Czy istnieje możliwość wskazania modelu zwierzęcego dla

&ARM0RZEGL.AUK†
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
#ZYISTNIEJEMO˜LIWOu¿WSKAZANIAMODELUZWIERZÃCEGO
DLAPORÌWNANIAJEGOAKTYWNOuCIMETABOLICZNEJZAKTYWNOuCI’
LUDZKIEGOCYTOCHROMU0WBADANIACHINVIVOLUBINVITRO #ZÃu¿)))pRZECZYWISTOu¿
)STHEREANANIMALMODELFORAHUMANCYTOCHROME0ACTIVITY
ININVIVOANDINVITROINVESTIGATIONS 0ART)))pREALITY
!NDRZEJ0LEWKA
:AKŒAD0ROTEOMIKIgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNY
Streszczenie
Abstract
Porównanie międzygatunkowe, które jak się wydaje jest
niezbędne, musi zostać przeprowadzone ze względu na
dwa powody. Po pierwsze, w organizmie ludzkim między
osobnikami występują różnice indywidualne pomiędzy
izoformami CYP, jako fenotypowa konsekwencja polimorfizmu genetycznego. Po drugie, jeśli nawet podział
CYP na podrodziny opiera się na sekwencji aminokwasowej, to wysokie podobieństwo w tej sekwencji nie pociąga za sobą podobnej aktywności enzymatycznej izoform
cytochromu P450. Ponadto, różne CYP mogą katalizować
takie same reakcje. Profile inhibicji z jednej strony były
określane za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko różnym izoformom cytochromu P450, jak też przy
pomocy chemicznych inhibitorów takich jak, furafilina,
α-naftoflawon, sulfafenazol, chinidyna, chinina, dietyloditiokarbaminian, ketokonazol i inne. Wyniki wykazują
duże rozbieżności międzygatunkowe w aktywnościach
enzymatycznych, jak i w sposobie wpływu selektywnych inhibitorów P450 na metabolizm różnych związków
w mikrosomach ocenianych zwierząt.
The inter-specific comparison seems indispensable for
two reasons. First, human individuals differ between each
other in CYP isoforms, as a phenotypic consequence of
the genetic polymorphism. Second, even if division of
CYP into subfamilies reflects amino acid sequences, a
high similarity of the sequence is not equivalent to similar enzymatic activity of the cytochrome P450 isoforms.
Moreover, various CYP may catalyze the same reactions.
Inhibition profiles were defined using, on one hand, antibodies specific for various isoforms of cytochrome P450
and, on the other, chemical inhibitors, such as furafylline,
α-naphthoflavone, sulphaphenazole, quinidine, quinine,
diethyldithiocarbamate, ketoconazole and other. Summing up, the results demonstrated extensive inter-specific
divergences in enzymatic activities as well as in the ways
in which selective inhibitors of P450 affect metabolism of
various compounds in microsomes of evaluated animals.
Key words: animals species, human, enzyme activities,
kinetic parameters, inhibition, cytochrome P450, CYP
Słowa kluczowe: gatunek zwierząt, człowiek, aktywność
enzymatyczna, parametry kinetyczne, inhibicja, cytochrom P450, CYP
Profile inhibicji
Pomysł badania inhibicji jest konsekwencją opublikowanego artykułu przez zespół Newtona i wsp. [1] po to,
aby ułatwić porównanie wyników w dostępnej literaturze.
Trzeba podkreślić, iż dla człowieka używa się substratów
i inhibitorów specyficznych dla jednego izoenzymu cytochromu P450. W związku z tym można oczekiwać skutecznego zahamowania aktywności metabolicznej w mikrosomach wątroby ludzkiej. U zwierząt badania inhibicji
przeprowadzone są na izoformach o podobnej lub niższej
aktywności katalitycznej niż u człowieka. Zatem skutecznego hamowania można oczekiwać, jeżeli izoenzym homologiczny do przypisywanego dla aktywności określonego
substratu-markera jest odpowiedzialny za tę aktywność.
