Iron Staining Kit

Odtwarzanie, mieszanie, rozcieńczanie, miareczkowanie
Iron Staining Kit
Nie jest wymagane odtwarzanie, mieszanie, rozcieńczanie ani miareczkowanie.
Dodatkowe rozcieńczenie któregokolwiek z odczynników może spowodować, że jakość
barwienia będzie niezadowalająca. W razie zmian któregokolwiek z parametrów
konieczne jest przeprowadzenie walidacji przez użytkownika.
860-009
05279259001
Odczynniki w tym zestawie rozcieńczono optymalnie pod kątem użycia w automatach
do barwienia preparatów BenchMark Special Stains i NexES Special Stains. Odczynniki
te mogą okazać się nieodpowiednie do barwienia ręcznego lub barwienia w innych
urządzeniach.
75
PRZEZNACZENIE
Zestaw do barwienia Iron Staining Kit jest przeznaczony do wykonywania barwień
histologicznych o charakterze jakościowym w celu wykrycia obecności barwnika
zawierającego żelazo w szpiku kostnym oraz utrwalonych w formalinie i zatopionych
w parafinie tkankach dotkniętych hemochromatozą i hemosyderozą.
Materiały i odczynniki wymagane, ale niedostarczane
Wynik powinien zostać zinterpretowany przez wykwalifikowanego patologa w połączeniu
z badaniem histologicznym, odnośnymi danymi klinicznymi i właściwymi badaniami
kontrolnymi.
1.
2.
3.
4.
5.
Ten produkt jest przeznaczony do stosowania w diagnostyce in vitro.
PODSUMOWANIE I OBJAŚNIENIA
Tkanka kontrolna
Szkiełka mikroskopowe (naładowane dodatnio)
Suszarka umożliwiająca utrzymanie temperatury 70°C ± 5°C
Automat do barwienia preparatów BenchMark Special Stains lub NexES Special
Stains
Odczynniki w opakowaniach zbiorczych przeznaczone do użytku z automatem
do barwienia preparatów BenchMark Special Stains:

BenchMark Special Stains Deparaffinization Solution (10X)
Żelazo jest wchłaniane w jelicie cienkim i transportowane do szpiku kostnego. Jest ono

BenchMark Special Stains Liquid Coverslip
tam przechowywane jako hemosyderyna do czasu erytropoezy, podczas której zostaje

BenchMark Special Stains Wash Solution (10X)
włączone do cząsteczek hemoglobiny. Podczas rozpadu erytrocytów pod koniec ich cyklu
Odczynniki w opakowaniach zbiorczych przeznaczone do użytku z automatem
życiowego żelazo jest odłączane od hemoglobiny w układzie limforetikularnym i ponownie 6.
do barwienia preparatów NexES Special Stains:
przechowywane w szpiku kostnym jako hemosyderyna. Hemochromatoza i hemosyderoza
to stany chorobowe, podczas których w wątrobie, śledzionie i węzłach chłonnych obecna

Liquid Coverslip (Low Temperature)
jest zbyt duża ilość żelaza trójwartościowego. Żelazo może występować w każdym

