWINKI W LUDZKIEJ SUROWICY
2. ZNACZENIE KLINICZNE
Świnka (nagminne zapalenie ślinianek przyusznych) jest częstą chorobą zakaźną wieku dziecięcego.
Jest ostrym, uogólnionym zakażeniem wirusowym, które atakuje przede wszystkim ślinianki
przyuszne, powodując charakterystyczne powiększenie gruczołów. Wystąpienie powikłań, takich jak
zapalenie jąder, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych lub mózgu, bez widocznego powiększenia
ślinianek, wymaga serologicznego potwierdzenia zakażenia.
3. ZASADA TESTU
Test PLATELIA™ MUMPS IgM jest oparty na immunoenzymatycznej technice ELISA.
Z fazą stałą (paski po 8 studzienek) związane są przeciwciała przeciwko łańcuchom µ
immunoglobulin, które wiążą obecne w badanej surowicy przeciwciała IgM. Następnie dodawany jest
antygen wirusa świnki w kompleksie z koniugatem - przeciwciałami monoklonalnymi znakowanymi
peroksydazą. Na fazie stałej powstają kompleksy przeciwciało anty-IgM – IgM przeciwko wirusowi
świnki – antygen wirusa – znakowane przeciwciało monoklonalne. Wykrycie kompleksu
immunologicznego następuje przez dodanie roztworu substratu dla peroksydazy / chromogenu,
wywołującego reakcję barwną. Natężenie niebieskiej barwy jest proporcjonalne do stężenia swoistych
przeciwciał w badane próbce. Po zatrzymaniu reakcji enzymatycznej roztworem kwasu siarkowego,
barwa studzienek zmienia się na żółtą. Gęstość optyczną odczytuje się spektrofotometrycznie.
Uzyskana wartość OD jest proporcjonalna do ilości przeciwciał IgM przeciwko wirusowi świnki.
4. SKŁAD ZESTAWU
Odczynniki wystarczają na 48 oznaczeń.
Przed użyciem przenieść odczynniki do temperatury pokojowej.
MT PLATE Mikropłytka (gotowa do użycia)
6 x 8 studzienek opłaszczonych przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko ludzkim IgM.
Użycie: Opakowanie otworzyć po przeciwnej stronie niż kod (M + nr serii), potrzebny do
identyfikacji płytki, i wyjąć potrzebną ilość pasków. Pozostałe paski zamknąć szczelnie
w oryginalnej torebce z pochłaniaczem wilgoci, usuwając powietrze przed zamknięciem.
CONTROL+ Kontrola dodatnia (gotowa do użycia) 1 x 1.6 ml
Zawartość: Ludzka surowica, zawierająca przeciwciała IgM przeciwko wirusowi świnki,
rozcieńczona w 0.01 M buforze fosforanowym + 1% BSA + 0.09% azydek sodu.
Barwa: proporcjonalna do względnego miana przeciwciał
CONTROL Kontrola dodatnia cut-off (gotowa do użycia) 1 x 2.5 ml
Zawartość: Ludzka surowica, zawierająca przeciwciała IgM przeciwko wirusowi świnki,
cut-off
rozcieńczona w 0.01 M buforze fosforanowym + 1% BSA + 0.09% azydek sodu.
Barwa: proporcjonalna do względnego miana przeciwciał
Ag
CONJ
Antygen (liofilizowany) 3 fiolki
Zawartość: Oczyszczony wirus świnki, zinaktywowany beta-propiolaktonem, w buforze
fosforanowym zawierającym laktozę.
Przygotowanie: Zrekonstytuować za pomocą koniugatu, dodając ilość podaną na fiolce;
wymieszać przez odwracanie.
Koniugat (gotowy do użycia) 10 ml
Zawartość: Monoklonalne przeciwciała znakowane peroksydazą , w buforze
fosforanowym + 0.05% fenol i 0.02% Bronidox.
