Część I

Wstęp
MATERIAŁY POMOCNICZE
DO WYKŁADÓW Z PODSTAW BIOFIZYKI
IIIr. Biotechnologii
prof. dr hab. inż. Jan Mazerski
Wstęp
Biofizyka zajmuje się zastosowaniem praw fizycznych i fizykochemicznych do układów
ożywionych. Ze względu na rodzaj układu ożywionego można wyróżnić kilka działów biofizyki:
- biofizyka środowiska
- biofizyka organizmów: medycyna + zoologia + botanika
- biofizyka narządów: jw.
- biofizyka komórek: mikrobiologia
- biofizyka molekularna: biochemia + biotechnologia
Na naszych wykładach zajmować się będziemy b i o f i z y k ą
m o l e k u l a r n ą , czyli
fizycznym i fizykochemicznym opisem biopolimerów. Pod koniec semestru omówimy również
wybrane elementy biofizyki komórek: problemy związane z przewodzeniem sygnałów nerwowych
oraz z ruchem mechanicznym komórek i narządów. Większość czasu poświęcimy jednak biofizyce
molekularnej.
Dlaczego do opisu biopolimerów nie wystarcza metodyka wypracowana przez
fizykochemię roztworów? Przede wszystkim dlatego, że chemia fizyczna zajmuje się układami
wyidealizowanymi:
- roztwory doskonałe
- roztwory substancji małocząsteczkowych
- układy w stanie równowagi termodynamicznej
- proste właściwości reologiczne.
Jednakże układy ożywione daleko odbiegają od tych wyidealizowanych założeń. Dlatego też
biofizyka musi zająć się "niechcianymi" układami:
- biopolimery o rozwiniętej i bardzo różnorodnej powierzchni
- granica faz biopolimer - wodne roztwory soli i/lub ich mieszanin
- strukturami supramolekularnymi (błony lipidowe)
- transportem na granicy faz - transport przez błony lipidowe
i
Część I: Woda w układach biologicznych
WODA W UKŁADACH BIOLOGICZNYCH
Na początku byłła
a woda
Wszystkie znane nam układy żywe wykorzystują wodę jako rozpuszczalnik i środowisko
procesów biochemicznych. Tak więc zanim przejdziemy do omawiania fizycznych i
fizykochemicznych podstaw tych procesów warto poświęcić uwagę temu wszechobecnemu
środowisku.
Cóż jednak może być ciekawego w wodzie? Każdy, kto uczył się chemii w szkole
podstawowej zna jej wzór chemiczny: H2O. Jest to prosta cząsteczka chemiczna zbudowana
zaledwie z 3 atomów, której struktura poznana jest obecnie w najdrobniejszych szczegółach. To
prawda, a jednak jeżeli zapytamy fizykochemików nie o c z ą s t e c z k ę
w o d y , l ecz o
s t r u k t u r ę c i e k ł e j w o d y to wywołamy pewną konsternację.
Przede wszystkim właściwości fizyczne ciekłej wody nie dają się wyprowadzić ze wzoru
cząsteczki wody. Dotyczy to takich właściwości jak:
- temperatura wrzenia i molowe ciepło parowania
- temperatura i ciepło topnienia
- pojemność cieplna
- napięcie powierzchniowe
- stała dielektryczna
- lepkość
i wiele innych.
300
250
Temp. wrzenia [C]
200
150
100
50
0
-50 0
50
100
150
200
250
-100
-150
-200
Masa cząsteczkowa
Rys.I.1: Zależność temperatury wrzenia n-alkanów od ich masy cząsteczkowej
1
Część I: Woda w układach biologicznych
Zajmijmy się dla przykładu temperaturą wrzenia. Wiadomo, że dla prostych związków
nieorganicznych i organicznych wielkość ta zależy od masy cząsteczkowej. Np. dla n-alkanów
uzyskujemy zależność przedstawioną na Rys.I.1.
Widzimy, że temperatura wrzenia rośnie monotonicznie ze wzrostem masy cząsteczkowej. Jeżeli na
podstawie tego wykresu chcielibyśmy oszacować masę cząsteczkową wody, to otrzymamy
absurdalnie wysoka wartość: ok. 100 daltonów.
Popatrzmy teraz, Tab.I-1, na najbliższych krewnych wody, czyli wodorki pierwiastków IV,
V, VI i VII grupy głównej.