Special Stains Wash (10X)
miejscu, w którym nastąpił miejscowy rozpad czerwonych krwinek, takim jak miejsce
krwotoku, martwicy niedokrwiennej, stałego przekrwienia czy urazu.
7.
Ksylen lub inny odczynnik do prześwietlania (klasy histologicznej)
8.
Alkohol do odczynników lub etanol (klasy histologicznej)
Zestaw Iron Staining Kit wykrywa obecność żelaza trójwartościowego w tkance. Ta
metoda barwienia żelaza polega na tradycyjnej reakcji z błękitem pruskim (Prussian Blue) 9.
Woda dejonizowana lub destylowana
zmodyfikowanej uprzednio przez Gomoriego1, Perlsa2 i Mallory'ego1. Żelazo jest
10. Syntetyczny środek do zatapiania
odłączane od białka przy użyciu kwasu solnego. Wolne jony żelaza trójwartościowego
11. Szkiełko nakrywkowe
wchodzą w reakcję z żelazocyjankiem potasu, tworząc nierozpuszczalny
Przechowywanie i sposób postępowania
jaskrawoniebieski żelazocyjanek żelaza, czyli błękit pruski. W celu uzyskania
kontrastującego różowego lub czerwonego tła stosuje się barwnik kontrastowy Nuclear
Zestaw Iron Staining Kit należy przechowywać w temperaturze 15–30°C. Informacje
Fast Red Counterstain.
o prawidłowych warunkach przechowywania podano na etykiecie fiolki.
ZASADY PROCEDURY
Niniejszy zestaw jest zoptymalizowany pod kątem użycia w automatach do barwienia
preparatów BenchMark Special Stains oraz NexES Special Stains firmy VENTANA.
Odczynniki nanoszone są na tkankę umieszczoną na szkiełku mikroskopowym i mieszane
na całej powierzchni preparatu. Reakcja barwna polega na reakcji z błękitem pruskim.
Wchodzące w skład zestawu Iron Staining Kit odczynniki Iron Reagent A i Iron Reagent
B tworzą kwaśny żelazocyjanek, który wchodzi w reakcję z zawartymi w tkance jonami
żelaza, dając jaskrawoniebieskie zabarwienie. W celu uzyskania kontrastującego
różowego lub czerwonego tła stosuje się barwnik kontrastowy Nuclear Fast Red
Counterstain.
Prawidłowo przechowywane odczynniki pozostają stabilne do daty ważności
wydrukowanej na etykiecie fiolki. Nie istnieją widoczne objawy wskazujące na utratę
stabilności odczynników, dlatego równocześnie z badaniem właściwych próbek należy
wykonywać barwienia kontrolne. Słabe wybarwienie materiału kontroli pozytywnej może
świadczyć o niestabilności odczynnika. W takim wypadku należy niezwłocznie
skontaktować się z lokalnym przedstawicielem pomocy technicznej.
Pobieranie próbek i przygotowywanie ich do analizy
Firma Ventana zaleca, aby pobieranie i przechowywanie próbek odbywało się zgodnie
z dokumentem CLSI o symbolu M29-T2.3 Zalecanym utrwalaczem do tkanek jest 10%
roztwór obojętnej zbuforowanej formaliny.4
MATERIAŁY I METODY
1.
Dostarczane odczynniki
2.
Fiolki z odczynnikami są dostarczane w uchwytach opatrzonych etykietami z kodem
kreskowym, przeznaczonych do umieszczenia w tackach na odczynniki w automacie
do barwienia preparatów. Jeden zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania
75 testów.
Jedna fiolka (22 ml) odczynnika Iron Reagent A zawiera 10% roztwór żelazocyjanku
potasu.
Jedna fiolka (22 ml) odczynnika Iron Reagent B zawiera kwas solny o stężeniu poniżej
2%.
Jedna fiolka (22 ml) odczynnika Nuclear Fast Red Counterstain zawiera <1% barwnika
Nuclear Fast Red i 5% siarczanu glinu.
3.
4.
Pociąć materiał na skrawki, zwykle o grubości od 3 do 5 µm i umieścić je na
szkiełkach.
Wysuszyć preparaty w automacie do barwienia preparatów BenchMark Special
Stains lub poza nim za pomocą innej metody.

W przypadku suszenia preparatów za pomocą automatu do barwienia
preparatów BenchMark Special Stains przejść do etapu 3.

Poza automatem do barwienia suszyć preparaty przez co najmniej 30 minut
w temperaturze około 70°C. Odczekać, aż ostygną.
Wydrukować odpowiednie etykiety z kodami kreskowymi.
Przed odparafinowaniem umieścić na matowym końcu każdego szkiełka
odpowiednią etykietę z kodem kreskowym (informacje nt. prawidłowego
umieszczania etykiet zawiera instrukcja obsługi automatu do barwienia preparatów).
Trzy (3) wkładki do fiolek z rurkami do zasysania.
2012-07-10
FT0700-440d
1/3
15109PL Rev F
Tabela 1. Zalecany protokół barwienia za pomocą zestawu Iron Staining Kit z użyciem
automatu do barwienia preparatów BenchMark Special Stains.
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Krok protokołu
Metoda
Aby uzyskać informacje na temat zalecanej metody utylizacji produktu, należy
skontaktować się z władzami lokalnymi i/lub wojewódzkimi.
Odparafinowanie
Wybranie opcji odparafinowania pozwala
Materiały pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego należy traktować jak materiały
automatyczne usunąć parafinę.
stanowiące zagrożenie biologiczne i utylizować z zachowaniem właściwych środków
ostrożności. Podczas pracy z próbkami i przy ich usuwaniu należy stosować
Suszenie
Aby włączyć suszenie, należy wybrać
standardowe środki ostrożności w postępowaniu z materiałami potencjalnie
temperaturę i czas inkubacji.
zakaźnymi.
Optymalizacja
Należy wybrać czas inkubacji z zakresu od
Należy unikać skażenia mikrobiologicznego odczynników. Skażenie takie może być
intensywności barwienia
4 do 16 minut:
przyczyną błędnych wyników.
(Nuclear Fast Red