Furafilina, inhibitor CYP1A2 [2, 3] o znanym mechanizmie działania, powoduje przy bardzo niskim stężeniu
(l μM) 80% zahamowanie aktywności O-deetylazy fenacetyny w ludzkich mikrosomach wątrobowych [4]. Newton
i wsp. [1] potwierdzili to doniesienie. Wiadomo, że w ludz-
&ARM0RZEGL.AUK
kiej wątrobie nie ma znamiennej konstytutywnej ilości CYP
1A1. Z tego powodu całkowite zahamowanie aktywności
O-deetylazy fenacetyny można uzyskać u ludzi używając
furafiliny. Przy najwyższym badanym stężeniu (100 μM),
furafilina hamowała aktywność tej deetylazy u psa i konia
odpowiednio o 90% i 65%, podczas gdy u kota aktywność
ta nie została praktycznie zahamowana. Może to oznaczać,
że podczas gdy enzym homologiczny z CYP1A2 odgrywa
ważną rolę w metabolizmie fenacetyny u psa i konia, inny
izoenzym może być również zaangażowany w proces. Ten
ostatni wniosek wydaje się być przyczyną stabilnej aktywności O-deetylazy fenacetyny w mikrosomach wątroby
kota.
Przeciwciało monoklonalne, które rozpoznaje ludzki
CYP 2A6 skutecznie hamuje aktywność 7-hydroksylazy
kumaryny u człowieka, psa i konia. U kota doszło do zahamowania 70% tej aktywności przy inkubacji aż ze 100
μg przeciwciała. Całkowite zahamowanie aktywności
w mikrosomach wątroby u człowieka, psa i konia wskazuje
na to, że enzym podobny do CYP2A6 lub reagujący krzyżowo z przeciwciałami monoklonalnymi jest odpowiedzialny za wyżej wymienioną aktywność. Odnosząc powyższe
wnioski do obserwacji aktywności u kota, wskazuje się na
fakt, że skoro zahamowanie jest niepełne to w proces zaangażowany jest inny izoenzym.
Poziom aktywności hydroksylazy tolbutamidu jest zbyt
mały w mikrosomach psa i kota by uzyskać wystarczające
dane ilościowe do badania hamowania. Z tego powodu sulfafenazol (inhibitor tej hydroksylazy) nie może być używany u tych gatunków zwierząt jako rozpoznawalny marker
inhibicji P4502C9. Sulfafenazol powoduje odpowiednio
80% i tylko 40% hamowanie aktywności tej hydroksylazy
u człowieka i konia, dopiero przy 100 μM inhibitora. Newton
i wsp. [1] donoszą, że 100 μM sulfafenazol hamuje aktywność hydroksylazy tolbutamidu w ludzkich mikrosomach
o 80%, co wykazano również w innym laboratorium [4].
Aktywność hydroksylazy tolbutamidu obserwowana u konia nie była całkowicie hamowana przez sulfafenazol i co
powiedziano wcześniej, nie może być tłumaczona przez
wpływ innych izoenzymów odpowiedzialnych za aktywność.
Tranylcypromina, inhibitor CYP2C19 [5], powoduje całkowitą supresję aktywności 4’-hydroksylazy S-mefenytoiny
u wielu gatunków zwierząt. W związku z tym, izoenzym
wysoce homologiczny z CYP2C19 może być odpowiedzialny za metabolizm S-mefenytoiny w mikrosomach innych
zwierząt, w tym psa, kota i konia.
