62798_Platelia Candida Ag - Bio-Rad

PLATELIA® TOXO IgM TMB
96 TESTÓW
72751
TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY
IgM PRZECIWKO TOXOPLASMA GONDII W LUDZKIEJ SUROWICY LUB
OSOCZU
Do diagnostyki in vitro
Wszystkie produkowane i wprowadzane do sprzedaży odczynniki są
przygotowywane zgodnie z systemem jakości, poczynając od materiałów
wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego.
Odczynniki każdej serii podlegają oznaczeniu kontrolnemu, i są dopuszczane do
użytkowania, jeśli spełniają wymagane kryteria.
Odpowiednie protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii są przechowywane
w firmie
1
SPIS TREŚCI
1 - ZASTOSOWANIE .......................................................................................................... 3
2 - ZNACZENIE KLINICZNE ............................................................................................. 3
3 - ZASADA TESTU............................................................................................................ 3
4 - SKŁAD ZESTAWU ........................................................................................................ 4
5 - ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA ........................................................................... 5
6 - INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT ............................................................. 7
7 - PRZYGOTOWANIE I PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIKÓW............................. 8
8 – POBIERANIE, OPRACOWYWANIE I PRZECHOWYWANIE MATERIAŁU DO
BADAŃ .................................................................................................................................. 9
9 - PROCEDURA ............................................................................................................... 10
10 - PROCEDURA AUTOMATYCZNA.......................................................................... 11
11 - OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW .................................................... 11
12 - CHARAKTERYSTYKA I OGRANICZENIA TESTU............................................. 13
13 – LITERATURA ............................................................................................................ 17
2
1 - ZASTOSOWANIE
Test Platelia® Toxo IgM TMB służy do jakościowego oznaczania in vitro
przeciwciał klasy IgM przeciwko Toxoplasma gondii w ludzkiej surowicy lub
osoczu.
2 - ZNACZENIE KLINICZNE
T. gondii jest pierwotniakiem wywołującym zakażenia u licznych gatunków
ssaków i ptaków. Toksoplazmoza występująca u ludzi i zwierząt przeważnie
przebiega bezobjawowo. Częstość występowania zakażeń w danej populacji,
wykrywanych metodami serologicznymi, waha się w różnych krajach i zależy od
wieku badanych.
Toksoplazmoza ciężarnych może powodować poważne zaburzenia rozwoju płodu
(zwłaszcza uszkodzenie funkcji mózgu), a czasami prowadzić do obumarcia
płodu. Wykrycie przeciwciał IgG przeciw T. gondii u kobiet przed zapłodnieniem
pozwala uzyskać pewność ochrony płodu przed zakażeniem wrodzonym, w
przypadku wystąpienia toksoplazmozy w czasie ciąży.
Skłonność do występowania toksoplazmozy o ostrym przebiegu występuje u
chorych z nabytym zespołem niedoboru odporności (AIDS) oraz u innych osób z
immunosupresją. Zakażenia te są najczęściej spowodowane reaktywacją cyst
pierwotniaka, obecnych w organizmie chorego przed zakażeniem wirusem HIV.
Diagnostyka zakażenia T. gondii może być skomplikowana, a izolacja pasożyta
jest rzadka. Serologiczne potwierdzenie występowania przeciwciał przeciwko T.
gondii świadczy o kontakcie z pasożytem i jest powszechnie akceptowane w celu
określenia statusu immunologicznego pacjenta i podatności na zakażenie.
Wykrywanie poszczególnych izotypów pomaga określić czas zakażenia T. gondii
i zastosowanie odpowiedniego leczenia w przypadku niedawnej infekcji lub
propozycję profilaktyki, obejmującej zalecenia higieniczno-dietetyczne dla kobiet
w ciąży lub chemioprofilaktykę pacjentów z upośledzoną odpornością.
3 - ZASADA TESTU
PLATELIA® Toxo IgM TMB jest pośrednim testem immunoenzymatycznym, w
którym na fazie stałej opłaszczone są przeciwciała przeciwko ludzkim łańcuchom
mu wiążące obecne w próbce przeciwciała klasy IgM. Koniugat stanowią
znakowane peroksydazą monoklonalne przeciwciała przeciw T.gondii,
skierowane przeciwko powierzchniowemu antygenowi białkowemu, PM 30 000,
który jest głównym celem immunologicznej odpowiedzi humoralnej.
Etap pierwszy
Rozcieńczenie próbek i inkubacja z przeciwciałami przeciwko ludzkim IgM,
związanym z fazą stałą. Podczas inkubacji przez 1 godzinę w temp. 37°C,
obecne w próbce przeciwciała klasy IgM zwiążą się z fazą stałą. Po inkubacji,
pozostałe immunoglobuliny (łącznie z IgG) i inne białka surowicy zostają usunięte
podczas płukania.
3
Etap drugi
Naniesienie do studzienek roztworu zawierającego antygen T.gondii i koniugat
(monoklonalne przeciwciała przeciwko T.gondii, znakowane peroksydazą).
Podczas inkubacji przez 1 godzinę w temp. 37°C, przeciwciała przeciwko
T.gondii, związane w poprzednim etapie, zwiążą teraz kompleks antygen
T.gondii-koniugat. Nadmiar antygenu i koniugatu zostaje usunięty podczas
płukania.