4 minuty, jaśniejsze wybarwienie
Odczynniki te mogą powodować podrażnienia. Należy unikać kontaktu z oczami
Counterstain)
kontrastowe
I błonami śluzowymi. Jeśli dojdzie do kontaktu odczynnika z tymi obszarami, należy
obficie opłukać je wodą. Nie należy połykać ani wdychać żadnego z odczynników.

16 minut, ciemniejsze wybarwienie
Odczynnik Iron Reagent B zawiera kwas solny, który jest substancją żrącą i mogącą
kontrastowe
wywoływać ciężkie poparzenia.
Odczynnik Nuclear Fast Red Counterstain jest substancją drażniącą i może działać
drażniąco na oczy.
Tabela 2. Zalecany protokół barwienia za pomocą zestawu Iron Staining Kit (procedura
Iron Flex) z użyciem automatu do barwienia preparatów NexES Special Stains.
Nadmierna ekspozycja na żelazocyjanek potasu może doprowadzić do cyjanozy.
Aby uzyskać uzupełniające informacje o bezpieczeństwie, należy zapoznać się
Typ procedury
Metoda
z kartą charakterystyki produktu oraz instrukcją o frazach ryzyka zamieszczonych
1.
Odparafinować i uwodnić preparaty, postępując wg
Odparafinowanie
na stronie www.ventana.com.
procedur zalecanych w danym laboratorium.
OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
2.
INSTRUKCJA STOSOWANIA
Przygotowanie fiolki z odczynnikiem
Przed pierwszym użyciem w fiolce z odczynnikiem należy umieścić wkładkę i rurkę
do zasysania.
1.
2.
3.
Zdjąć korek transportowy z fiolki i włożyć do fiolki wkładkę i rurkę. Wkładkę i rurkę
do zasysania pozostawić w fiolce po jej otwarciu.
Gdy dany odczynnik jest używany, włożyć miękką nasadkę do otworu w uchwycie
na odczynniki.
Gdy odczynnik nie jest używany, użyć miękkiej nasadki do przykrycia fiolki.
Procedura barwienia
1.
2.
3.
Załadować odczynniki i preparaty do automatu.
Przeprowadzić cykl barwienia zgodnie z zalecanym protokołem barwienia (zobacz
Tabela 1 lub Tabela 2) i niniejszą instrukcją obsługi.
Po zakończeniu cyklu wyjąć preparaty z automatu.
Umieścić szkiełka z preparatami tkankowymi
w roztworze Special Stains Wash Solution (1X)
do czasu, aż zostaną umieszczone w automacie.
Zaleca się załadowanie preparatów do automatu
przed upływem jednej godziny. Jeśli nie jest to
możliwe, preparaty można pozostawić w wodzie
dejonizowanej lub destylowanej na maksymalnie
24 godziny, pod warunkiem, że preparaty zostaną
umieszczone w lodówce i nie wyschną.
Opcje
Temperatura
37°C lub 60°C
Barwienie
kontrastowe
Jasne lub ciemne
Protokół wstępnego programowania
Protokoły dla
temp. 37°C
Numer protokołu rozpoczyna się sekwencją 3XX
Zalecany protokół barwienia
Parametry procedur zautomatyzowanych mogą być wyświetlane, drukowane i edytowane
zgodnie z procedurą opisaną w Instrukcji obsługi urządzenia.
Protokoły dla
temp. 60°C
Numer protokołu rozpoczyna się sekwencją 6XX
Opisane poniżej procedury mogą być stosowane do tkanek o różnej grubości i różnym
rozmiarze oraz mogą być dostosowane do preferencji użytkownika. Wskazane jest próbne
wykonanie barwienia przy użyciu poszczególnych protokołów w celu dostosowania
barwienia do preferencji użytkownika.
Zalecana obróbka po wyjęciu z automatu
Wybranie opcji wyszczególnionych w Tabeli 1 protokołu umożliwia włączenie funkcji
odparafinowania i suszenia w automacie BenchMark Special Stains.
2.
1.
Usunąć płynne szkiełko nakrywkowe, płucząc preparaty w dwóch zmianach 95%
alkoholu.
Odwodnić, oczyścić i nakryć środkiem do trwałego zatapiania.
PROCEDURY KONTROLI JAKOŚCI
W charakterze materiału kontroli pozytywnej można użyć na przykład utrwalonej