Przygotowanie: Kompleks immunologiczny należy przygotować około 45 minut przed
użyciem.
Polski 3/9
CONTROL Kontrola ujemna (PF93900) (gotowa do użycia) 1 x 1.6 ml
IgMWYMIENNA POMIĘDZY SERIAMI
Zawartość: Ludzka surowica nie zawierająca przeciwciał IgM przeciwko wirusowi świnki,
rozcieńczona w 0.01 M buforze fosforanowym + 1% BSA + 0.09% azydek sodu.
WASH BUF Bufor do płukania (10 x stężony) (PF93603) 1 x 100 ml
10x
WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI
Skład: Sól zbuforowana fosforanem + 0.5% Brij
Przygotowanie: Rozcieńczyć potrzebną ilość w stosunku 1:10 wodą destylowaną. W
przypadku krystalizacji, przed rozcieńczeniem rozpuścić osad w temp. 37°C.
SAMP DIL
50x
Rozcieńczalnik próbek (PF93601) (stężony 50x) 1 x 4.5 ml
WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI
Zawartość: Roztwór białek + 0.05% fenol i 0.02% Bronidox.
Przygotowanie: Rozcieńczyć potrzebną ilość w stosunku 1:50 buforem do płukania.
SUBS TMB Substrat (PF93619) (gotowy do użycia) 12 ml
WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI
Zawartość: Czterometylobenzydyna (0.26mg/ml) i 0.01%
stabilizowana w 0.05 M buforze cytrynianowym (pH 3.8).
H2SO4
0.3 M
nadtlenek
wodoru,
Roztwór zatrzymujący (PF93602) (gotowy do użycia) 1 x 16 ml
WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI
0.3 M kwas siarkowy
Folia adhezyjna (2)
Torebka polietylenowa (1)
INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Cieplarka na 37°C
Czytnik mikropłytek (długość fali 450 lub 450/620 nm; odczyt liniowy co najmniej do OD =
2000).
Płuczka mikropłytek, pobierająca objętość 225-375 µl.
Jałowa woda destylowana lub dejonizowana
Szkło laboratoryjne: cylindry miarowe, próbówki, itp.
Pipety pobierające 10 µl, 100 µl i 1000 µl.
Pojemnik na materiał zakaźny i zanieczyszczone odpady
5% Podchloryn sodu (wybielacz)
Rękawiczki jednorazowe
Timer
Bibuła
5. PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ ODCZYNNIKÓW
Odczynniki należy przechowywać w temp. 2-8°C.
Data ważności jest wydrukowana na każdym odczynniku i na opakowaniu zewnętrznym.
Po otwarciu odczynniki mają określoną trwałość:
ODCZYNNIK
Mikropłytka
Surowice wzorcowe
Koniugat
Zrekonstytuowany antygen
WARUNKI PRZECHOWYWANIA
5 tygodni w temp. 2-8°C w torebce polietylenowej
5 tygodni w temp. 2-8°C
5 tygodni w temp. 2-8°C
5 dni w temp. 2-8°C po rekonstytucji koniugatem; (-20°C po
rekonstytucji buforem do płukania. Unikać rozmrażania i powtórnego
zamrażania. Zobacz p.1 „Zalecenia i ostrzeżenia”).
Polski 4/9
Substrat
Rozcieńczalnik próbek
Bufor do płukania
Roztwór zatrzymujący
Zgodnie z datą ważności w temp. 2-8°C, 1 tydzień w temp. 15-30°C;
w ciemności
Gotowy do użycia, 2 tygodnie w temp. 2-8°C
2 tygodnie w temp. 2-8°C, 5 dni w temp. 15-30°C
Zgodnie z datą ważności w temp. 2-8°C
6. ZALECENIA I OSTRZEŻENIA
ODCZYNNIKI WYŁĄCZNIE DO DIAGNOSTYKI IN VITRO
Zestaw zawiera materiał pochodzenia ludzkiego, przebadany technikami zatwierdzonymi przez
FDA i określony jako ujemny pod względem antygenu HBs i przeciwciał anty-HIV-1, anty-HIV-2 i
anty-HCV. Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych,
odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego powinny być traktowane jako materiał
potencjalnie zakaźny.
Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej:
1. Antygen zrekonstytuowany za pomocą koniugatu nie jest stabilny po zamrożeniu. W
przypadku
wolnego
zużywania
antygenu
należy
postąpić
następująco:
zrekonstytuować antygen w 1/10 objętości podanej na etykiecie, w buforze do płukania
przygotowanym do użycia (np.: gdy objętość podana na fiolce wynosi 3 ml, dodać 0.3
ml buforu do płukania). Pobrać ilość antygenu potrzebną do bieżącego testu i zmieszać
z 10 częściami koniugatu. Resztę rozporcjować i zamrozić. Bezpośrednio przed
użyciem porcję rozmrozić i zmieszać z 10 częściami koniugatu.
2. Przed użyciem przenieść próbki i odczynniki do temperatury pokojowej (18-30°C). Po użyciu
od razu schować odpowiednie odczynniki do lodówki. Ważne jest zachowanie podczas
pracy odpowiedniej temperatury; nie może ona spadać poniżej 35°C i przekraczać 39°C.
Potrzebne do testu paski wyjąć z opakowania po co najmniej ½ godziny pozostawienia
w temp. pokojowej.
3. Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności, unikając zanieczyszczenia
mikrobiologicznego.
4. Nie zmieniać opisanej procedury ani nie używać odczynników innych producentów i z innych
serii, o ile odczynnik nie jest oznaczony jako stosowany zamiennie. Nie skracać zalecanego
czasu inkubacji.
5. Używać szkła dokładnie umytego, przepłukanego 2M kwasem solnym, wodą destylowaną lub
wysokiej jakości wodą dejonizowaną, i wysuszonego, lub, co jest wskazane, materiałów
jednorazowych.
6. Podczas przechowywania i na etapach inkubacji nie eksponować odczynników na światło lub
pary podchlorynu.
7. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki na etapach procedury.
8. Unikać krzyżowego zanieczyszczenia odczynników; do każdego używać innej pipety.
9. Uważnie nanosić koniugat, nie dotykając końcówką krawędzi płytki i nie doprowadzać do
przelania się zawartości studzienki.
10. Test immunoenzymatyczny może czasem wykazywać „efekt brzeżny”, który należy
zminimalizować zwiększając wilgotność podczas inkubacji. Płytka podczas inkubacji w temp.
37°C musi być nakryta pokrywką i umieszczona w statywie lub na platformie w łaźni wodnej,
albo inkubowana w cieplarce. Alternatywnie, oznaczenie można wykonywać automatycznie i
wówczas płytka jest inkubowana w aparacie. Nie używać inkubatorów CO2.
11. Przed odczytem dokładnie osuszyć spód mikropłytki i sprawdzić, czy w studzienkach nie ma
pęcherzyków powietrza.
12. Dla próbek silnie zhemolizowanych, niecałkowicie odwłóknionych lub zanieczyszczonych
mikrobiologicznie można uzyskać błędne wyniki.
13. Należy zapoznać się z instrukcją obsługi używanej aparatury:
- instalacja i szczegóły wyposażenia
- zasada działania, instrukcja, ostrzeżenia i zagrożenia
- specyfikacje producenta i charakterystyka aparatu
- serwis i konserwacja.
Polski 5/9
HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY
• Nie pipetować ustami. Podczas pracy z odczynnikami i próbkami należy używać okularów
ochronnych i rękawiczek jednorazowych, a po pracy dokładnie umyć ręce.
