Alcian Blue for PAS

4.
Alcian Blue for PAS
860-003
05279194001
75
PRZEZNACZENIE
Zestaw do barwienia Alcian Blue for PAS Staining Kit w połączeniu z zestawem do
barwienia PAS Staining Kit (860-014/05279291001) jest przeznaczony do wykonywania
barwień histologicznych o charakterze jakościowym w celu różnicowania kwaśnej mucyny
i obojętnych polisacharydów w tkankach utrwalonych w formalinie i zatopionych
w parafinie.
Wynik powinien zostać zinterpretowany przez wykwalifikowanego patologa w połączeniu
z badaniem histologicznym, odnośnymi danymi klinicznymi i właściwymi badaniami
kontrolnymi.
Ten produkt jest przeznaczony do stosowania w diagnostyce in vitro.
PODSUMOWANIE I OBJAŚNIENIA
Zestaw Alcian Blue for PAS Staining Kit wykorzystuje kwas nadjodowy do utleniania glikoli
do aldehydów. Dodanie odczynnika Schiffa (Schiff’s reagent) prowadzi do wytworzenia
bezbarwnych związków dialdehydowych, które następnie wchodzą w barwną reakcję ze
składnikami komórkowymi zawierającymi glikol1. Odczynnik Alcian Blue for PAS Staining
Kit może być również używany z zestawem Diastase Kit w połączeniu z zestawem do
barwienia PAS Staining Kit. Odczyn pH zestawu Alcian Blue for PAS Staining Kit wynosi
2,5. Przy tej wartości pH odczynnik barwi zarówno siarczanowane, jak i karboksylowane
kwaśne mukopolisacharydy, na przykład mukopolisacharydy w komórkach kubkowych.
Zestaw barwi również siarczanowane i karboksylowane sialomucyny, występujące na
przykład w śliniankach, komórkach kubkowych i komórkach błony śluzowej żołądka.
Barwieniu ulega również kwas hialuronowy w pępowinie i tkance skórnej2.
ZASADY PROCEDURY
Ten zestaw jest zoptymalizowany pod kątem użycia w automatach do barwienia
preparatów BenchMark Special Stains oraz NexES Special Stains firmy VENTANA.
Odczynniki nanoszone są na tkankę umieszczoną na szkiełku mikroskopowym i mieszane
na całej powierzchni preparatu. Reakcja barwna polega na utlenianiu glikolu do aldehydu,
po czym następuje selektywne barwienie grup aldehydowych przy użyciu odczynnika
Schiffa. Kwaśny odczynnik Alcian Blue (błękit alcjanowy) w różny sposób barwi kwaśne
mucyny i obojętne mukopolisacharydy.
MATERIAŁY I METODY
Dostarczany odczynnik
Fiolka z odczynnikiem jest dostarczana w uchwycie opatrzonym etykietą z kodem
kreskowym, przeznaczonym do umieszczenia w tacce na odczynniki w automacie
do barwienia preparatów. Jeden zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania
75 testów:
Jedna fiolka (22 ml) odczynnika Alcian Blue zawiera 1,2% roztwór błękitu alcjanowego
w 3% roztworze kwasu octowego.
Jedna (1) wkładka do fiolki z rurką do zasysania.
Nie jest wymagane odtwarzanie, mieszanie, rozcieńczanie ani miareczkowanie
odczynników z zestawu. Dodatkowe rozcieńczenie któregokolwiek z odczynników może
spowodować, że jakość barwienia będzie niezadowalająca. W razie zmian któregokolwiek
z parametrów konieczne jest przeprowadzenie walidacji przez użytkownika.
Odczynniki w tym zestawie rozcieńczono optymalnie pod kątem użycia w automatach
do barwienia preparatów BenchMark Special Stains i NexES Special Stains. Odczynnik
ten może okazać się nieodpowiedni do barwienia ręcznego lub barwienia w innych
urządzeniach.
Materiały i odczynniki wymagane, ale niedostarczane
FT0700-440d
Pobieranie próbek i przygotowywanie ich do analizy
Firma Ventana zaleca, aby pobieranie i przechowywanie próbek odbywało się zgodnie
z dokumentem CLSI o symbolu M29-T2.3 Zalecanym utrwalaczem do tkanek jest 10%
roztwór obojętnej zbuforowanej formaliny.4
1.
Pociąć materiał na skrawki, zwykle o grubości od 3 do 5 µm i umieścić je na
szkiełkach.
2.
Wysuszyć preparaty w automacie do barwienia preparatów BenchMark Special
Stains lub poza nim za pomocą innej metody.