w formalinie i zatopionej w parafinie tkanki ludzkiej zawierającej żelazo we wnętrzu
komórek lub przestrzeni międzykomórkowej (wątroby, szpiku kostnego lub śledziony).4
Tkanki kontrolne powinny być próbkami świeżo pobranymi w ramach autopsji, biopsji lub
operacji chirurgicznej i przygotowanymi lub utrwalonymi jak najszybciej w sposób
identyczny jak skrawki badane. Tkanki takie powinny być równolegle poddawane
wszystkim etapom analizy, od przygotowania do barwienia.
2012-07-10
FT0700-440d
2/3
15109PL Rev F
Zastosowanie skrawków tkankowych utrwalonych lub obrabianych w inny sposób niż
preparaty badane umożliwia kontrolę działania wszystkich odczynników i etapów
procedury z wyjątkiem utrwalania i obróbki tkanek. Składniki komórkowe innych
elementów tkanek mogą pełnić rolę kontroli negatywnej.
Automat do barwienia preparatów NexES Special Stains
1.
Tkanka kontrolna musi być testowana w każdym cyklu barwienia.
Zestaw Iron Staining Kit jest fabrycznie testowany w celu potwierdzenia, że barwnik
zawierający żelazo w tkance daje odczyn jaskrawoniebieski. Duże złogi żelaza mają kolor
ciemnoniebieski. Cytoplazma wybarwia się na różowo, a jądra — na różowo lub
czerwono.
2.
Znane dodatnie kontrole tkankowe powinny być stosowane wyłącznie w celu
monitorowania jakości badanych tkanek i odczynników testowych, a nie do diagnozowania
próbek pochodzących od pacjentów.
Powtarzalność w ramach jednej serii wyników uzyskanych przy użyciu zestawu Iron
Staining Kit określono poprzez wykonanie barwień na 100 preparatach z 8 różnych
bloczków tkanki wątroby. Oceniono wydajność wybarwienia preparatów (ogólne
pokrycie i jakość wybarwienia), przydatność diagnostyczną (możliwość stwierdzenia
stanu choroby na podstawie wybarwienia), tło i wybarwienie kontrastowe wg
kryteriów zaliczenia/niezaliczenia. Wyniki pokazały, że w przypadku
100/100 preparatów uzyskano wydajność zgodną z kryteriami.
Powtarzalność między seriami wyników uzyskanych przy użyciu zestawu Iron
Staining Kit określono na podstawie barwień 20 preparatów w serii w 5 automatach
(po 1 serii w każdym z automatów). Oceniono wydajność wybarwienia preparatów,
przydatność diagnostyczną, tło i wybarwienie kontrastowe wg kryteriów
zaliczenia/niezaliczenia. Wyniki nie wykazały istotnej różnicy w wybarwieniu
poszczególnych preparatów.
Jeżeli nie udaje się potwierdzić dodatniego wybarwienia w preparatach dodatnich kontroli
tkankowych, należy uznać, że wyniki uzyskane dla preparatów testowych są nieważne.
Jeżeli w kontrolach negatywnych uzyskuje się wynik pozytywny, należy uznać, że wyniki
preparatów testowych są nieważne.
ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW
Niewyjaśnione rozbieżności w wynikach kontroli należy niezwłocznie zgłaszać do
lokalnego przedstawiciela pomocy technicznej. Jeżeli wyniki kontroli jakości nie są zgodne
ze specyfikacją, wyniki uzyskane dla preparatów z próbek pochodzących od pacjentów są
nieważne. Należy zidentyfikować i wyeliminować przyczynę, a następnie ponownie
zbadać preparaty z próbek pochodzących od pacjentów.
2.
1.
3.
OGRANICZENIA
Ograniczenia ogólne
1.
2.
3.
Wykonywanie odczynów histologicznych jest wieloetapowym procesem
diagnostycznym wymagającym specjalistycznego przeszkolenia w doborze
odpowiednich odczynników, wyborze tkanek, utrwalaniu i obróbce, przygotowaniu
preparatów i interpretacji wyników barwienia.
Wybarwienie tkanek zależy od sposobu obróbki i przetworzenia tkanek przed
barwieniem. Różnice w sposobie obróbki preparatów tkankowych i procedurach