Tabela I-1
Temperatury wrzenia wodorków pierwiastków IV - VII grupy głównej oraz ich masy cząsteczkowe
metan
-162°C
m.cz. 16
si l an
-112°C
m.cz. 32
germanowodór
-89°C
m.cz. 77
wodorek cyny
-52°C
m.cz. 123
amoniak
-34°C
m.cz. 17
fosforiak
-88°C
m.cz. 34
arsenowodór
-55°C
m.cz. 78
antymonowodór
-17°C
m.cz. 125
woda
+100°C
m.cz. 18
siarkowodór
-61°C
m.cz. 34
selenowodór
-42°C
m.cz. 81
tellurowodór
-2°C
m.cz. 130
fluorowodór
+20°C
m.cz. 16
chlorowodór
-85°C
m.cz. 34
bromowodór
-67°C
m.cz. 81
jodowodór
-40°C
m.cz. 128
Monotoniczny wzrost temperatury wrzenia wodorków obserwujemy tylko dla IV grupy głównej,
czyli węglowców. W pozostałych grupach sytuacja jest dużo bardziej skomplikowana: woda i jej
najbliżsi sąsiedzi wyraźnie odbiegają od ogólnych reguł. Przy tym woda stanowi w pewnym sensie
ośrodek tego "zamieszania". Widać to szczególnie wyraźnie na Rys.I.2.
Temp. wrzenia [K]
400
300
200
100
0
FLUOROWCE
TLENOWCE
AZOTOWCE
WĘGLOWCE
2
Część I: Woda w układach biologicznych
Rys.I.2: Temperatury wrzenia wodorków pierwiastków IV - VII grupy głównej
Okazuje się, że sytuacja taka występuje nie tylko w przypadku temperatury wrzenia. Podobnie
wygląda sytuacja w przypadku innych właściwości c i e k ł e j w o d y .
Struktura ciekłej wody
Wyjątkowe właściwości wody wynikają oczywiście z budowy i właściwości jej cząsteczek.
Atomy tworzące cząsteczką wody połączone są wiązaniami kowalencyjnymi tworzącymi kąt ok.
104°.
Po pierwsze cząsteczki wody posiadają silny moment dipolowy.
Μ
Wynika on z dużej różnicy elektroujemności pomiędzy
atomem tlenu i atomem wodoru. W efekcie atom tlenu staje się
ujemnym biegunem dipolu, a środek odległości pomiędzy
O δ−
δ+
H
o
104
Hδ +
atomami wodoru biegunem dodatnim.
Każdy dipol cząsteczki wody wytwarza wokół siebie pole elektryczne. Oddziaływanie tego pola z
polami innych dipoli (cząsteczek wody) lub ładunków (jonów) prowadzi do:
- orientacji cząsteczek
- oddziaływań elektrostatycznych prowadzących do powstawania agregatów cząsteczek.
Po drugie cząsteczka wody zdolna jest do tworzenia silnych wiązań wodorowych. Każda
cząsteczka wody może utworzyć 2 wiązania wodorowe w których jej atomy wodoru będą
odgrywały rolę donorów oraz 2 wiązania w których wolne pary odgrywać będą rolę
akceptorów wiązania.
Rys.I.3: Wiązania wodorowe jakie może utworzyć pojedyncza cząsteczka wody
W efekcie każda cząsteczka wody stać się może czterowiązalnym węzłem sieci wiązań
wodorowych obejmującej w sprzyjających warunkach dziesiątki, setki a nawet tysiące
indywidualnych cząsteczek.
3
Część I: Woda w układach biologicznych
Istnienie takich agregatów cząsteczkowych powoduje, że w przypadku ciekłej wody
powinniśmy właściwie posługiwać się wzorem (H2O)n. Takie podejście pozwala dużo lepiej
przewidzieć zachowanie się układów zawierających ciekłą wodę.
Cząsteczki wody zdolne są do tworzenia wiązań wodorowych nie tylko pomiędzy sobą, ale również
z wieloma polarnymi grupami funkcyjnymi związków organicznych. Z punktu widzenia biofizyki
największe znaczenie mają przy tym grupy: hydroksylowa, aminowa, amidowa, karbonylowa i
karboksylowa występujące w naturalnych makrocząsteczkach.
Pod względem budowy przestrzennej najlepiej poznana jest struktura wody w stanie stałym
czyli lodu. W kryształach lodu otrzymanego w normalnych warunkach cząsteczki wody ułożone są
w węzłach sieci krystalicznej w odległości 0,267 nm. Fragment takiej sieci przedstawia rysunek:
Rys.I.4: Fragment sieci krystalicznej lodu. Kółka symbolizują cząsteczki wody zaangażowane w
tetraedrycznym układzie wiązań wodorowych.
Na odległość pomiędzy węzłami sieci krystalicznej (atomami tlenu) składa się długość
kowalencyjnego wiązania O-H wynosząca 0,099 nm oraz długość wiązania wodorowego
wynosząca 0,177 nm. Przedstawiona powyżej struktura lodu nie jest tworem statycznym. Liczne
dane doświadczalne jak i wyniki obliczeń komputerowych pokazują, że dzięki energii ruchów
termicznych cząsteczki wody w węzłach sieci krystalicznej wykonywać mogą drgania i obroty.