• Następujące odczynniki zawierają niskie stężenie związków szkodliwych lub drażniących:
- bufor do płukania zawiera detergenty
- koniugat zawiera fenol
- substrat ma odczyn kwaśny
- surowice wzorcowe zawierają 0.09% azydek sodu, który może reagować z miedzią i ołowiem
w kanalizacji, tworząc wysoce wybuchowe azydki metali. Po wylaniu do zlewu spłukać dużą
ilością wody.
• Sprzęt wielokrotnego użytku należy wysterylizować po użyciu. Zaleca się autoklawowanie
przez co najmniej godzinę w temp. 121°C; materiały jednorazowe należy autoklawować lub
spalać.
• Kwas siarkowy w roztworze zatrzymującym i kwas solny używany do płukania szkła
laboratoryjnego są związkami żrącymi i wymagają ostrożnego obchodzenia się. W przypadku
kontaktu ze skórą lub z oczami, przemyć dużą ilością wody.
• Do neutralizacji kwasów i dekontaminacji innych płynnych odpadów używać podchlorynu sodu
w końcowym stężeniu (po zmieszaniu z odpadem) 1.0%. 30-minutowa ekspozycja na 1%
podchloryn sodu jest wystarczająca dla efektywnej dekontaminacji.
• Rozlany materiał zakaźny zebrać szybko bibułą, a zanieczyszczoną powierzchnię przemyć
1.0% roztworem podchlorynu i osuszyć, przed kontynuacją pracy. W przypadku rozlania
kwasu należy dokładnie wytrzeć powierzchnię przed zmyciem podchlorynu sodu. Materiał
używany do czyszczenia, w tym rękawiczki, wyrzucić do pojemnika na skażone odpady. Nie
autoklawować roztworów zawierających podchloryn sodu.
7. PRÓBKI
• Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą, z wkłucia dożylnego.
• Z próbkami postępować przestrzegając zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej.
• Jeśli test będzie wykonany w ciągu 4 dni, próbki można przechować w temp. +2-8°C.
• Jeśli test będzie wykonany później, lub próbki będą transportowane, należy je zamrozić w
temp. -20°C lub niższej.
• Próbki można zamrozić i rozmrozić najwyżej 3 razy.
• Po rozmrożeniu próbki należy dokładnie wymieszać przed oznaczeniem.
• Inaktywacja termiczna i zanieczyszczenie mikrobiologiczne może powodować uzyskanie
błędnych wyników.
• Należy unikać próbek silnie lipemicznych, żółtaczkowych i zanieczyszczonych.
•
Do testu nie nadaje się osocze.
8. PROCEDURA
Metoda manualna
- Przygotować potrzebną liczbę pasków.
- Przygotować bufor do płukania rozcieńczając stężony bufor 10x (120 ml + 1100 ml wody).
- Przygotować potrzebną ilość rozcieńczalnika próbek, dodając 1 część rozcieńczalnika stężonego
50x do 49 części rozcieńczonego buforu do płukania (np. 2 ml + 98 ml rozcieńczonego buforu do
płukania).
- Przygotować antygen rekonstytuując liofilizat przy pomocy koniugatu (objętość podana na etykiecie);
w przypadku małego zużycia antygenu – w gotowym do użycia buforze do płukania (1:10 objętości
podanej na etykiecie) i następnie 1:11 w koniugacie.
Rozcieńczyć próbki 1:101 dodając 10 µl surowicy do 1 ml rozcieńczalnika. Do studzienek nanieść po
100 µl rozcieńczonych próbek (zaleca się oznaczenie w duplikacie). Do kolejnych studzienek nanieść
po 100 µl NIEROZCIEŃCZONYCH kontroli: co najmniej 1 kontrolę ujemną, 2 kontrole cut-off i 1
kontrolę dodatnią. Jedną studzienkę pozostawić na ślepą próbę, jaką jest 100 µl mieszaniny substratu.