technicznych mogą być przyczyną znacznego zróżnicowania wyników, dlatego
wymagane jest regularne wykonywanie barwień kontrolnych (zobacz część
dotyczącą kontroli jakości). Nieprawidłowe utrwalanie, zamrażanie, rozmrażanie,
przemywanie, suszenie, ogrzewanie, wykonywanie skrawków lub ich
zanieczyszczenie domieszką innych tkanek lub płynów może powodować artefakty
lub wyniki fałszywie ujemne.
Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego wyniku musi być prowadzona
w kontekście historii klinicznej, morfologii i innych kryteriów histopatologicznych.
Odpowiedzialność za zapoznanie się ze specjalnym barwnikiem oraz metodami
przygotowania preparatu spoczywa na wykwalifikowanym patologu. Barwienie
należy wykonać w akredytowanej pracowni histopatologicznej, pod nadzorem
histopatologa odpowiedzialnego za przeglądanie i ocenę wybarwionych preparatów
oraz właściwe wykonanie dodatnich i negatywnych prób kontrolnych.
CHARAKTERYSTYKA DZIAŁANIA
Automat do barwienia preparatów BenchMark Special Stains
1.
2.
3.
Powtarzalność między automatami: 100 preparatów tkanki wątroby zawierającej
żelazo wybarwiono za pomocą 5 różnych automatów do barwienia preparatów
BenchMark Special Stains i zestawu Iron Staining Kit. Wybarwienie preparatów
oceniano wg kryteriów zaliczenia/niezaliczenia. Wyniki nie wykazały istotnej różnicy
w wybarwieniu poszczególnych preparatów.
Powtarzalność między cyklami barwienia: 100 preparatów tkanki wątroby
zawierającej żelazo wybarwiano za pomocą 5 automatów do barwienia preparatów
BenchMark Special Stains i zestawu Iron Staining Kit przez 5 nienastępujących
po sobie dni. Wybarwienie preparatów oceniano wg kryteriów
zaliczenia/niezaliczenia. Wyniki nie wykazały istotnej różnicy w wybarwieniu
poszczególnych preparatów.
Przetestowano zgodność zestawu Iron Staining Kit z innymi wybranymi
odczynnikami do barwienia. Nie odnotowano żadnych szkodliwych interakcji
chemicznych.
2012-07-10
FT0700-440d
3/3
Grubość skrawków może mieć wpływ na jakość i wybarwienie preparatu.
W przypadku nieprawidłowego wybarwienia preparatów należy skontaktować się
z lokalnym przedstawicielem pomocy technicznej.
W tkankach martwiczych lub autolizowanych może występować nieswoisty odczyn
barwny.
Jeśli kontrola pozytywna nie daje prawidłowego wybarwienia, należy sprawdzić, czy
preparat jest opatrzony właściwym kodem kreskowym i prawidłowo wprowadzony
do automatu. Jeśli kod kreskowy jest poprawny, ale brak jest wybarwienia lub
wybarwienie jest nieprawidłowe, należy skontaktować się z lokalnym
przedstawicielem pomocy technicznej.
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and Practice of Histotechnology. 2nd ed.
St. Louis, MO: C.V. Mosby Company; 1980:215-218.
Bancroft and Stevens. Theory and Practice of Histological Techniques, 2nd edition.
Edinburgh: Churchill-Livingston; 1982.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). CLSI Web site:
http://www.clsi.org/. Accessed November 3, 2011.
Carson F, Hladik C. Histotechnology: A Self Instructional Text, 3rd edition. Hong
Kong: American Society for Clinical Pathology Press; 2009.
WŁASNOŚĆ INTELEKTUALNA
BENCHMARK, NexES, VENTANA oraz logo Ventana są zastrzeżonymi znakami
towarowymi grupy Roche.
© 2012 Ventana Medical Systems, Inc.
DANE TELEADRESOWE
Ventana Medical Systems, Inc.
1910 E. Innovation Park Drive
Tucson, Arizona 85755
USA
+1 520 887 2155
+1 800 227 2155 (USA)
www.ventana.com
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Strasse 116
D-68305 Mannheim
Germany
15109PL Rev F