W przypadku suszenia preparatów za pomocą automatu do barwienia
preparatów BenchMark Special Stains przejść do etapu 3.

Poza automatem do barwienia suszyć preparaty przez co najmniej 30 minut
w temperaturze około 70°C. Odczekać, aż ostygną.
3.
Wydrukować odpowiednie etykiety z kodami kreskowymi.
4.
Przed odparafinowaniem umieścić na matowym końcu każdego szkiełka
odpowiednią etykietę z kodem kreskowym (informacje nt. prawidłowego
umieszczania etykiet zawiera instrukcja obsługi automatu do barwienia preparatów).
5.
Zalecany protokół barwienia za pomocą automatów do barwienia preparatów
BenchMark Special Stains oraz NexES Special Stains znajduje się w części
„Instrukcja stosowania”.
1.
2.
3.
4.
5.
Tkanka kontrolna
Szkiełka mikroskopowe (naładowane dodatnio)
Suszarka umożliwiająca utrzymanie temperatury 70C  5C
2013-02-05
Zestaw Alcian Blue for PAS Staining Kit należy przechowywać w temperaturze 15–30°C.
Informacje o prawidłowych warunkach przechowywania podano na etykiecie. Schłodzone
składniki zestawu należy przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej.
Prawidłowo przechowywane odczynniki pozostają stabilne do daty ważności
wydrukowanej na etykiecie fiolki. Nie istnieją widoczne objawy wskazujące na utratę
stabilności odczynników, dlatego równocześnie z badaniem właściwych próbek należy
wykonywać barwienia kontrolne. Słabe wybarwienie materiału kontroli pozytywnej może
świadczyć o niestabilności odczynnika. W takim wypadku należy niezwłocznie
skontaktować się z lokalnym przedstawicielem pomocy technicznej.
OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
Odtwarzanie, mieszanie, rozcieńczanie, miareczkowanie
1.
2.
3.
Automat do barwienia preparatów BenchMark Special Stains lub NexES
Special Stains
5.
Odczynniki w opakowaniach zbiorczych przeznaczone do użytku z automatem
do barwienia preparatów BenchMark Special Stains:

BenchMark Special Stains Deparaffinization Solution (10X)

BenchMark Special Stains Liquid Coverslip

BenchMark Special Stains Wash Solution (10X)
6.
Odczynniki w opakowaniach zbiorczych przeznaczone do użytku z automatem
do barwienia preparatów NexES Special Stains:

Liquid Coverslip (Low Temperature)