Etap trzeci
Wykrycie kompleksu: przeciwciało anty-IgM – przeciwciało swoiste anty-T.gondii
– antygen T.gondii – koniugat, następuje po dodaniu roztworu zawierającego
substrat dla peroksydazy i chromogen wywołujący reakcję barwną.
Etap czwarty
Po półgodzinnej inkubacji w temp. pokojowej, następuje zatrzymanie reakcji
enzymatycznej po dodaniu 1 N kwasu siarkowego. Gęstość optyczną odczytuje
się spektrofotometrycznie przy długości fali 450/620 nm. Uzyskana wartość OD
jest proporcjonalna do ilości przeciwciał IgM przeciwko T.gondii w badanej
próbce.
Poziom przeciwciał IgM przeciwko T.gondii w badanej próbce jest określany
przez porównanie OD próbki i OD surowicy wzorcowej cut-off.
4 - SKŁAD ZESTAWU
Wszystkie odczynniki są przeznaczone wyłącznie do diagnostyki in vitro.
Oznaczenie
Charakterystyka odczynnika
R1 Mikropłytka Mikropłytka: 12 pasków po 8 odłamywanych
studzienek opłaszczonych przeciwciałami
przeciwko ludzkim IgM.
R2 Stężony
roztwór
płuczący
Bufor do płukania: Bufor TRIS-NaCl pH 7.4, 1%
Tween® 20, stężony (10x)
R3 Kontrola
ujemna
Kontrola nie reaktywna: Bufor TRIS-NaCl (pH 8
± 0.2), albumina bydlęca, glicerol, E102, E122
cut-off
1 płytka
1 fiolka
100 ml
Konserwant: 0.01% thimerosal
Konserwant: < 0.5% Proclin® 300
R4a Kontrola
Opakowanie
Kontrola cut-off: Ludzka surowica, słabo
dodatnia pod względem przeciwciał IgM antyT.gondii, oraz ujemna pod względem antygenu
powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs-Ag) i
przeciwciał anty-HIV1, anty-HIV2 i anty-HCV,
1 fiolka
1 ml
1 fiolka
1 ml
Konserwant: < 0.01% thimerosal
4
R4b Kontrola
dodatnia
Kontrola dodatnia: Bufor TRIS-NaCl (pH 8 ±
0.2),
ludzka surowica, dodatnia pod względem
przeciwciał IgM anty-T.gondii, oraz ujemna pod
względem antygenu powierzchniowego wirusa
hepatitis B (HBs-Ag) i przeciwciał anty-HIV1,
anty-HIV2 i anty-HCV,
1 fiolka
1 ml
albumina bydlęca, glicerol, E102 i E122
Konserwant: < 0.01% thimerosal i < 0.5%
Proclin® 300
R6a Antygen
R6b Koniugat
(50x)
Antygen T.gondii : Inaktywowany antygen
T.gondii (szczep RH); liofilizowany
2 fiolki
Koniugat: Mysie przeciwciała monoklonalne
przeciwko T.gondii (P30), znakowane
peroksydazą chrzanu; stężony (50x)
1 fiolka
R7 Rozcieńczalnik Rozcieńczalnik próbek i koniugatu: Bufor
TRIS-NaCl
7 ml
0. 4 ml
2 fiolki
80 ml
(pH 7.7 ± 0.15), albymina bydlęca, 0.1%
Tween® 20, Czerwień fenolowa
Konserwant: < 0.01% thimerosal.
Bufor do substratu: Roztwór kwasu
R8 Roztwór
substratu TMB cytrynowego i octanu sodu (pH 4.0),
zawierający 0.015% H2O2 i 4% DMSO.
1 fiolka
R9 Chromogen:
1 fiolka
Roztwór TMB
R10 Roztwór
zatrzymujący
Chromogen:
Roztwór zawierający czterometylobenzydynę
(TMB)
Roztwór zatrzymujący:
60 ml
5 ml
1 fiolka
1 N kwas siarkowy
28 ml
Folia adhezyjna
4 szt.
5 - ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA
Środki ostrożności
Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki
Laboratoryjnej:
•
Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności.
•
Podczas jednego oznaczenia używać wyłącznie odczynników o tym samym
numerze serii.
5
Uwaga: Podczas danego oznaczenia można wymiennie używać następujących
odczynników, lecz w jednym teście powinny być one z tej samej serii: roztwór
płuczący (R2, oznaczony 10x na niebiesko), bufor do substratu (R8, oznaczony
TMB buf. na niebiesko), chromogen (R9, oznaczony TMB sol. na zielono) oraz
roztwór zatrzymujący (R10, oznaczony 1N na czerwono). Odczynników tych można
używać również w innych testach Bio-Rad; informacji udzieli serwis techniczny.
•
Przed użyciem przenieść odczynniki w celu stabilizacji na 30 minut do temp.
pokojowej.
•
Unikać zanieczyszczenia podczas rekonstytucji odczynników.
•
Nie wykonywać testu w obecności kurzu ani reaktywnych par związków
zasadowych, kwasów i aldehydów, które mogą wpływać na aktywność
enzymatyczną koniugatu.
•
Używać szkła dokładnie umytego i przepłukanego wodą destylowaną lub, co
jest wskazane, materiałów jednorazowych.
•
Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki pomiędzy etapem płukania a
dodawaniem kolejnego odczynnika.