Zdarza się że dochodzi wtedy do wymiany partnerów wiązań wodorowych. Powstające
nieregularności sieci krystalicznej niwelowane są poprzez ruchy relaksacyjne sąsiednich
4
Część I: Woda w układach biologicznych
cząsteczek. Jak wykazały badania z zastosowaniem znaczników izotopowych nieregularności takie
odpowiedzialne są za zjawiska takie jak dyfuzja małych cząsteczek w krysztale lodu oraz wymiana
cząsteczek pomiędzy kryształem i otaczającą go ciekłą wodą.
Struktura wody w stanie ciekłym nie jest możliwa do jednoznacznego, statycznego opisania.
W wodzie jako cieczy istnieje niewątpliwie znaczny stopień nieuporządkowania. Z drugiej jednak
strony istnieje wiele pośrednich danych doświadczalnych wskazujących, że w ciekłej wodzie
występują również pewne ugrupowania, asocjaty cząsteczek (klastery). Ich wielkość zależy od
temperatury i szacuje się, że w temperaturze pokojowej zawierać one mogą średnio ok. 100
cząsteczek wody.
Istnieją silne przesłanki, że te klastery stanowić mogą pozostałości, fragmenty sieci krystalicznej
lodu. Z rozważań energetycznych wynika, że przy topnieniu lodu zerwaniu ulega tylko ok. 15%
wiązań wodorowych. Oznacza to, że w ciekłej wodzie w temperaturze ok. 0°C zachowana jest
znaczna część struktury krystalicznej lodu. W miarę wzrostu temperatury wielkość tych
fragmentów szybko maleje, ale nawet w pobliżu temperatury wrzenia występować jeszcze mogą
kilkucząsteczkowe klastery będące pozostałościami sieci krystalicznej lodu.
Proste rozważania geometryczne pokazują, że ze względu na geometrię cząsteczki wody
najprostszym możliwym klastrem pozbawionym napięć powinien być pięciokąt foremny z
cząsteczkami wody w narożach.
A)
B)
Rys.I.5: Schemat dwóch możliwych struktur klatratów utworzonych z cząsteczek wody. Kółka na
rysunku symbolizują pozycje atomów tlenu. A) wypukły klatrat utworzony z 20 cząsteczek
wody; wszystkie ściany są pięciokątami foremnymi, B) klaster gwiaździsty otworzony z 15
cząsteczek wody; można się w nim doszukać pozostałości sieci krystalicznej lodu.
Oprócz pozostałości sieci krystalicznej lodu w ciekłej wodzie występują również klastery o
odmiennej strukturze. Mogą to być np. tzw. klatraty których strukturę przedstawiono na Rys.I.5 A.
5
Część I: Woda w układach biologicznych
Mają one formę regularnego dwunastościanu o ścianach w kształcie foremnych pięciokątów.
Ponieważ każdy atom tlenu występujący w narożu klatratu ma jeszcze potencjalnie jeden
niewysycony kierunek oddziaływania, więc klatraty tworzyć mogą trójwymiarową sieć
wypełniającą całą przestrzeń. Odległości pomiędzy narożami klatratu (węzłami sieci) są większe
niż w strukturze lodu. Jest to skutkiem wzrostu długości wiązań wodorowych i wskazuje na ich
osłabienie. W tej sytuacji wnętrze klatratu tworzy na tyle obszerną klatkę, że może się w niej
zmieścić dodatkowa cząsteczka wody lub inna mała cząsteczka. W ciekłej wodzie tworzyć się
mogą również struktury pośrednie pomiędzy strukturą lodu i klatratem (Rys.I.5 B).
Tak więc w ciekłej wodzie współistnieje obok siebie wiele różnych elementarnych jednostek
strukturalnych. W skład kilkudziesięciocząsteczkowych klasterów wchodzą prawdopodobnie
przedstawiciele opisanych wyżej oraz wielu innych elementarnych jednostek strukturalnych.
Klasterów takich nie można traktować jako konfiguracji trwałych. Ruchy termiczne powodują, że
zarówno klastery jak i mniejsze jednostki strukturalne tworzą się i rozpadają dynamicznie. Średnia
energia kinetyczna (translacyjna i rotacyjna) pojedynczej cząsteczki wody w temperaturze 300 K
wynosi ok. 7 kJ/mol, a energia oddziaływania dwóch cząsteczek wody jest nie większa niż ok.
20 kJ/mol. Obliczono, że średni czas życia klasterów wynosi w tych warunkach ok. 10 ps (10-11 s).