Special Stains Wash (10X)
7.
Zestaw do barwienia PAS Staining Kit (860-014/05279291001)
8.
Zestaw do barwienia Diastase Staining Kit (860-004/05279208001)
9.
Ksylen lub inny odczynnik do prześwietlania (klasy histologicznej)
10. Alkohol do odczynników lub etanol (klasy histologicznej)
11. Woda dejonizowana lub destylowana
12. Syntetyczny środek do zatapiania
13. Szkiełko nakrywkowe
Przechowywanie i sposób postępowania
1/3
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Aby uzyskać informacje na temat zalecanej metody utylizacji produktu, należy
skontaktować się z władzami lokalnymi i/lub wojewódzkimi.
Materiały pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego należy traktować jak materiały
stanowiące zagrożenie biologiczne i utylizować z zachowaniem właściwych środków
ostrożności. Podczas pracy z próbkami i przy ich usuwaniu należy stosować
standardowe środki ostrożności w postępowaniu z materiałami potencjalnie
zakaźnymi.
Należy unikać skażenia mikrobiologicznego odczynników. Skażenie takie może być
przyczyną błędnych wyników.
Odczynnik może powodować podrażnienia. Należy unikać kontaktu z oczami
I błonami śluzowymi. Jeśli dojdzie do kontaktu odczynnika z tymi obszarami, należy
obficie opłukać je wodą. Nie należy połykać ani wdychać żadnego z odczynników.
15104PL Rev F
6.
Aby uzyskać uzupełniające informacje o bezpieczeństwie, należy zapoznać się
z kartą charakterystyki produktu oraz instrukcją o frazach ryzyka zamieszczonych
na stronie www.ventana.com.
Tabela 2. Zalecany protokół barwienia za pomocą zestawu Alcian Blue for PAS Staining
Kit (procedura PAS Flex) z użyciem automatu do barwienia preparatów NexES Special
Stains.
INSTRUKCJA STOSOWANIA
Opcje
Przygotowanie fiolki z odczynnikiem
Temperatura
37°C lub 60°C
Przed pierwszym użyciem w fiolce z odczynnikiem należy umieścić wkładkę i rurkę
do zasysania.
1.
Zdjąć korek transportowy z fiolki i włożyć do fiolki wkładkę i rurkę. Wkładkę i rurkę
do zasysania pozostawić w fiolce po jej otwarciu.
2.
Gdy dany odczynnik jest używany, włożyć miękką nasadkę do otworu w uchwycie
na odczynniki.
3.
Gdy odczynnik nie jest używany, użyć miękkiej nasadki do przykrycia fiolki.
Procedura barwienia
Odczynnik
Alcian Blue
1.
2.
3.
Załadować odczynniki i preparaty do automatu.
Przeprowadzić cykl barwienia zgodnie z zalecanym protokołem barwienia (zobacz
Tabela 1 lub Tabela 2) i niniejszą instrukcją obsługi.
Po zakończeniu cyklu wyjąć preparaty z automatu.
Diastase
Hematoxylin
Light Green
Czas reakcji z odczynnikiem
Schiffa dla temp. 60°C
od 4 do 8 minut
Czas reakcji z odczynnikiem
Diastase
od 4 do 32 minut
Intensywność barwienia
hematoksyliną
Jasne lub ciemne
Zalecany protokół barwienia
Protokół wstępnego programowania
Parametry procedur zautomatyzowanych mogą być wyświetlane, drukowane i edytowane
zgodnie z procedurą opisaną w Instrukcji obsługi urządzenia.
Opisane poniżej procedury mogą być stosowane do tkanek o różnej grubości i różnym
rozmiarze oraz mogą być dostosowane do preferencji użytkownika. Wskazane jest próbne
wykonanie barwienia przy użyciu poszczególnych protokołów w celu dostosowania
barwienia do preferencji użytkownika.
Wybranie opcji wyszczególnionych w Tabeli 1 protokołu umożliwia włączenie funkcji
odparafinowania i suszenia w automacie BenchMark Special Stains.
Tabela 1. Zalecany protokół barwienia za pomocą zestawu Alcian Blue for PAS Staining
Kit z użyciem automatu do barwienia preparatów BenchMark Special Stains i protokołu
PAS.
Protokoły dla temp. 37°C
Numer protokołu rozpoczyna się
sekwencją 3XX
Protokoły dla temp. 60°C
Numer protokołu rozpoczyna się
sekwencją 6XX lub 7XX
Krok protokołu
Wybór opcji odparafinowania pozwala
automatyczne usunąć parafinę.
Suszenie
Aby włączyć suszenie, należy wybrać
temperaturę i czas inkubacji.
Alcian Blue
Należy wybrać, aby włączyć opcje Alcian Blue.
Diastase for PAS AB
(PAS Diastase)
OPCJONALNIE
Należy wybrać opcję Zoptymalizuj diastazę dla
PAS AB, a następnie wybrać czas inkubacji
z zakresu od 4 do 16 minut. Intensywność
wybarwienia będzie różna w zależności od
czasu inkubacji.
Optymalizacja intensywności
barwienia
(PAS Alcian Blue)
Należy wybrać czas inkubacji z zakresu od
8 do 16 minut:

8 minut, jaśniejsze niebieskie
wybarwienie mukosubstancji

16 minut, ciemniejsze niebieskie
wybarwienie mukosubstancji
Hematoksylina dla błękitu
alcjańskiego
(opcjonalnie: PAS
Hematoxylin)
Należy wybrać czas inkubacji z zakresu od
4 do 12 minut:

4 minuty, jaśniejsze wybarwienie
kontrastowe

12 minut, ciemniejsze wybarwienie
kontrastowe
Brak barwnika
kontrastowego
Jeśli barwnik kontrastowy Hematoxylin
Counterstain nie jest wymagany, nie należy
wybierać kroku Hematoksylina dla błękitu
alcjańskiego.
2013-02-05
FT0700-440d
1.
2.
Usunąć płynne szkiełko nakrywkowe, płucząc preparaty w dwóch zmianach 95%
alkoholu.
Odwodnić, oczyścić i nakryć środkiem do trwałego zatapiania.
PROCEDURY KONTROLI JAKOŚCI
Metoda
Odparafinowanie
Zalecana obróbka po wyjęciu z automatu
W charakterze materiału kontroli pozytywnej można użyć na przykład utrwalonej
w formalinie i zatopionej w parafinie tkanki ludzkiej zawierającej kwaśne mucyny
i obojętne polisacharydy (jelita grubego, jelita cienkiego lub ślinianek).4 Tkanki kontrolne
powinny być próbkami świeżo pobranymi w ramach autopsji, biopsji lub operacji
chirurgicznej i przygotowanymi lub utrwalonymi jak najszybciej w sposób identyczny jak
skrawki badane. Tkanki takie powinny być równolegle poddawane wszystkim etapom
analizy, od przygotowania do barwienia.
Zastosowanie skrawków tkankowych utrwalonych lub obrabianych w inny sposób niż
preparaty badane umożliwia kontrolę działania wszystkich odczynników i etapów
procedury z wyjątkiem utrwalania i obróbki tkanek. Składniki komórkowe innych
elementów tkanek mogą pełnić rolę kontroli negatywnej.
Tkanka kontrolna musi być testowana w każdym cyklu barwienia.
Zestaw Alcian Blue for PAS Staining Kit jest fabrycznie testowany w celu wykazania, że
w przypadku używania wraz z zestawem PAS Staining Kit kwaśna mucyna daje odczyn
jaskrawoniebieski, obojętne polisacharydy dają odczyn jaskrawoamarantowy, natomiast
jądra — jasnobłękitny.
Znane dodatnie kontrole tkankowe powinny być stosowane wyłącznie w celu
monitorowania jakości badanych tkanek i odczynników testowych, a nie do diagnozowania
próbek pochodzących od pacjentów.
Jeżeli nie udaje się potwierdzić dodatniego wybarwienia w preparatach dodatnich kontroli
tkankowych, należy uznać, że wyniki uzyskane dla preparatów testowych są nieważne.
Jeżeli w kontrolach negatywnych uzyskuje się wynik pozytywny, należy uznać, że wyniki
preparatów testowych są nieważne.
Niewyjaśnione rozbieżności w wynikach kontroli należy niezwłocznie zgłaszać
dolokalnego przedstawiciela pomocy technicznej. Jeżeli wyniki kontroli jakości nie są
zgodne ze specyfikacją, wyniki uzyskane dla preparatów z próbek pochodzących od
pacjentów są nieważne. Należy zidentyfikować i wyeliminować przyczynę, a następnie
ponownie zbadać preparaty z próbek pochodzących od pacjentów.
2/3
15104PL Rev F
OGRANICZENIA
PIŚMIENNICTWO
Ograniczenia ogólne
1.
1.
2.
3.
Wykonywanie odczynów histologicznych jest wieloetapowym procesem
diagnostycznym wymagającym specjalistycznego przeszkolenia w doborze
odpowiednich odczynników, wyborze tkanek, utrwalaniu i obróbce, przygotowaniu
preparatów i interpretacji wyników barwienia.
Wybarwienie tkanek zależy od sposobu obróbki i przetworzenia tkanek przed
barwieniem. Różnice w sposobie obróbki preparatów tkankowych i procedurach
technicznych mogą być przyczyną znacznego zróżnicowania wyników, dlatego
wymagane jest regularne wykonywanie barwień kontrolnych (zobacz część
„Procedury kontroli jakości”). Nieprawidłowe utrwalanie, zamrażanie, rozmrażanie,
przemywanie, suszenie, ogrzewanie, wykonywanie skrawków lub ich
zanieczyszczenie domieszką innych tkanek lub płynów może powodować artefakty
lub wyniki fałszywie ujemne.
Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego wyniku musi być prowadzona
w kontekście historii klinicznej, morfologii i innych kryteriów histopatologicznych.
Odpowiedzialność za zapoznanie się ze specjalnym barwnikiem oraz metodami
przygotowania preparatu spoczywa na wykwalifikowanym patologu. Barwienie
należy wykonać w akredytowanej pracowni histopatologicznej, pod nadzorem