•
Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na działanie metali i jonów
metali. Należy unikać kontaktu elementów metalowych z roztworami
zawierającymi koniugat lub substrat.
•
Roztwór substratu (bufor do substratu + chromogen) powinien być
bezbarwny. Wystąpienie niebieskiej barwy kilka minut po rekonstytucji
świadczy o nie przydatności roztworu do użycia. Roztwór należy
przygotowywać w jednorazowym plastikowym pojemniku przy pomocy
jednorazowych pipet lub końcówek lub używając szkła płukanego 1N
kwasem solnym, wodą destylowaną i wysuszonego. Roztwór należy
przechowywać w ciemności.
•
Do każdej badanej próbki zmieniać końcówkę pipety.
•
Płukanie studzienek jest istotnym etapem oznaczenia; należy przestrzegać
przewidzianych cykli płukania oraz zwracać uwagę, czy studzienki są
prawidłowo napełniane i całkowicie opróżniane. Nieprawidłowe płukanie jest
przyczyną fałszywych wyników.
•
Nigdy nie używać tego samego pojemnika na koniugat i roztwór substratu.
•
Sprawdzać, czy pipety i sprzęt są prawidłowo nastawione oraz, czy
aparatura prawidłowo pracuje.
•
Nie zmieniać opisanej procedury.
Higiena i bezpieczeństwo pracy
Wszystkie odczynniki są przeznaczone wyłącznie do diagnostyki in vitro.
•
Podczas pracy z odczynnikami należy używać rękawiczek jednorazowych.
•
Nie pipetować ustami.
•
Ludzkie surowice używane do przygotowania odczynników były ujemne pod
względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs Ag),
przeciwciał przeciwko wirusowi hepatitis C (anty-HCV) oraz przeciwciał anty6
HIV 1 i anty-HIV 2. Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających
obecność czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału
ludzkiego powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny.
•
Materiały mające kontakt z próbkami lub odczynnikami pochodzenia
ludzkiego, w tym także zużyty roztwór płuczący, należy traktować jako
skażone i dekontaminować przed wyrzuceniem.
•
Unikać rozlania próbek i odczynników je zawierających.
•
Rozlany odczynnik należy zmyć 10% roztworem podchlorynu. W przypadku
rozlania kwasu należy go najpierw zneutralizować dwuwęglanem sodu,
potem zmyć powierzchnię roztworem podchlorynu i wysuszyć bibułą.
Materiał używany do czyszczenia wyrzucić do pojemnika na
zanieczyszczone odpady.
•
Próbki, materiały i produkty zanieczyszczone materiałem biologicznym
dekontaminować przed wyrzuceniem.
-
przez moczenie w podchlorynie sodu o stężeniu końcowym 5% przez
30 minut,
-
lub autoklawowanie w temp. 121°C przez co najmniej 2 godziny
Autoklawowanie przez co najmniej godzinę w temp. 121°C jest najlepszą
metodą inaktywacji wirusów HIV i wirusów zapalenia wątroby.
UWAGA: NIE AUTOKLAWOWAĆ ROZTWORÓW ZAWIERAJĄCYCH
PODCHLORYN SODU.
•
UWAGA: Niektóre odczynniki zawierają:
*ProClin™ 300 < 0.5%: PRODUKT DRAŻNIĄCY
R43
Substancja drażniąca dla skóry.
S28/37 W przypadku kontaktu ze skórą, szybko przemyć dużą
ilością wody z mydłem. Pracować w odpowiednich
Xi - drażniący rękawiczkach
•
Ze związkami chemicznymi należy postępować zgodnie z zasadami Dobrej
Praktyki Laboratoryjnej.
•
Unikać kontaktu skóry i błon śluzowych z buforem do substratu,
chromogenem i roztworem zatrzymującym, ze względu na możliwość
zatrucia, podrażnienia lub poparzenia.
Karta charakterystyki substancji jest dostępna na życzenie.
6 - INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT
•
Worteks
•
Czytnik mikropłytek z filtrami 450 i 620 nm (*)
•
Łaźnia wodna lub inkubator mikropłytek nastawiony na 37° ± 1°C (*)
•
Pojemnik na materiał zakaźny i zanieczyszczone odpady
•
Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu
7
•
Jałowa woda destylowana lub dejonizowana
•
Cylindry miarowe na 25 ml, 50 ml, 100 ml i 1000 ml
•
Rękawiczki lateksowe jednorazowe
•
Okulary ochronne
•
Bibuła
•
Pipety lub multipipety automatyczne lub półautomatyczne, regulowane lub o
stałej pojemności, pobierające od 10 µl do 1000 µl, oraz 1, 2 i 10 ml.
•
Płuczka mikropłytek: manualna, półautomatyczna lub automatyczna (*)
•
Próbówki jednorazowe
(*) Dział Techniczny firmy udziela informacji na temat zalecanych aparatów
7 - PRZYGOTOWANIE I PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIKÓW
Zestaw należy przechowywać w temp. +2-8°C zgodnie z datą ważności, podaną
na opakowaniu.
Uwaga: Odczynniki są gotowe do użycia po osiągnięciu temp. pokojowej (+1830°C).