Sytuacja staje się jeszcze bardziej skomplikowana, gdy analizujemy struktury roztworów
wodnych. W zależności od budowy chemicznej substancji rozpuszczonej możemy mieć do
czynienia z bardzo złożonymi zjawiskami. Spróbujmy przeanalizować niektóre z nich.
Roztwory soli
W trakcie rozpuszczania kryształów soli dochodzi do dysocjacji na jony. Każdy z jonów
wytwarza wokół siebie pole elektryczne, które oddziałuje z cząsteczkami wody posiadającymi
charakter dipolowy. Pole elektryczne dąży do zorientowania dipoli wody równolegle do linii sił
pola. W przypadku jonów o symetrii kulistej, np. kationów metali, linie sił pola mają również
symetrię kulistą. Cząsteczki wody tworzą wtedy sferyczną warstwę wokół jonu. Orientacja
cząsteczek wody w takiej warstwie zależy od znaku ładunku jonu (Rys.I.6). W przypadku kationów
atomy tlenu stanowiące ujemne bieguny dipoli znajdują się bliżej jonu niż atomy wodoru.
Powstaje warstwa hydratacyjna składająca się ze zorientowanych cząsteczek wody. W jej warstwie
zewnętrznej przeważają (w przypadku kationów) atomy wodoru będące dodatnimi biegunami
dipoli. Jednakże pole elektryczne jonu sięga dalej niż grubość pojedynczej warstwy hydratacyjnej.
Ponadto nagromadzenie na powierzchni zewnętrznej atomów wodoru zdolnych do tworzenia
wiązań wodorowych sprzyja orientacji cząsteczek wody stykających się z taką warstwą. Tworzy się
6
Część I: Woda w układach biologicznych
więc kolejna warstwa hydratacyjna o orientacji analogicznej jak pierwsza. Również na jej
powierzchni mamy do czynienia z nagromadzeniem atomów wodoru. Istnieje więc możliwość
powstania kolejnej warstwy hydratacyjnej. O tym ile warstw hydratacyjnych powstaje wokół jonu
decyduje promień jonu i wielkość jego ładunku. Im jon jest mniejszy i posiada większy ładunek
tym silniejsze jest jego pole elektryczne i tym większa liczba warstw hydratacyjnych. W pewnej
odległości od jonu jego pole staje się już na tyle słabe, że nie jest w stanie przeciwstawić się
ruchom termicznym. Pojawia się strefa o nieuporządkowanej strukturze, a w jeszcze większych
odległościach przeważa struktura typowa dla ciekłej wody.
RDF
RDF
3.50
3.50
3.00
K
+
2.50
2.50
2.00
2.00
1.50
1.50
1.00
1.00
0.50
0.50
0.00
0.00
0.00
0.20
0.40
0.60
r[nm]
Cl
3.00
0.80
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
r[nm]
Rys.I.6: Przykłady radialnych funkcji rozkładu atomów wody wokół jonów: kationu potasowego
(po lewej) i anionu chlorkowego (po prawej) uzyskane dzięki modelowaniu
komputerowemu. Linią czarną zaznaczono rozkład gęstości atomów wodoru, a linią szarą
atomów tlenu cząsteczki wody
Przedstawiony tu statyczny obraz hydratacji jonów jest bardzo wyidealizowanym modelem. W
rzeczywistości cząsteczki wody nie tworzą wokół jonów trwałych warstw hydratacyjnych. Chcąc
dokonać bardziej wiarygodnej analizy sytuacji występującej w roztworach soli musimy zastosować
opis statystyczny uśredniający zmienny w czasie rozkład i orientację cząsteczek wody. Niektóre
techniki modelowania komputerowego, np. dynamika molekularna, pozwalają uzyskać szereg
geometrii modelowanego układu w sekwencji czasowej. Dane takie mogą stanowić podstawę do
wyznaczenia średniego rozkładu cząsteczek wody wokół wybranych atomów lub grup atomów.
Najczęściej w tym celu wykorzystywana jest tzw. r a d i a l n a f u n k c j a d y s t r y b u c j i
(RDF), czyli liczba danego typu atomów rozpuszczalnika w jednostce objętości w odległości r od
7
Część I: Woda w układach biologicznych
wybranego atomu substancji rozpuszczonej. Dla ułatwienia porównania rozkładów różnych typów
atomów, np. tlenu i wodoru w przypadku wody, uzyskane wartości RDF dzieli się przez średnią
gęstość danego typu atomu w roztworze. Przykłady takich radialnych funkcji dystrybucji dla
atomów tlenu i wodoru z cząsteczek wody wokół kationu potasowego i anionu chlorkowego
przedstawia Rys.I.6. Na przedstawionych wykresach RDF widać wyraźnie, że wokół obu jonów
tworzą się zorientowane, wielowarstwowe powłoki hydratacyjne. Najsilniej zorientowana jest
pierwsza powłoka hydratacyjna. W miarę wzrostu odległości stopień orientacji staje się coraz
mniejszy i wreszcie zanika.
