Chromatografia kolumnowa – odsalanie acetylowanego cytochromu C

Ćwiczenia laboratoryjne z Chemii Bioorganicznej
Chemia medyczna
Acetylowanie cytochromu C - teoria
Zagadnienia:
1. Modyfikacja reszt aminokwasowych w białkach (naturalne modyfikacje posttranslacyjne i modyfikacje chemiczne)
2. Cytochrom C: sekwencja, masa molowa, funkcja (cytochrom z serca konia)
3. Spektrometria mas białek: masa molowa i masa monoizotopowa, metody jonizacji (ESI), obliczanie wartości m/z jonów
wielokrotnie naładowanych (ESI), dekonwolucja.
4. Metody ustalania sekwencji białek. Enzymy proteolityczne, proteomika, bazy danych (MASCOT, Expasy, PDB i inne).
5. Sephadex jako podłoże w chromatografii (filtracja żelowa). Rodzaje żeli i kryteria rozdziału substancji. Wyznaczanie objętości
martwej.
Widmo MS niemodyfikowanego cytochromu zostanie omówione w czasie zajęć.
Przykładowe pytania:
1. Jaka jest funkcja biologiczna cytochromu C?
2. Jakie elementy cytochromu C ulegają acetylowaniu? Napisz schemat reakcji.
3. Co to jest objętość martwa kolumny?
4. Na czym polega rozdział substancji w chromatografii kolumnowej na złożu Sephadex?
5. Na kolumnę wypełnioną złożem Sephadex G-10 naniesiono mieszaninę cytochromu i bezwodnika octowego (po reakcji
acetylowania). W jakiej kolejności substancje opuszczą kolumnę? Czy kolejność będzie taka sama dla Sephadexu G-200?
6. W jakim celu stosuje się w tym ćwiczeniu chromatografię kolumnową?
7. Jaka będzie wartość m/z jonu o ładunku +10 na widmie ESI-MS białka o masie 14 500?
8. Czy uzyskana z pomiaru MS masa cytochromu jest taka sama jak masa obliczona na podstawie sekwencji?
Literatura:
1. A. Kraj, A. Drabik, J. Silberring (red) Proteomika i metabolomika, WUW, 2010
2. L. Kłyszejko-Stefanowicz (red.) Ćwiczenia z biochemii, PWN, 1999 i późniejsze
3. S. Doonan, Białka i peptydy, PWN 2008
4. H-D. Jakubke, H. Jeschkeit, Aminokwasy, peptydy, białka, PWN 1989