1) Odczynniki gotowe do użycia
•
Odczynnik 1 (R1): Mikropłytka
Każda płytka zawierająca 12 pasków jest zapakowana oddzielnie w foliową
torebkę. Należy ją przeciąć na wysokości 0.5 – 1 cm ponad linią i wyjąć
potrzebną liczbę pasków. Pozostałe paski szczelnie zamknąć i
przechowywać w temp. +2-8°C. Po otwarciu oryginalnego opakowania
studzienki mikropłytek zachowują zdolność reakcyjną przez 1 miesiąc w
temp. +2-8°C, przechowywane w szczelnie zamkniętej torebce.
•
Odczynnik 3 (R3), Odczynnik 4a (R4a), Odczynnik 4b (R4b), Odczynnik
4c (R4c), Odczynnik 10 (R10): Odczynniki przechowywane w temp. +2-8°C
są trwałe, również po otwarciu, zgodnie z datą ważności.
2) Odczynniki do rekonstytucji
•
Odczynnik 2 (R2): Roztwór płuczący 10x stężony
Rozcieńczyć wodą destylowaną 1:10, wymieszać. Do manualnego płukania
12 pasków potrzeba 350 ml rozcieńczonego roztworu płuczącego (R2d).
Rozcieńczony roztwór do płukania można przechowywać 2 tygodnie w
temp. +2-8°C. Roztwór stężony można przechowywać w temp. +2-25°C.
•
Odczynnik 6a (R6a): Antygen T.gondii
Liofilizowany antygen należy uwodnić przez dodanie do każdej fiolki 7 ml
rozcieńczalnika R7. Zrekonstytuowany roztwór antygenu R6a-w powinien
być całkowicie przezroczysty.
Uwaga: Zmętnienie świadczy o nie przydatności odczynnika.
8
Rozpuszczony antygen R6a należy zużyć w czasie 30 minut od
przygotowania. Nie wykorzystany roztwór można przechowywać 3 miesiące
po podzieleniu na porcje po 1.1 ml i zamrożeniu w temp. -20°C.
Rozmrożonych porcji nie zamrażać ponownie.
•
Odczynnik 6b (R6b): Stężony koniugat
Aby otrzymać rozcieńczony koniugat (R6b-w) na jedną mikropłytkę, należy
rozcieńczyć 0.3 ml stężonego 50x koniugatu R6b w 15 ml rozcieńczalnika
(R7). Dobrze wymieszać. Otrzymaną objętość podzielić na 10, aby
otrzymać ilość koniugatu roboczego (R6b-w) potrzebną na 1 pasek
zawierający 8 studzienek. Rozcieńczony koniugat należy zużyć w czasie 30
minut od przygotowania.
•
Roztwór koniugatu: Odczynnik 6a-w (R6a-w) + Odczynnik 6b-w (R6b-w)
Dodać równe objętości zrekonstytuowanego antygenu R6a i roboczego
roztworu koniugatu R6b. Dla 1 płytki należy zmieszać 12 ml R6a i 12 ml
R6b; dobrze wymieszać. Roztwór należy zużyć w czasie 4 godzin od
przygotowania. Aby otrzymać ilość potrzebną na 1 pasek = 8 studzienek,
podane objętości należy podzielić przez 12.
•
Roztwór wywołujący reakcję barwną: Odczynnik R8 (R8)+ odczynnik 9
(R9): Rozcieńczyć chromogen (R9) w stosunku 1:11 w buforze do substratu
(R8) (np. 1 ml R9 + 10 ml R8). Odczynnik jest stabilny przez 6 godzin w
temp. pokojowej (+18-30°C), w ciemności.
8 – POBIERANIE, OPRACOWYWANIE I PRZECHOWYWANIE
MATERIAŁU DO BADAŃ
1. Zalecanym rodzajem próbek jest surowica lub osocze, pobrane na
antykoagulant (EDTA, cytrynian, heparyna).
2. Postępowanie z próbkami:
•
Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą, z wkłucia
dożylnego.
•
Próbki krwi przed odwirowaniem pozostawić do powstania skrzepu.
•
Próbówki z próbkami przez cały czas powinny być zamknięte.
•
Po odwirowaniu jak najszybciej oddzielić surowicę lub osocze od skrzepu
i przenieść do szczelnie zamykanej próbówki.
•
Jeśli test będzie wykonany w ciągu 7 dni, próbki można przechować w
temp. +2-8°C.
•
Jeśli test będzie wykonany później, lub próbki będą transportowane,
należy je zamrozić w temp. -20°C lub niższej.
•
Próbki można zamrozić i rozmrozić najwyżej 3 razy.
•
Po rozmrożeniu próbki należy dokładnie wymieszać przed oznaczeniem.
1. Na oznaczenie nie wywiera wpływu obecność w surowicy 90 g/l albuminy,
100 mg/l bilirubiny, poziom lipemii odpowiadający 36 g/l trójglicerydów, ani
hemoliza wynosząca do 10 g/l hemoglobiny.
9
2. Nie ogrzewać próbek.
9 - PROCEDURA
Należy postępować dokładnie wg opisanej procedury. Podczas każdego testu
oznaczyć surowice wzorcowe, co zapewni walidację testu. Przestrzegać zasad
Dobrej Praktyki Laboratoryjnej.
1. Zanotować rozkład nanoszenia próbek i kontroli.
2. Przygotować rozcieńczony roztwór płuczący R2d (patrz rozdział 7).
3. Wyjąć potrzebną liczbę pasków (R1), pozostałe zamknąć ponownie w
oryginalnym opakowaniu.