Występowanie powłok hydratacyjnych wokół jonów tłumaczy istnienie zjawiska dysocjacji
soli w roztworach wodnych. Przyciąganie elektrostatyczne pomiędzy jonami przeciwnych znaków
otoczonymi powłokami hydratacyjnymi jest na tyle słabe, że przynajmniej w rozcieńczonych
roztworach, nie powinno występować tworzenie się par jonowych. Jednakże ze wzrostem stężenia
średnie odległości pomiędzy jonami przeciwnych znaków zmniejszają się na tyle, że dochodzi do
pojawiania się par jonowych. Model taki tłumaczy, co najmniej jakościowo, zależność stopnia
dysocjacji od stężenia roztworu.
Istnienie powłok hydratacyjnych wokół jonów można wykryć również pośrednio metodami
doświadczalnymi. Wykorzystuje się w tym celu pomiary przewodnictwa równowagowego jonów.
Znając wartość przewodnictwa równowagowego danego rodzaju jonu i przyjmując, że wraz z
otoczką hydratacyjną jony mają kształt kulisty można, korzystając z praw hydrodynamiki, np.
równania Stokesa, oszacować promień poruszającego się nośnika ładunku. Wyniki uzyskane tą
metodą dla kationów litowców przedstawia Tab.I-2.
Tabela I-2.
Wartości efektywnych promieni hydratacyjnych w nieskończenie rozcieńczonych roztworach
wodnych i promieni jonowych dla kationów litowców
Promień
Promień jonowy
hydratacyjny [nm]
[nm]
0,240
0,060
0,185
0,095
K+
Rb+
0,126
0,133
0,119
0,148
Cs+
0,120
0,169
Jon
Li+
Na+
8
Część I: Woda w układach biologicznych
Jest przy tym charakterystyczne, że tak obliczony "efektywny" promień hydratowanego
jonu maleje ze wzrostem liczby atomowej. Zależność ta jest odwrotna do zależności obserwowanej
w przypadku promieni jonów nieuwodnionych, np. w kryształach. Dla porównania Tab.I-2. zawiera
również wartości promieni jonowych wyznaczonych dla kryształów soli. Występowanie odwrotnej
proporcjonalności pomiędzy promieniem hydratowanego jonu i promieniem jonu w krysztale
wynika właśnie z obecności powłoki hydratacyjnej. Jony o małym promieniu jonowym, np. Li+,
potrafią silnie związać grubą powłokę hydratacyjną, a jony o dużym promieniu jonowym, np. Cs+,
nie potrafią w czasie ruchu w środowisku wodnym utrzymać swoich słabo związanych powłok
hydratacyjnych i zachowują się jak jony nieuwodnione.
Należy przy tym zwrócić uwagę, że podane wartości promieni jonów hydratowanych nie należy
traktować zbyt dosłownie jako promieni stref hydratacyjnych. Po pierwsze wielkości te zostały
wyznaczone z pomiarów dynamicznych (jony w ruchu) i mamy podstawy przypuszczać, że dla
jonów nie wykonujących ruchu pod wpływem pola elektrycznego zasięg uporządkowania
cząsteczek wody będzie większy. Po drugie, równanie Stokesa użyte do ich obliczenia traktuje
wodę jako środowisko ciągłe, pozbawione struktury cząsteczkowej. Jednakże uzyskane wartości
promieni są rzędu rozmiarów cząsteczek wody. Są to więc wartości "efektywne", przybliżone, a nie
rzeczywiste promienie zasięgu oddziaływania jonów z otaczającymi je cząsteczkami wody.
Pomimo tych zastrzeżeń promienie hydratacyjne jonów pozwalają wyjaśnić niektóre zjawiska
obserwowane przy transporcie jonów przez błony biologiczne i sztuczne błony lipidowe. W
doświadczeniach takich obserwuje się np. często, że jony potasu transportowane są łatwiej niż jony
sodu. Jest to sprzeczne z promieniami jonowymi tych jonów, ale całkowicie zgodne z ich
promieniami hydratacyjnymi.
Roztwory makrocząsteczek
Jak widzieliśmy powyżej, już zbudowanie poprawnego, fizykochemicznego modelu
roztworu soli napotyka na poważne problemy. Sytuacja staje się jeszcze trudniejsza w przypadku
roztworów zawierających polarne makrocząsteczki. Analizę takich roztworów prowadzi się zwykle
na dwóch etapach:
- makrocząsteczki w wodzie
- makrocząsteczki w roztworach soli.