histopatologa odpowiedzialnego za przeglądanie i ocenę wybarwionych preparatów
oraz właściwe wykonanie dodatnich i negatywnych prób kontrolnych.
CHARAKTERYSTYKA DZIAŁANIA
Automat do barwienia preparatów BenchMark Special Stains
1.
2.
3.
Powtarzalność między automatami: 100 preparatów tkanki jelita grubego
wybarwiono za pomocą 5 różnych automatów do barwienia preparatów BenchMark
Special Stains i zestawu Alcian Blue for PAS Staining Kit. Wybarwienie preparatów
oceniano wg kryteriów zaliczenia/niezaliczenia. Wyniki nie wykazały istotnej różnicy
w wybarwieniu poszczególnych preparatów.
Powtarzalność między cyklami barwienia: 100 preparatów tkanki jelita grubego
wybarwiano za pomocą 5 automatów do barwienia preparatów BenchMark Special
Stains i zestawu Alcian Blue for PAS Staining Kit przez 5 nienastępujących po sobie
dni. Wybarwienie preparatów oceniano wg kryteriów zaliczenia/niezaliczenia. Wyniki
nie wykazały istotnej różnicy w wybarwieniu poszczególnych preparatów.
Przetestowano zgodność zestawu Alcian Blue for PAS Staining Kit z innymi
wybranymi odczynnikami do barwienia. Nie odnotowano żadnych szkodliwych
interakcji chemicznych.
2.
3.
4.
Hotchkiss RD. A microchemical reaction resulting in the staining of polysaccharide
structures in fixed tissue preparations. Arch Biochem. 1948; 16:131-141.
Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and Practice of Histotechnology. 2nd edition.
St. Louis, MO: C.V. Mosby Company; 1980.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). CLSI Web site:
http://www.clsi.org/. Accessed November 3, 2011.
Carson F, Hladik C. Histotechnology: A Self Instructional Text, 3rd edition.
Hong Kong: American Society for Clinical Pathology Press; 2009.
WŁASNOŚĆ INTELEKTUALNA
BENCHMARK, NexES, VENTANA oraz logo VENTANA są znakami towarowymi grupy
Roche.
© 2013 Ventana Medical Systems, Inc.
DANE TELEADRESOWE
Ventana Medical Systems, Inc.
1910 E. Innovation Park Drive
Tucson, Arizona 85755
USA
+1 520 887 2155
+1 800 227 2155 (USA)
www.ventana.com
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Strasse 116
D-68305 Mannheim
Germany
Automat do barwienia preparatów NexES Special Stains
1.
2.
Powtarzalność w ramach jednej serii wyników uzyskanych przy użyciu zestawu
Alcian Blue for PAS Staining Kit określono poprzez wykonanie barwień na
180 preparatach pochodzących z 6 bloczków tkanki przełyku Barretta, 2 bloczków
tkanki jelita grubego i 2 bloczków tkanki jelita cienkiego. Oceniono wydajność
wybarwienia preparatów, zróżnicowanie rodzajów mucyny (całkowity obszar
pokrycia i jakość wybarwienia) oraz wybarwienie kontrastowe wg kryteriów
zaliczenia/niezaliczenia. Wyniki pokazały, że w przypadku 180/180 preparatów
uzyskano wydajność zgodną z kryteriami.
Powtarzalność między seriami wyników uzyskanych przy użyciu zestawu Alcian
Blue for PAS Staining Kit określono na podstawie barwień 20 preparatów w serii
w 3 automatach (po 1 serii w każdym z automatów). Oceniono wydajność
wybarwienia preparatów, zróżnicowanie rodzajów mucyny oraz wybarwienie
kontrastowe wg kryteriów zaliczenia/niezaliczenia. Wyniki nie wykazały istotnej
różnicy w wybarwieniu poszczególnych preparatów.
ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW
1.
2.
3.
Grubość skrawków może mieć wpływ na jakość i wybarwienie preparatu.
W przypadku nieprawidłowego wybarwienia preparatów należy skontaktować się
z lokalnym przedstawicielem pomocy technicznej.
W tkankach martwiczych lub autolizowanych może występować nieswoisty odczyn
barwny.
Jeśli kontrola pozytywna nie daje prawidłowego wybarwienia, należy sprawdzić, czy
preparat jest opatrzony właściwym kodem kreskowym i prawidłowo wprowadzony
do automatu. Jeśli kod kreskowy jest poprawny, ale brak jest wybarwienia lub
wybarwienie jest nieprawidłowe, należy skontaktować się z lokalnym
przedstawicielem pomocy technicznej.
2013-02-05
FT0700-440d
3/3
15104PL Rev F