4. Przepłukać mikropłytkę jeden raz rozcieńczonym roztworem płuczącym
(R2d). Osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule.
5. Rozcieńczyć badane próbki oraz kontrole w stosunku 1:101, dodając 10 µl
próbki lub kontroli do 1 ml rozcieńczalnika (R7). Po rozcieńczeniu
wymieszać próbki na worteksie.
6. Podczas manualnego wykonania testu, nanieść 200 µl rozcieńczonych
kontroli oraz badanych próbek w następujący sposób:
Studzienka 1A:
200 µl kontroli ujemnej (R3).
Studzienka 1B:
200 µl kontroli cut-off (R4a).
Studzienka 1C:
200 µl kontroli cut-off (R4a).
Studzienka 1D:
200 µl kontroli dodatniej (R4b).
Studzienka 1E, 1F, 1G, etc.:
200 µl próbki.
7. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną. Inkubować w łaźni wodnej z
termostatem lub w inkubatorze mikropłytek przez 1 godzinę ± 5 minut w
temp. 37 °C ± 1°C.
8. Przygotować roztwór koniugatu (R6a-w + R6b-w), łącząc równe objętości
rozcieńczonego koniugatu (R6b-w) i zrekonstytuowanego antygenu T.gondii
(R6a-w) na 15 minut przed końcem pierwszej inkubacji. Dobrze wymieszać
(patrz rozdział 7).
9. Zdjąć folię adhezyjną. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika z
podchlorynem sodu). Wykonać 3 cykle płukania rozcieńczonym roztworem
płuczącym (R2d) i osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule (patrz rozdział
10).
10. Do wszystkich studzienek nanieść po 200 µl roztworu koniugatu i antygenu.
Roztwór delikatnie wstrząsnąć przed użyciem.
11. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną. Inkubować w łaźni wodnej z
termostatem lub w inkubatorze mikropłytek przez 1 godzinę ± 5 minut w
temp. 37 °C ± 1°C.
12. Zdjąć folię. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika z
podchlorynem sodu). Wykonać 4 cykle płukania jak powyżej i osuszyć
odwróconą mikropłytkę na bibule.
10
13. Natychmiast nanieść do wszystkich studzienek po 200 µl roboczego
roztworu substratu (R8 + R9, patrz p. 7). Pozostawić reakcję w ciemności na
30 ± 5 minut w temp. pokojowej (18-30°C). Nie zakrywać folią adhezyjną.
14. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 µl
R10, w tej samej kolejności, w której dodawany był roztwór substratu.
15. Wytrzeć spód mikropłytki i w ciągu 30 minut od zatrzymania reakcji zmierzyć
gęstość optyczną (OD) każdej studzienki w czytniku mikropłytek, przy
długości fali 450/620 nm. Przed odczytem chronić płytkę od światła.
16. Przed opisem wyników sprawdzić zgodność kolejności odczytu z ustalonym
na początku rozkładem studzienek, oraz zgodność pomiędzy odczytem
spektrofotometrycznym a wizualnym.
10 - PROCEDURA AUTOMATYCZNA
•
Płukanie: Należy dokładnie przestrzegać podanych cykli płukania, aby
optymalnie wykorzystać właściwości testu.
-
Płuczka LP 35:
Po włączeniu płuczki zatwierdź parametry płukania. Wybierz numer
pomiędzy 1 a 20 i zatwierdź. Następnie wybierz podstawową procedurę 086
i rodzaj płytki. Po nastawieniu parametrów płuczka powraca do trybu
płukania.
-
Inne płuczki
Należy skontaktować się z serwisem Bio-Rad w celu adaptacji i
dostosowania procedur.
•
Odczyt: Wszystkie obliczenia, walidacja wyników, wykreślenie krzywej
wzorcowej i określenie statusu immunologicznego każdego pacjenta w
stosunku do T.gondii (wynik w IU/ml), są wykonywane automatycznie przez
czytnik mikropłytek wyposażony w filtry 450 i 620 nm, dostępny w Bio-Rad.
•
Inne aparaty: Należy skontaktować się z serwisem Bio-Rad w celu
adaptacji i dostosowania procedur.
11 - OBLICZENIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW
1) Kontrola jakości
Do każdego oznaczenia należy włączyć wszystkie surowice kalibracyjne. Aby
wyniki testu były ważne, muszą być spełnione odpowiednie kryteria:
•
•
Wartości gęstości optycznej:
-
OD R3 ≤ 0.1
-
OD R4b ≥ 1.0
Współczynniki:
-
OD R4a / OD R3 ≥ 3.0
-
OD R4b / OD R4a ≥ 1.8
11
Jeśli nie spełnione są kryteria kontroli jakości, test należy powtórzyć.
2) Obliczenie wartości cut-off, współczynnika próbki i indeksu fiksacji
próbki
•
Wartość cut-off ODMR4a jest to średnia wartość pomiarów OD, uzyskanego
dla kontroli cut-off R4a (kontrola o niskim, granicznym poziomie przeciwciał).
