StreszczeniePhD_InacristGeronimo

Streszczenie
Degradacja poprzez utlenianie związków aromatycznych zawierających grupę nitrową
katalizowana
przez
dioksygenazy
nitroarenowe
może
przebiegać
poprzez
dwie
konkurencyjne drogi - cis-dihydroksy-utlenianie aromatycznego pierścienia i monohydroksyutlenianie łańcucha bocznego. W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowe badania
mechanizmu tych dróg na przykładzie utleniania 2-nitrotoluenu przez dioksygenazę
nitrobenzenową (NBDO). Wykonano obliczenia przy użyciu teorii funkcjonału gęstości
elektronowej (DFT) dla modelu klasterowego centrum aktywnego enzymu w celu zbadania
możliwych mechanizmów reakcji, natomiast wpływ otoczenia reszty enzymu na te reakcje
został zbadany przy użyciu hybrydowego poziomu teorii łączącego mechanikę kwantową z
mechaniką molekularną (QM/MM) w schemacie ONIOM. Stwierdzono, że cis-dihydroksyutlenianie
i
monohydroksy-utlenianie
mają
porównywalne
bariery
energetyczne,
odpowiednio 14.5 i 13.4 kcal/mol, chociaż druga z tych reakcji prowadzi do bardziej
stabilnych produktów. Na selektywność enzymu duży wpływ ma orientacja substratu
względem reszt aminokwasowych tworzących centrum aktywne. Obliczenia wykonane na
poziomie mechaniki molekularnej z wykorzystaniem ciągłego modelu rozpuszczalnika
wskazują, że wiązanie substratu do enzymu prowadzące do powstania cis-diolu wymaga
podobnej energii zarówno w przypadku dzikiego enzymu jak i jego F293I mutanta, jednakże
w przypadku formy zmutowanej substrat znajduje się bliżej reszt aminokwasowych centrum
aktywnego niż w przypadku formy dzikiej co może faworyzować cis-dihydroksylację w
mutancie. Z drugiej strony, bardziej stabilne wiązanie substratu z enzymem w przypadku
mutacji N258V prowadzi do powstania alkoholu, co jest zgodne z obserwacjami
doświadczalnymi, z których wynika że wiązanie wodorowe pomiędzy grupą nitrową
substratu a grupą amidową asparaginianu jest elementem determinującym powstawanie cis-
diolowego produktu.
Przeprowadzone badania wskazują, że rzeczywistym czynnikiem utleniajacym, który
atakuje substrat jest HO-FeV=O pomimo, że doświadczalnie obserwowany jest FeIII-OOH.
Mechanizm cis-dihydroksylacji obejmuje pierwotny atak hydroksy-liganda na węgiel C3
2-nitrotoluenu, po którym następuje atak oksy-liganda na atom węgla C2, do którego
przyłączona jest grupa nitrowa. W przypadku monohydroksylacji, pierwszym etapem jest
oderwanie atomu wodoru z grupy metylowej łańcucha bocznego przez okso-ligand.
Końcowy produkt alkoholowy powstaje następnie w wyniku rekombinacji centrum
rodnikowego zlokalizowanego na metylenowym atomie węgla z powstałą grupą
hydroksylową. Z cis-dihydroksylacją związany jest pierwotny kinetyczny efekt izotopowy
węgla
13
C równy 1.03 oraz odwrotny wtórny kinetyczny efekt izotopowy wodoru 2H
wynoszący 0.93. Wartości te w używanej w badaniach środowiskowych nomenklaturze
współczynnika wzbogacenia izotopowego uśrednionego dla całej cząsteczki wynoszą
odpowiednio -6.7‰ dla węgla i 15.5‰ dla wodoru. Monohydroksylację natomiast
charakteryzuje duży pierwotny kinetyczny efekt izotopowy wodoru 2H wynoszący 6.6 (ε
= -447‰) oraz pierwotny kinetyczny efekt izotopowy
13
C równy 1.01 (ε = -2.4‰). Obie
drogi utleniania wykazują pomijalnie mały kinetyczny efekt izotopowy azotu
15
N ponieważ
grupa nitrowa substratu nie jest bezpośrednio zaangażowana w procesy zrywania i tworzenia
wiązań. Sygnatury izotopowe obu konkurencyjnych dróg reakcji różnią się w stopniu
wystarczającym na określenie dominującego mechanizmu utlenienia na podstawie
monitorowania składu izotopowego reagentów metodą pomiaru uśrednionego dla całej
cząsteczki składu izotopowego (CSIA).