Studzienki zakryć folią adhezyjną i inkubować przez 45 minut w temp. 37°C. Przepłukać 4 razy przez
30 sekund (300 µl) i dodać do każdej studzienki 100 µl kompleksu immunologicznego. Zakryć
Polski 6/9
szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną i inkubować przez 45 minut w temp. 37°C. Ponownie przepłukać
4 razy jak poprzednio. Następnie do każdej studzienki dodać 100 µl substratu.
Po 15 minutach inkubacji w temp. pokojowej zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do
każdej studzienki 100 µl roztworu zatrzymującego. Odczytać wartość absorbancji (OD) przy długości
fali 450 nm lub 450/620 nm w czasie 30 minut po zatrzymaniu reakcji.
9. Schemat procedury testu PlateliaTM MUMPS IgM
Metoda manualna
ETAP 1
Do studzienek nanieść po 100 µl rozcieńczonych próbek/ kontroli
Inkubować przez 45 minut w temp. 37°C
Przepłukać 4 razy przez 30 sekund (300 µl)
ETAP 2
Do każdej studzienki nanieść 100 µl kompleksu immunologicznego (oprócz ślepej
próby)
Inkubować przez 45 minut w temp. 37°C
Przepłukać 4 razy przez 30 sekund (300 µl)
ETAP 3
Do każdej studzienki nanieść 100 µl substratu
Inkubować przez 15 minut w temp. pokojowej
ETAP 4
Do każdej studzienki nanieść 100 µl roztworu zatrzymującego
Odczytać absorbancję przy 450 nm w czasie 30 minut
10. WALIDACJA TESTU
Od odczytanych wartości OD odjąć wartość OD dla ślepej próby (≤ 150). Żadna z wartości OD kontroli
cut-off, oznaczonej w tryplikacie, nie może odbiegać od średniej o 25%. Wartość, która odbiega o
ponad 25%, należy pominąć i obliczyć średnią dla dwóch pozostałych.
Aby wyniki testu były ważne, muszą być spełnione odpowiednie kryteria - uzyskanie wartości gęstości
optycznej:
OD kontroli dodatniej ≥ 1.5 x OD kontroli cut-off
OD kontroli ujemnej / OD kontroli cut-off < 0.6
OD kontroli cut-off ≥ 0.2 przy 450 nm i > 0.16 przy 450/620 nm
Jeśli nie spełnione są kryteria kontroli jakości, test należy powtórzyć.
11. INTERPRETACJA WYNIKÓW
WYNIKI JAKOŚCIOWE
Jeśli absorbancja próbki jest wyższa niż absorbancja kontroli cut-off, próbka jest dodatnia pod
względem swoistych przeciwciał IgM.
Obliczyć iloraz wartości OD próbki i OD kontroli cut-off (INDEX).
Wynik dodatni: iloraz > 1.2
Wynik wątpliwy: ± 20% wartości cut-off
Wynik ujemny: iloraz < 0.8
W przypadku wyników wątpliwych zaleca się powtórzenie testu. Jeśli wynik kolejnego testu jest
wątpliwy, należy pobrać i oznaczyć nową próbkę.
12. OGRANICZENIA METODY
Wyniki dodatnie należy interpretować ostrożnie ze względu na występowanie wyników fałszywie
dodatnich lub odpowiedzi heterotypowej w klasie IgM u kobiet w ciąży i pacjentów z ostrym
zakażeniem wirusem cytomegalii, herpes simplex, odry, różyczki i parwowirusem.
Wyniki testu należy interpretować w kontekście danych klinicznych, historii choroby pacjenta i wyników
innych testów laboratoryjnych.