•
Wynik można przedstawić w postaci współczynnika:
Współczynnik próbki = OD próbki / ODMR4a
•
Jeśli gęstość optyczna próbki przekracza wartość cut-off ODMR4a, do
wyrażenia wyniku można zastosować indeks fiksacji:
Indeks fiksacji = (OD próbki - ODMR4a) / (OD R4b - ODMR4a)*10
3) Interpretacja wyników
OD cut-off
OD próbki < ODMR4a x 0.80
Współczynnik próbki
Współczynnik < 0.8
Wynik
Ujemny
OD próbki ≥ ODMR4a x 0.80
OD próbki < ODMR4a
Współczynnik ≥ 0.8
Współczynnik < 1
Wątpliwy
OD próbki ≥ ODMR4a
Współczynnik ≥ 1
Dodatni
Interpretacja/zalecenia
Prawdopodobnie nie ma zakażenia
T.gondii
Wynik należy potwierdzić po 10-20
dniach dla drugiej próbki. Oznaczyć
ilościowo IgG anty-T.gondii.
Wynik należy potwierdzić po 10-20
dniach dla drugiej próbki. Oznaczyć
ilościowo IgG anty-T.gondii.
Indeks fiksacji pozwala półilościowo wyrazić wyniki dla dwóch próbek od tego
samego pacjenta. Wartość indeksu pomiędzy 0 i 1 charakteryzuje próbki z
wynikiem wątpliwym.
•
Ograniczenia testu
Diagnozę niedawnego zakażenia pierwotniakiem można postawić dopiero po
połączeniu danych klinicznych i wyników testu serologicznego.
Wynik uzyskany dla jednej próbki nie wystarcza do potwierdzenia niedawnego
zakażenia. Dopiero znamienny wzrost poziomu przeciwciał IgG anty-T.gondii w
dwóch próbkach pobranych w odstępie co najmniej trzech tygodni, oznaczanych
jednocześnie, pozwala diagnozować świeże zakażenie, powinien jednak być
interpretowany jako świadectwo niedawno nabytego zakażenia.
Obecność przeciwciał IgM przeciw T.gondii nie jest dowodem świeżego
zakażenia pasożytem, gdyż przeciwciała IgM mogą utrzymywać się miesiącami,
a czasem latami po zakażeniu. Po wykryciu przeciwciał IgM należy ilościowo
oznaczyć poziom przeciwciał IgG w próbce pobranej 2-3 tygodnie później.
Jeśli w przypadku pierwotnego zakażenia próbka jest pobrana zbyt wcześnie,
przeciwciała przeciw T.gondii mogą jeszcze nie występować na wykrywalnym
poziomie. Wówczas należy oznaczyć drugą próbkę, pobraną 2 tygodnie później.
4) Najczęstsze problemy
Wyniki nie ważne lub nie interpretowalne najczęściej są spowodowane przez:
•
Nie odpowiednie płukanie mikropłytki.
12
•
Zanieczyszczenie próbek ujemnych próbką o wysokim poziomie przeciwciał.
•
Zanieczyszczenie roztworu substratu czynnikiem utleniającym (wybielacz,
jony metali).
•
Zanieczyszczenie roztworu zatrzymującego reakcję.
5) Przykład obliczenia
Uwaga: Podane wartości służą jako przykład i nie należy podstawiać ich w
miejsce uzyskanych wyników.
•
Wyniki
Studzienka OD (450/620 nm) Współczynnik próbki Indeks fiksacji
Wynik
R3
0.028
R4a
0.691
R4a
0.700
R4b
1.494
Próbka 1
0.109
0.15
0.0
Ujemny
Próbka 2
1.096
1.57
5.0
Dodatni
Próbka 3
2.096
3.01
17.5
Dodatni
•
Walidacja testu
- Wartości gęstości optycznej
. OD R3 ≤ 0.100
OD R4b ≥ 1.000
- Współczynniki
. OD R4a / OD R3 ≥ 3
. OD R4b / OD R4a ≥ 1.8
•
Obliczenie wartości cut-off
-
ODMR4a =
12 - CHARAKTERYSTYKA I OGRANICZENIA TESTU
Ocenę właściwości testu prowadzono oznaczając próbki pobrane do suchych
próbówek, do próbówek z separatorem surowicy, próbówek zawierających
aktywator skrzepu lub próbówek z różnymi antykoagulantami (EDTA, heparyna,
cytrynian).
1. Właściwości
Przedstawione poniżej dane, dotyczące właściwości testu Platelia® Toxo IgM
TMB uzyskano, badając świeże próbki surowicy, pobrane od kobiet w ciąży i od
pacjentów z immunosupresją, a także oznaczając zamrożone próbki surowicy,
uprzednio oznaczone jako dodatnie lub ujemne.
13
•
Badania porównawcze
W teście Platelia® Toxo IgM TMB i w innym, komercyjnym teście EIA oznaczano
równolegle ogółem 607 próbek, pochodzących od losowo wybranych kobiet w
ciąży. Podczas obliczeń do określenia względnej swoistości i czułości wyniki
wątpliwe włączono do wyników dodatnich.
Platelia® Toxo IgM TMB
Inny test EIA
Wynik
Ujemny
Wątpliwy
Dodatni
Ogółem
Ujemny
556
1
8
565
Wątpliwy
2
1
5
8
Dodatni
4
0
30
34
Ogółem
562
2
43
607
Wyniki badań (ośrodek 1)
Względna swoistość
Względna czułość
Względna zgodność
Wyniki wątpliwe
•
557 / 562
99.1% (97.8% - 99.7%)
41 / 45
91.1% (77.9% - 97.1%)
587 / 607
2 / 607
96.7% (95.28% - 98.13%)
0.33%
Swoistość
Swoistość testu Platelia® Toxo IgM TMB badano w 2 niezależnych ośrodkach.