W pierwszym etapie rozważa się przede wszystkim hydratację makrocząsteczek i rolę cząsteczek
wody w stabilizacji struktury II- i III-rzędowej. W etapie drugim analizuje się wpływ
9
Część I: Woda w układach biologicznych
makrocząsteczki na zmiany stężeń jonów w jej otoczeniu i wynikające z tego zmiany właściwości
fizykochemicznych szczególnie w obecności zewnętrznego pola elektrycznego.
Hydratacja makrocząsteczek.
Praktycznie wszystkie makrocząsteczki o znaczeniu biologicznym (białka, polisacharydy i
kwasy nukleinowe) posiadają na swojej powierzchni wiele grup zjonizowanych lub, co najmniej
ugrupowań silnie polarnych, np. grupy hydroksylowe w polisacharydach. Jest to niezbędne dla
zapewnienia tym makrocząsteczkom rozpuszczalności w wodzie. Sytuacja nie jest jednak wcale
taka oczywista. Istnieje np. szereg białek strukturalnych o bardzo małej rozpuszczalności w wodzie
pomimo obecności na ich powierzchni licznych grup polarnych, np. niektóre odmiany kolagenu lub
keratyna włosów. Przykłady słabej rozpuszczalności związków organicznych pomimo obecności
silnie polarnych, hydrofilowych grup funkcyjnych znaleźć można nawet wśród związków
małocząsteczkowych. Szczególnie spektakularne przykłady spotyka się w grupie cukrów prostych i
disacharydów, gdyż z obserwacji codziennych wiemy, że cukier (sacharoza) rozpuszcza się w
wodzie bardzo dobrze (ok. 200 g w 100 g wody w temp. pokojowej i ponad 400 g w temp. 100°C).
Jednakże inne disacharydy mają bardzo różną rozpuszczalność, np. maltoza tylko ok. 100 g, a
laktoza nawet tylko 17 g w 100 g wody. Również wśród cukrów prostych obserwujemy duże
różnice rozpuszczalności w wodzie. I tak fruktoza ma rozpuszczalność 355 g/100 g wody, glukoza
150, sorboza 83 a galaktoza tylko 20 g/100 g wody w temp. pokojowej. Powyższe przykłady
wskazują wyraźnie, że rozpuszczalność zależy nie tylko od ilości, ale również rozmieszczenia grup
polarnych. Rozmieszczenie to ma bowiem istotny wpływ na trwałość otoczki hydratacyjnej wokół
cząsteczki.
Wypada w tym miejscu zaznaczyć, że w przeciwieństwie do powłok hydratacyjnych jonów, otoczki
hydratacyjne biopolimerów mogą mieć i często mają bardzo skomplikowaną budowę. Duży stopień
komplikacji takiej otoczki wynika z bardzo skomplikowanej geometrii pola elektrostatycznego
występującego na powierzchni makrocząsteczek:
i) obecność różnorodnych grup funkcyjnych
ii) bliskie sąsiedztwo ładunków (ładunków cząstkowych) o przeciwnych znakach
iii) rozwinięta powierzchnia makrocząsteczek.
W pobliżu różnych części tej samej makrocząsteczki możemy spodziewać się występowania
otoczki hydratacyjnej o bardzo różnym stopniu i kierunku uporządkowania. W pobliżu grup
zjonizowanych będą to fragmenty silnie uporządkowane. W pobliżu grup silnie polarnych,
zdolnych do tworzenia wiązań wodorowych, lecz nie posiadających formalnie charakteru jonów
10
Część I: Woda w układach biologicznych
(np. grupa hydroksylowa lub amidowa) spodziewać się możemy otoczki silnie powiązanej z
biopolimerem, lecz o słabszej orientacji. Wreszcie w sąsiedztwie fragmentów niepolarnych
(łańcuchy alifatyczne, pierścienie aromatyczne) otoczka może wcale nie występować lub być
bardzo słabo zaznaczona.