Wpływu chinidyny, silnego inhibitora CYP2D6, nie
odnotowano na aktywność markerową u konia. Interpretacja wyników stała się trudniejsza odkąd aktywność
O-demetylazy dekstrometorfanu u konia okazała się wyższa w porównaniu do człowieka. Chinidyna powoduje
zahamowanie 80% aktywności tej O-deetylazy u człowieka przy stężeniu rzędu l μM, podczas gdy przy 100
μM spowodowała tylko 60% zahamowanie w mikrosomach wątroby psa i kota. Interpretacja danych w badaniu hamowania może być trudna u gatunków zwierząt,
u których słabo poznano cytochrom P450. Odnosi się
to szczególnie do CYP2D6 gdzie odnotowano różnice
międzygatunkowe w zależności od warunków hamo-
wania. Dla przykładu, odnotowano, iż CYP2D1 szczura ma 70% homologii z ludzkim CYP2D6 [6] i oba
gatunki mają podobną specyficzność substratową [7,
8]. Chinina jest silnym inhibitorem CYP2D1 szczura,
w przeciwieństwie do jej stereoizomeru, który jest właściwy dla ludzkiego CYP2D6 [9].
Specyficzny inhibitor CYP2E1 – dietyloditiokarbaminian, powoduje zahamowanie aktywności 6-hydroksylazy
chlorzoksazonu odpowiednio o 80%, 60%, 40% i 40%
w mikrosomach człowieka, psa, kota i konia dla dawki
100 μM inhibitora. Newton i wsp. [1] podają podobny zakres hamowania aktywności 6-hydroksylazy chlorzoksazonu za pomocą dietyloditiokarbaminianu w mikrosomach
człowieka. Zahamowanie aktywności w pewnym zakresie
u wszystkich gatunków wskazuje, że enzym ten podobny do
ludzkiego P4502E1 może odgrywać istotną rolę w aktywności 6-hydroksylazy chlorzoksazonu u konia, psa i kota.
Ponieważ zahamowanie jest niepełne prawdopodobnie inne
enzymy biorą udział w reakcji.
Troleandomycyna jest podstawowym inhibitorem ludzkiego CP3A4, zależnym od NADPH. Newton i wsp. [1] podają zahamowanie 80% aktywności 6β-hydroksylazy testosteronu w mikrosomach człowieka przez troleandomycynę
w stężeniu 10 μM inhibitora. W laboratorium Chauret i wsp.
[4], aktywność tej hydroksylazy u człowieka była zahamowana o 80% w stosunku do aktywności u psa, przy stężeniu troleandomycyny większym niż 10 μM. Pokrywa się to
z badaniami prowadzonymi w innych laboratoriach [1012], których autorzy donoszą, że troleandomycyna może
hamować aktywność 6β-hydroksylazy testosteronu u psa.
Hydroksylacja testosteronu była tylko częściowo zahamowana u kota (40%) i konia (20%) przy stężeniu 100 μM
troleandomycyny.
Badania te, jakkolwiek trudne i czasochłonne są niezwykle ważne dla klinicznej oceny przydatności wielu nowych
substancji, które mogą zostać wprowadzone do farmakologii człowieka. Ich wstępna selekcja na gruncie wpływu toksykologicznego na organizm żywy daje lepsze nadzieje na
końcowe badania kliniczne [13, 14].
Próba ekstrapolacji gatunek zwierzęcia
– człowiek
Pod koniec lat dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku
Guengerich [15] zaproponował sugerowane, nieobowiązujące cztery grupy „katalitycznego zachowania” izoform
cytochromu P450 w odniesieniu do ekstrapolacji gatunkowej:
1. Podrodziny cytochromu P450, w których gatunkowa
ekstrapolacja wydaje się być wysoka, odnoszą się do
CYP2E1.
2. Podrodziny cytochromu P450, w których wymagane
jest trochę ostrożności w ekstrapolacji, odnoszą się
do CYP1A1, 1A2 i 4A.
3. Podrodziny cytochromu P450, w których wskazane
jest więcej ostrożności w ekstrapolacji, odnoszą się
do CYP2D i 3A.