Testowano surowice uprzednio oznaczone komercyjnymi testami w technice EIA.
Na podstawie uzyskanych wyników określono swoistość testu. Do wyjaśnienia
niezgodności stosowano test aglutynacji. Podczas obliczeń do określenia
swoistości testu wyniki wątpliwe włączono do dodatnich.
- ośrodek 1: 100%
(263 / 263)
- ośrodek 2: 100%
(557 / 557)
ogółem:
(820 / 820)
•
100%
Czułość
Czułość testu Platelia® Toxo IgM TMB badano w 2 niezależnych ośrodkach.
Testowano surowice uprzednio oznaczone komercyjnymi testami w technice EIA.
Na podstawie uzyskanych wyników określono czułość testu. Do wyjaśnienia
niezgodności stosowano test aglutynacji. Podczas obliczeń do określenia czułości
testu wyniki wątpliwe zaliczono do dodatnich.
- ośrodek 1: 100%
(80 / 80)
- ośrodek 2: 100%
(100 / 100)
ogółem:
(180 / 180)
100%
14
W teście Platelia® Toxo IgM TMB oznaczano także próbki z panelu serokonwersji
(ośrodek 1 i 2) oraz z panelu post-infekcyjnego (ośrodek 1):
•
97 próbek (ośrodek 1)
•
48 próbek od 14 pacjentów (ośrodek 2)
Dla badanej populacji uzyskano 100% czułości dla tej populacji.
•
Częstość występowania
We Francji, w okolicach Paryża, wyniki dodatnie pod względem przeciwciał IgM
przeciwko T.gondii uzyskano dla 7.4% badanych osób:
2. Powtarzalność
•
Powtarzalność wewnątrz-testowa
4 próbki (1 ujemna i 3 dodatnie) oznaczano 30 razy w tym samym teście.
Współczynnik zmienności dla próbek dodatnich był niższy niż 2%.
Próbki
PRÓBKA
PRÓBKA
PRÓBKA
UJEMNA
DODATNIA 1
ODATNIA 2
PRÓBKA
DODATNIA 3
Średnia
0.06
1.17
1.81
2.92
Odchylenie
Standardowe
0.01
0.02
0.03
0.03
Współczynnik
Zmienności
11.23
1.51
1.74
1.15
•
Powtarzalność pomiędzy-testowa
4 próbki (1 ujemną i 3 dodatnie) oznaczało dwóch techników w triplikacie przez 5
dni. Współczynnik zmienności dla próbek dodatnich był niższy niż 3%.
15
Próbki
PRÓBKA
PRÓBKA
PRÓBKA
UJEMNA
DODATNIA 1
DODATNIA 2
PRÓBKA
DODATNIA 3
Średnia
0.06
1.19
1.83
2.96
Odchylenie
Standardowe
0.01
0.027
0.05
0.08
Współczynnik
Zmienności
10.92
2.28
2.98
2.78
3. Reakcje krzyżowe
Oznaczono 239 próbek, dodatnich po względem markerów mogących dawać
potencjalne reakcje krzyżowe. Swoistość wynosiła 100% (239 / 239) = brak
reakcji krzyżowych.
Dodatni marker dla:
Liczba próbek
Reaktywność
CMV IgG
5
0
CMV IgM
5
0
VZV IgM
10
0
VZV IgG
10
0
Świnka IgG
10
0
Świnka IgM
8
0
Różyczka IgG
5
0
Różyczka IgM
5
0
EBV IgG
10
0
EBV IgM
9
0
Różyczka IgG
10
0
Różyczka IgM
10
0
HSV IgG
10
0
HSV IgM
10
0
HIV
63
0
Szpiczak
10
0
RF
37
0
ANA
10
0
HAMA
2
0
Ogółem
239
0
16
13 – LITERATURA
1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. :The diagnosis of toxoplasmosis.
Southern Med. J. 1975; 68, 1433-1443
2. BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the
HEMOCO and SEROCO Study Groups : Incidence and risk factors of
toxoplasmosis in a cohort of Human immunodeficiency virus-infected
patients (1988-1995). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, 575-581
3. BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of
the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279S285
4. DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P.,
AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746
pregnancies at risk for congenital toxoplasmosis. New Eng. J. Med. 1988;
318, 271-275
5. DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE
L’AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX
M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA
antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992;
87, 310-315
6. DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B.,
CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE
J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group Predictive value
of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic
encephalitis in HIV-infected patients.AIDS 1996; 10, 1521-1527
7. DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and
COLIN J. : Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour
des questions précises. Le concours médical 1985; 107-03, 227-234
8. DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. : Toxoplasmosis of animal and man. CRC
Press (1988)
9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G.,
WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii
infection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome for
infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2900-2906
10. JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific
immunoglobulins G, M, and A following Toxoplasma gondii infection in
pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J.
Clin. Microbiol. 1998; 36, 2907-2913
11. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved
Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by
determination of anti-Toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin.