Polski 7/9
13. SWOISTOŚĆ ANALITYCZNA
W teście Platelia™ MUMPS IgM oznaczono próbki, zawierające czynniki potencjalnie interferujące:
- surowice od kobiet w ciąży (n = 12)
- IgM przeciwko parwowirusowi (n = 3)
- IgM anty-CMV (n = 5)
- IgM anty-HSV (n = 5)
- IgM anty-VCA (przeciwciała heterofilne) (n = 5)
- IgM przeciwko wirusowi różyczki (n = 5)
- IgM przeciwko wirusowi ospy wietrznej (n = 5)
- IgM przeciwko wirusowi świnki (n = 5)
- czynnik reumatoidalny (do 1080 UI/dl) (n = 5)
- bilirubina (do 11 mg/dl) (n = 5)
- trójglicerydy (do 1281 mg/dl) (n = 5)
- próbki silnie zhemolizowane (n = 3)
W kilku przypadkach zaobserwowano wpływ na wynik testu surowicy od kobiet w ciąży oraz
przeciwciał przeciwko innym wirusom (cytomegalii, herpes simplex, odry, różyczki i parwowirusowi).
14. CZUŁOŚĆ I SWOISTOŚĆ DIAGNOSTYCZNA
W badaniu klinicznym, prowadzonym w laboratorium szpitalnym, oznaczono 160 próbek w teście
Platelia™ MUMPS IgM oraz równolegle inną rutynową metodą. Wyniki przedstawia tabela:
+
Platelia™ MUMPS IgM
-
METODA REFERENCYJNA
+
71
3
2
84
Czułość testu Platelia™ MUMPS IgM określono na 97.3%, a swoistość na 96.6%.
15. PRECYZJA
Powtarzalność pomiędzy-testowa
Próbka
Kontrola dodatnia
MPM1
MPM2
MPM3
Seria nr 025
3.9
0.2
1.1
2.4
INDEX
Seria nr 026
4.8
0.1
1.0
2.3
Seria nr 027
3.7
0.2
1.2
1.9
Średnia
4.1
0.2
1.1
2.2
CV%
14
35
9
12
Powtarzalność wewnątrz-testowa dla odczynników 3 serii
Cut-off n=12
OD
CV%
Seria 025
0.454
12
Seria 026
0.327
5
Seria 027
0.48
1
16. NAJCZĘSTSZE PROBLEMY
PROBLEM
Nieważny test (wszystkie
próbki ujemne)
MOŻLIWA PRZYCZYNA
Jeden lub więcej odczynników nie
dodanych lub dodanych w
niewłaściwej kolejności
Nieaktywna mikropłytka
DZIAŁANIE
Sprawdzić procedurę.
Sprawdzić nie używane roztwory.
Powtórzyć test.
Sprawdzić kod na opakowaniu
płytki (patrz p.4 instrukcji)
Sprawdzić wilgotność nie używanej
płytki (pochłaniacz wilgoci – żel
silikonowy musi być jasno-żółty).
Powtórzyć test.
Polski 8/9
Nieważny test (wszystkie
próbki dodatnie)
Niska precyzja
Zanieczyszczenie substratu
Wziąć nową porcję substratu.
Niedostateczne płukanie
studzienek
Niedokładne płukanie studzienek
Niedokładna aspiracja ze
studzienek
Błąd pipetowania
Zbyt wolne dodawanie
odczynników
Sprawdzić pracę płuczki.
Obecność pęcherzyków
powietrza
Zanieczyszczenie na drodze
optycznej
Powstanie niewłaściwej
barwy
Nieprawidłowa temperatura lub
czas inkubacji
Dodana nieodpowiednia ilość
substratu
Sprawdzić pracę płuczki.
Sprawdzić pracę płuczki.
Zmienić ustawienie pipety
Unikać wysuszenia płytki po etapie
płukania. Od razu dodawać
odczynniki.
Unikać powstawania pęcherzyków
podczas pipetowania.
Sprawdzić czystość źródła światła i
detektora. Wytrzeć spód płytki
miękkim materiałem.
Sprawdzić ustawienie termostatu i
monitorowanie czasu.
Zastosować się do instrukcji.
Zmienić ustawienie pipety
17. LITERATURA
patrz wersja angielska
07/2009
Polski 9/9