4. Duże problemy w ekstrapolacji, odnoszą się do CYP2A, 2B i 2C.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Tab. I. Przewidywanie gatunków zwierząt najbardziej porównywalnych z człowiekiem pod względem cytochromów P450
(zmodyfikowane, na podstawie [13, 14, 16])
Aktywność
Gatunek
Profil inhibicji
Przeciwciało, inhibitor
enzymatyczna
najbardziej
Aktywności P450 do:
najbardziej zbliżony
chemiczny
najbardziej zbliżona
zbliżony
do ludzkiego
do człowieka
do człowieka
Przeciwciało
Mysz, królik, świnia Mysz, szczur, królik,
dla
ludzkiego
CYP1A/2
7-Etoksyrezorufina,
świnia, małpa, pies, Mysz, królik, świnia
Furafilina
Mysz, pies, koń
fenacetyna
kot?, koń?
Mysz, królik, świnia
A-Naftoflawon
Przeciwciało
Małpa, świnia, pies,
Kumaryna
Królik, małpa, świnia
Małpa, świnia
dla ludzkiego 2A6
koń
Przeciwciało
7-Etoksykumaryna
Mysz
Mysz
dla szczurzego 2B1/2
Przeciwciało
dla szczurzego 2C9
Tolbutamid,
Szczur
Szczur?
diklofenak
Małpa, świnia, koń,
Sulfafenazol
pies?
Przeciwciało
dla szczurzego 2C19
Małpa
Małpa
Mefenytoina
Pies, kot, szczur,
Tranylcypramina
małpa, królik
Przeciwciało dla
Szczur, małpa,
szczurzego 2D6
Bufuralol,
Chinidyna
Pies, kot
Pies
Pies, szczur, małpa
dekstrametorfan
Umiarkowana
Chinina
inhibicja u psa; słaba u
szczura, małpy
Przeciwciało dla
Bez dużych różnic
Bez dużych różnic
szczurzego 2E1
Chlorzoksazon
międzygatunkowych międzygatunkowych
Dietyloditiokarbaminian
Pies?, kot?
Mysz, samiec
Przeciwciało dla
Mysz, samiec szczura
Mysz, samiec
szczurzego 3A2
szczura
szczura, królik,
Testosteron
Mysz, samiec szczura, świnia, małpa, pies?,
Ketokonazol
Świnia, małpa
kot?
świnia, małpa
Kwas laurynowy
Przeciwciało dla
szczurzego 4A1
Bez dużych różnic
międzygatunkowych
Ta klasyfikacja nie jest ścisła, ale daje podstawy do
względnie wiarygodnej oceny aktywności enzymatycznej
i oceny izoenzymów cytochromu P450 podczas porównawczej analizy międzygatunkowej. W laboratorium Bogaardsa i wsp. [16] użyto innego podejścia do tego problemu.
Ich celem nie było uszeregowanie podrodzin cytochromu
P450 względem ekstrapolacji gatunkowej, ale przewidzenie, które gatunki są najbardziej zbliżone do człowieka
pod względem podrodzin P450. W oparciu o parametry
kinetyczne oraz aktywności enzymów i profile inhibicji,
nie stwierdzono dużych różnic pomiędzy gatunkami zwierząt dla 6-hydroksylazy chlorzoksazonu i 12-hydroksylazy
kwasu laurynowego. Dla O-dealkilazy 7-etoksyrezorufiny,
1’-hydroksylazy bufuralolu i 6β-hydroksylazy testosteronu – trzy lub cztery z badanych gatunków zwierząt zostały
wybrane jako najbardziej zbliżone do człowieka, podczas
gdy dla O-deetylacji fenacetyny, 7-hydroksylazy kumaryny, O-dealkilazy 7-etoksy-4-trifluorometylokumaryny
i 4’-hydroksylazy S-mefenytoiny tylko jeden lub dwa ga-
Bez dużych różnic
Bez dużych różnic
międzygatunkowych międzygatunkowych
tunki z badanych zwierząt były wystarczająco podobne
do człowieka. Dla metabolizmu diklofenaku nie ustalono
żadnej wiarygodnej prognozy. Jeśli wyniki zgrupowane
w tabeli I miałyby posłużyć do zaklasyfikowania do powyżej wymienionych czterech grup to:
-
CYP2E i CYP4A należałyby do grupy pierwszej,
CYP2A, CYP2B i CYP2C do grupy czwartej,
CYP1A, CYP2D i CYP3A do grupy drugiej lub trzeciej.