RDF
RDF
3.50
3.50
3.00
3.00
2.50
-COO
-
2.00
2.00
1.50
1.50
1.00
1.00
0.50
0.50
0.00
0.00
0.00
0.20
0.40
0.60
+
-NH
3
2.50
0.00
0.80
0.20
r[nm]
RDF
0.60
0.80
0.60
0.80
RDF
3.50
3.50
3.00
3.00
2.50
2.00
2.00
1.50
1.50
1.00
1.00
0.50
0.50
0.00
0.00
0.20
0.40
-CH 3
2.50
-OH
0.00
0.40
r[nm]
0.60
0.80
r[nm]
atomy wodoru
0.00
0.20
0.40
r[nm]
atomy tlenu
Rys.I.7: Radialne funkcje dystrybucji wokół wybranych grup funkcyjnych w makrocząsteczkach
Modelowanie molekularne układów zawierających biopolimery lub ich fragmenty w otoczeniu
cząsteczek wody pokazało, że przy odpowiednim rozmieszczeniu grup funkcyjnych, możliwe jest
tworzenie się na powierzchni makrocząsteczki klasterów cząsteczek wody o charakterystycznej
geometrii. Co ciekawe, struktury takie (np. pierścienie 5-członowe zbudowane z 5 cząsteczek
wody) odkryto w kryształach niektórych polipeptydów, białek i kwasów nukleinowych.
Cząsteczki wody wchodzące w skład otoczki hydratacyjnej mogą przy tym spełniać istotną
rolę w stabilizacji struktury biopolimeru (Rys.I.8).
Ma to miejsce szczególnie w przypadku silnie rozbudowanej powierzchni cząsteczki tworzącej
"nisze". Jeśli w takiej niszy występują naładowane grupy funkcyjne zdolne do uczestniczenia w
11
Część I: Woda w układach biologicznych
wiązaniach wodorowych to dojść może to powstania tzw. m o s t k a w o d n e g o , czyli ciągu
cząsteczek wody połączonych ze sobą wiązaniami wodorowymi. Wydaje się, że szczególnie trwałe
są mostki wodorowe zawierające 1 lub 2 cząsteczki wody.
N
H + H
H
O
H
O
H
H
O
Rys.I.8: Rola mostków wodnych w stabilizacji struktury biopolimeru
Otoczka hydratacyjna odgrywa również istotną rolę w oddziaływaniach pomiędzy
makrocząsteczkami. Gdy dwie makrocząsteczki łączą się tworząc strukturę IV-rzędu, woda
tworząca początkowo otoczkę hydratacyjną w miejscu styku makrocząsteczek musi zostać usunięta
lub, co najmniej jej organizacja musi ulec istotnym zmianom. Tym samym woda ta odgrywa rolę
składnika chemicznego (substratu?) w reakcji asocjacji wpływając na tworzenie się struktur ponadcząsteczkowych (supramolekularnych). Otoczka hydratacyjna decydować może zarówno o
szybkości procesu asocjacji jak i o strukturze powstającego asocjatu.
Wydaje się, że obszary powierzchni cząsteczki posiadające jedynie cienką, słabo zorientowaną
otoczkę hydratacyjną są naturalnymi kandydatami na takie powierzchnie styku. I tak się w
rzeczywistości dzieje. Otoczka o podanej powyżej charakterystyce jest typowa dla niepolarnych
fragmentów biopolimeru. Fragmenty takie mają dużą skłonność do unikania kontaktu z
cząsteczkami wody, mówimy, że są hydrofobowe. Jednym ze sposobów zabezpieczenia się przed
kontaktem z wodą jest kontakt z innym, również hydrofobowym fragmentem powierzchni. Efektem
występowania oddziaływań hydrofobowych w obrębie pojedynczej cząsteczki biopolimeru jest
nagromadzenie się takich fragmentów z dala od powierzchni cząsteczki - w jej wnętrzu. W
przypadku międzycząsteczkowego oddziaływania hydrofobowego mamy do czynienia z asocjacją
makromolekuł, np. z powstawaniem w pełni funkcjonalnego enzymu z cząsteczek białek
tworzących jego podjednostki.
Nie zawsze jednak fragmenty hydrofobowe występują wewnątrz makromolekuły. Znane są liczne
białka, należące do klasy białek błonowych, w których większość fragmentów hydrofobowych
znajduje się na cylindrycznej powierzchni bocznej tych białek. Te hydrofobowe powierzchnie
12
Część I: Woda w układach biologicznych
przeznaczone są do kontaktu z również hydrofobowymi łańcuchami kwasów tłuszczowych w
wewnętrznych obszarach biwarstwy lipidowej.
Makrocząsteczki w roztworach soli
W warunkach fizjologicznych powierzchnie biopolimerów są w kontakcie nie z czystą
wodą, lecz z roztworami wodnymi zawierającymi znaczące ilości rozpuszczonych soli. Siła jonowa
płynów ustrojowych w organizmie człowieka odpowiada 150 mM roztworowi NaCl. Jony obecne
w roztworze mają przy tym tendencję do grupowania się wokół naładowanych grup związanych z
powierzchnią biopolimeru. Otoczka jonów tworzy tzw. warstwę podwójną. Jej skład zależy od
znaku ładunku grup naładowanych biopolimeru. Wokół dodatnio naładowanych grup występuje
warstwa anionów, a w przypadku grup o ładunku ujemnym warstwa kationów. Taka warstwa
podwójna wywiera silne działanie ekranujące obniżając siłę oddziaływań elektrostatycznych
pomiędzy ładunkami związanymi z powierzchnią jednej makrocząsteczki jak i pomiędzy różnymi
makrocząsteczkami.