Microbiol. 1997 ; 35, 1972-1977
12. LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P.,
HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K.:
Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based
on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, 155-158
17
13. LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the
diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, 2 155-158
14. LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E.,
DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E., : Classification system and
case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent
pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol.
Infect. Dis. 1996; 15, 799-805
15. LUFT B.J. and REMINGTON J.S. : Toxoplasmic encephalitis. Clinical
Infectious Diseases 1992; 15, 211- 222
16. NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. :
Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for
immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii.
Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 258-262
17. PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE
LOYE J. and PETERSEN E. : Performance of European laboratories testing
serum samples for Toxoplasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996;
15, 45-49
18. REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious
disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds.
WB Saunders Co., Philadelphia 1976; 191-332
19. SABIN A.B., and FELDMAN H.A. : Dyes as microchemical indicators of a
new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma),
Science 1948; 108: 660 - 663
20. SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G.
and CAPRON A. : Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified
parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1885; 62, 262-269
21. SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and
REMINGTON J.S. : Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma
gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131:
977-983
22. SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P.,
SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in
patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the
specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting.
Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 63-69
23. SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic
diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody
(IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: 401-407
24. WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C.,
WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group :
Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M.
antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 3112-3115
25. WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS
1993; 7, 299-316
18
STRESZCZENIE PROCEDURY WYKONANIA TESTU
1. Ustaw inkubator na 37 ± 10C.
2. Rozcieńcz chromogen R9 1:11 w buforze do substratu R8 (roztwór do
reakcji enzymatycznej).
3. Rozcieńcz wodą destylowaną 1:10 roztwór płuczący R2 10x (R2d).
4. Przepłucz jeden raz paski rozcieńczonym roztworem płuczącym (R2d).
5. Rozcieńcz badane próbki oraz kontrole w R7 stosunku 1:101.
6. Nanieść 200 µl rozcieńczonych kontroli i badanych próbek w sugerowany
sposób:
1
2
A R3
S5
B R4a
S6
C R4a
S7
D R4b
S8
E S1
S9
F S2
S10
G S3
S11
H S4
S12
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
7. Inkubacja przez godzinę w temp. 37 °C ± 1°C.
8. Przygotuj roztwór T. gondii Ag (R6a-w) oraz roztwór koniugatu (R6b-w).
9. Zaaspirować zawartość studzienek i przepłukać 3 razy roztworem do
płukania (R2d).
10. Do wszystkich studzienek nanieść po 200 µl roboczego roztworu
koniugatu.
11. Inkubacja przez godzinę w temp. 37 °C ± 1°C.
12. Zaaspirować zawartość studzienek i przepłukać 4 razy roztworem do
płukania (R2d).
13. Do wszystkich studzienek nanieść po 200 µl roztworu do reakcji
enzymatycznej (R8 + R9).
14. Inkubacja w ciemności, przez 30 minut, w temperaturze pokojowej (+18 30 °C ).
15. Dodać do każdej studzienki po 100 µl roztworu zatrzymującego reakcję
(R10).
16. Zmierzyć absorbancję w czytniku mikropłytek, przy długości fali 450/620
nm.
19
- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)
- Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic
in vitro)
- Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)
- EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)
- Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)
- Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico
in vitro)
- CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik)
- CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)
IVD
- For in vitro diagnostic use
- Pour diagnostic in vitro
- Para diagnóstico in vitro
- In vitro-Diagnostikum
- Per uso diagnostico in vitro
- Para uso em diagnóstico in vitro
- In vitro diagnostik
- In vitro diagnose
- Manufacturer
- Fabricant
- Fabricante
- Hersteller
- Produttore
- Fabricante
- Tillverkad av
- Fremstillet af
LOT
EC REP
- Batch code
- Code du lot
- Código de lote
- Chargen-Bezeichnung
- Codice del lotto
- Código do lote
- Batch nr.
- Batchkoden
- Storage temperature limitation
- Limites de températures de stockage
- Temperatura limite
- Lagerungstemperatur
- Limiti di temperatura di conservazione
- Limites de temperatura de armazenamento
- Temperaturbegränsning
- Temperaturbegrænsning
162
REF
- Catalogue number
- Référence catalogue
- Número de catálogo
- Bestellnummer
- Numero di catalogo
- Número de catálogo
- Katalognummer
- Katalognummer
- Authorised Representative
- Représentant agréé
- Representante autorizado
- Bevollmächtigter
- Distributore autorizzato
- Representante Autorizado
- Auktoriserad representant
- Autoriseret repræsentant
- Expiry date YYYY/MM/DD
- Date de peremption AAAA/MM/JJ
- Estable hasta AAAA/MM/DD
- Verwendbar bis JJJJ/MM/TT
- Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG
- Data de expiração AAAA/MM/DD
- Utgångsdatum År/Månad/Dag
- Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD
i
- Consult Instruction for use
- Consulter le mode d'emploi
- Consulte la instrucción para el uso
- Siehe Gebrauchsanweisung
- Consultare le istruzioni per uso
- Consulte o folheto informativo
- Se instruktionsanvisning vid användning
- Se instruktion før brug
The other languages which are required in conformity to the European
Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent.
Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles
auprès de votre représentant Bio-Rad local.
Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva
Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad.
Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD
Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad
Niederlassung.
Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee
possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad.
As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva
Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima
de si.
Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din
lokala Bio-Rad-representant.
De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved
henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør.
163