Stąd też, ogólnie rzecz ujmując, wyniki zebrane z tabeli I
są zgodne z klasyfikacją zaproponowaną przez Guengericha
[15].
Podsumowanie
Podsumowując, żaden z gatunków zwierząt domowych
nie wykazywał podobieństwa do człowieka odnośnie wydajności różnych inhibitorów. Na ogół aktywności metabo-
&ARM0RZEGL.AUK
liczne u kota były słabiej hamowane niż u innych gatunków, nawet przy wyższych stężeniach. Warto odnotować,
iż niespecyficzne hamowanie izoform cytochromu P450
można zaobserwować przy dużych stężeniach specyficznych inhibitorów. Powinno brać się to pod uwagę, gdy hamowanie zachodzi wyłącznie przy wysokim stężeniu inhibitora. Dla przykładu stwierdzono, że wiele specyficznych
inhibitorów użytych w badaniach (furafilina, chinidyna,
dietyloditiokarbaminian i troleandomycyna) może spowodować zahamowanie do 20% aktywności innych CYP przy
zastosowaniu wyższego stężenia [1].
Można z tego wywnioskować, iż występują duże różnice międzygatunkowe w reakcjach in vitro zależnych od
cytochromu P450 w mikrosomach wątroby szczura, myszy, królika, małpy, psa, kota i konia. Występuje zmienność
w aktywności metabolicznej specyficznych markerów
katalitycznych cytochromu P450, jak również różnice w
sposobie działania specyficznych inhibitorów na różne
aktywności katalityczne izoform cytochromu P450. Biorąc pod uwagę ograniczoną liczbę dostępnych danych na
temat cytochromów P450 u zwierząt domowych, włączając powinowactwo substratów i inhibitorów, wyniki
dotychczasowych badań można wykorzystać, jako wskazówki w przyszłych poszukiwaniach. Z danych uzyskanych w tych badaniach jasno wynika, że nowe związki chemiczne testowane na zwierzętach powinny być
badane in vitro pod kątem ich profilu metabolicznego
u wszystkich zwierząt doświadczalnych w przypadku
wyraźnie zaznaczonych międzygatunkowych odmienności metabolicznych. Tego typu badanie powinno wskazać
wszystkie możliwe in vivo przemiany metaboliczne potencjalnych leków, nawet na wczesnym etapie badania
klinicznego.
Kończąc, niewiele badań zostało zaprojektowanych
w celu scharakteryzowania izoenzymów cytochromu
P450 lub enzymatycznych aktywności markerowych cytochromów P450 u różnych gatunków zwierząt, aby dostarczyć dodatkowych ważnych informacji odnoszących
się do porównawczego metabolizmu międzygatunkowego. Wyniki tych badań zostały użyte do wybrania gatunku
najbardziej podobnego do człowieka dla każdego izoenzymu (aktywności) P450. Jeżeli wiemy, który z ludzkich izoenzymów cytochromu P450 jest zaangażowany
w metabolizm określonej substancji chemicznej, dane
z tabeli I powinny być uważane za użyteczne narzędzie
do wybrania najbardziej odpowiedniego gatunku dla eksperymentów in vitro i in vivo. W ten sposób badania te
dają nadzieję na uzyskanie dodatkowych ważnych informacji dotyczących międzygatunkowego metabolizmu porównawczego.
Wnioski
1. Wykazano, że praktycznie żadne z badanych gatunków zwierząt nie było podobne do człowieka
we wszystkich badanych aktywnościach enzymatycznych izoform cytochromu P450. U każdego z
gatunków jedynie kilka z pośród aktywności CYP
może być rozważane jako porównywalne do człowieka.