Jako pierwszy istnienie takich warstw przewidział Helmholtz. On też jako pierwszy zajmował się
ich budową. W modelu Helmholtza warstwa podwójna składa się z ładunków powierzchniowych
biopolimeru i uporządkowanej warstwy jonów pochodzących z roztworu. Odległość tych
przeciwjonów od powierzchni biopolimeru jest w modelu Helmholtza stała. Takiej warstwie
podwójnej, tzw. w a r s t w i e
H e l m h o l t z a , odpowiada liniowa zmiana potencjału z
odległością (Rys.I.9 A).
Okazało się, że w niektórych przypadkach model Helmholtza odbiega od obserwowanych
zależności. Gouy i Chapman zaproponowali więc inny model warstwy podwójnej, tzw.
p o d w ó j n ą w a r s t w ę d y f u z y j n ą . Myślą przewodnią tego modelu jest założenie, że
przeciwjony dążą w zasadzie do utworzenia podwójnej warstwy Helmholtza, lecz przeszkadzają im
ruchy termiczne. W efekcie struktura warstwy dyfuzyjnej jest wypadkową obu tych procesów i
przypomina model atmosfery Ziemi: w pobliżu powierzchni biopolimeru gęstość przeciwjonów jest
największa i wraz z odległością maleje w przybliżeniu wykładniczo. W efekcie potencjał nie jest
liniową funkcją r i sięga głębiej w roztwór niż przy podwójnej warstwie Helmholtza, Rys.I.9 B.
Podstawą matematyczną modelu jest statystyczny rozkład przeciwjonów zgodnie z rozkładem
Boltzmanna. Model dyfuzyjnej warstwy podwójnej jest zgodny z doświadczeniem dla roztworów o
niewielkim stężeniu.
13
Część I: Woda w układach biologicznych
A)
B)
C)
ψ
ψ
r
ψ
r
r
Rys.I.9: Schemat różnych modeli warstw podwójnych na powierzchni biopolimeru. Powierzchnia
biopolimeru posiada ładunki dodatnie. Kółeczka oznaczają aniony tworzące warstwę
przeciwjonów. A) - warstwa Helmholtza; B) - dyfuzyjna warstwa podwójna; C - warstwa
podwójna Sterna. Wykresy poniżej schematów przedstawiają zmiany potencjału ψ jako
funkcję odległości r.
Przy większych stężeniach pojawiają się jednak znaczne rozbieżności pomiędzy
przewidywaniami modelu i danymi doświadczalnymi. Dlatego poszukiwano jeszcze lepszego
modelu. Ciekawy model zaproponował Stern. Połączył on modele Helmholtza i Chapmana
przyjmując, że część przeciwjonów tworzy rzeczywiście warstwę podwójną zgodną z modelem
Helmholtza. Jednakże zgodnie z założeniem Sterna, ładunek tych jonów nie jest wystarczający dla
zrównoważenia ładunku powierzchniowego biopolimeru. Pozostałe przeciwjony tworzą dyfuzyjną
warstwę podwójną. Podział ładunku (liczby przeciwjonów) pomiędzy obie podstruktury zależy od
stężenia roztworu. Przy niskich stężeniach wszystkie lub prawie wszystkie przeciwjony znajdują się
w warstwie dyfuzyjnej. Wraz ze wzrostem stężenia jonów coraz silniej obsadzana jest jednak
warstwa Helmholtza. Zgodnie z modelem Sterna zależność potencjału od r ma początkowo
charakter liniowy, a po przekroczeniu odległości Helmholtza przekształca się w zależność
wykładniczą (Rys.I.9 C). W efekcie spadek potencjału jest dużo wolniejszy niż w modelu warstwy
dyfuzyjnej. Model Sterna uwzględnia ponadto inne, nie tylko elektrostatyczne, oddziaływania
14
Część I: Woda w układach biologicznych
pomiędzy powierzchnią biopolimeru i przeciwjonami. Umożliwia to tworzenie poprawnych modeli
warstwy podwójnej nie tylko dla roztworów prostych soli, np. NaCl, ale również dla roztworów
zawierających zjonizowane związki organiczne. W takich roztworach na skutek oddziaływań
absorpcyjnych w warstwie podwójnej może występować nadwyżka przeciwjonów która w
skrajnych przypadkach może spowodować nawet odwrócenie potencjału pola.
15