2. Odkąd wiadomo, które izoenzymy cytochromu
P450 biorą udział w metabolizmie związków chemicznych, dane porównawcze przedstawione w tym
opracowaniu mogą być użyte do wybrania zwierzęcia najbardziej zbliżonego do człowieka w badaniach in vitro i in vivo.
Piśmiennictwo
1. Newton DJ, Wang RW, Lu AYH. Cytochrome P450 inhibitors: evaluation of specificities in the in vitro metabolism of therapeutic agents by human liver microsomes. Drug Metab Dispos 1995; 23: 154-158.
2. Kunze KL, Trager WF. Isoform-selective mechanism-based inhibition of human cytochrome P450
1A2 by furafylline. Chem Res Toxicol 1993; 6:
649-656.
3. Murray S i wsp. Inhibition of human CYP1A2 activity in vitro by methylxanthines: potent competitive inhibition by 8-phenyltheophylline. Xenobiotica 2001;
31:135-151.
4. Chauret N i wsp. In vitro comparison of cytochrome P450-mediated metabolic activities in human,
dog, cat, and horse. Drug Metab Dispos 1997; 25:
1130-1136.
5. Wienkers LC i wsp. Formation of (R)-8-hydroxywarfarin
in human liver microsomes. A new metabolic marker
for the (S)-mephenytoin hydroxylase, P4502C19. Drug
Metab Dispos 1996; 24: 610-614.
6. Soucek P, Gut I. Cytochromes P-450 in rats: structures,
functions, properties and relevant human forms. Xenobiotica 1992; 22: 83-103.
7. Nedelcheva V, Gut I. P450 in the rat and man: methods
of investigation, substrate specificities and relevance to
cancer. Xenobiotica 1994; 24: 1151-1175.
8. Dracínska H i wsp. Oxidative detoxication of carcinogenic 2-nitroanisole by human, rat and rabbit cytochrome P450. Neuro Endocrinol Lett 2006; 27 Suppl
2: 9-13.
9. Granvil CP i wsp. 4-Hydroxylation of debrisoquine
by human CYP1A1 and its inhibition by quinidine and quinine. J Pharmacol Exp Ther 2002; 301:
1025-1032.
10. Ciaccio PJ, Halpert JR. Characterization of a phenobarbital
-inducible dog liver cytochrome P450 structurally related
to rat and human enzymes of the P450IIIA (steroid inducible) gene subfamily. Arch Biochem Biophys 1989; 284:
284-299.
11. Jayyosi Z i wsp. Catalytic and immunochemical characterization of cytochrome P450 isozyme induction in dog
liver. Fundam Appl Toxicol 1996; 31: 95-102.
12. Eguchi K i wsp. Quantitation of cytochrome P450 enzymes (CYP1A1/2, 2B11, 2C21 and 3A12) in dog liver
microsomes by enzyme-linked immunosorbent assay.
Xenobiotica 1996; 26: 755-763.
13. Michalets EL. Update: clinically significant cytochrome P450 drug interactions. Pharmacotherapy. 1998;
18: 84-112.
14. Tredger JM, Stoll S. Cytochromes P450 – their impact
on drug treatment. Hospital Pharm. 2002; 9: 167-173.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
15. Guengerich FP. Comparisons of catalytic selectivity of cytochrome P450 subfamily enzymes from
different species. Chem Biol Interact 1997; 106:
161-182.
16. Bogaards JJ i wsp. Determining the best animal model
for human cytochrome P450 activities: a comparison of
mouse, rat, rabbit, dog, micropig, monkey and man. Xenobiotica 2000; 30: 1131-1152.
data otrzymania pracy: 23.02.2010 r.
data akceptacji do druku: 25.05.2010 r.
Adres do korespondencji:
dr hab. Andrzej Plewka
Zakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny,
41-200 Sosnowiec, ul. Ostrogórska 30
tel.: +48 32 364 14 30
e-mail: [email protected]