Załącznik nr 2 Autoreferat Enzymy jako bezpieczna alternatywa dla

Transkrypt

Załącznik nr 2
Autoreferat
Enzymy jako bezpieczna alternatywa dla kwasów
w ekstrakcji pektyn
dr Agnieszka Wikiera
Kraków, 2016
1. Imię i nazwisko: Agnieszka Wikiera
Miejsce pracy:
Katedra Biotechnologii Żywności
Wydział Technologii Żywności
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
ul. Balicka 122, 30-149 Kraków
2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe - z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania
oraz tytuł rozprawy doktorskiej
1996
dyplom magistra biologii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu
Jagiellońskiego. Praca magisterska pt. „Wpływ temperatury i osmolarności
na celomocyty dżdżownic”, promotor: prof. dr hab. Barbara Płytycz, recenzent: prof. dr hab. Henryk Szarski. Praca obroniona 31 maja 1996 r.
2003
dyplom doktora nauk rolniczych w zakresie technologii żywności i żywienia, Wydział Technologii Żywności Akademii Rolniczej w Krakowie.
Rozprawa doktorska pt. „Dostosowanie preparatu enzymatycznego Pektopol PT400 do potrzeb przemysłu paszowego” promotor: prof. dr hab.
Krzysztof Żyła, recenzenci: prof. dr hab. Maciej Kujawski, prof. dr hab.
Waldemar Rymowicz. Praca obroniona 9 lipca 2003 r.
3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych
1996-1997
starszy referent inżynieryjno-techniczny w Zakładzie Neuroanatomii,
Instytutu Zoologii Uniwersytetu Jagiellońskiego
1997-2004
od października 1997 r. asystent naukowo-dydaktyczny w Katedrze Biotechnologii Żywności, Wydziału Technologii Żywności Akademii Rolniczej im. Hugona Kołłątaja w Krakowie
2004 - obecnie
od lipca 2004 adiunkt naukowo-dydaktyczny w Katedrze Biotechnologii
Żywności, Wydziału Technologii Żywności Akademii Rolniczej (od 2008
roku Uniwersytetu Rolniczego) im. Hugona Kołłątaja w Krakowie
1
4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r.
o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki
(Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.):
a) tytuł osiągnięcia naukowego i publikacje wchodzące w jego skład
Osiągnięciem naukowym będącym podstawą złożonego przeze mnie wniosku o wszczęcie
postępowania habilitacyjnego jest jednotematyczny cykl siedmiu publikacji pod zbiorczym
tytułem „Enzymy jako bezpieczna alternatywa dla kwasów w ekstrakcji pektyn”, w skład
którego wchodzą następujące prace:
1.
Wikiera A. (90%), Mika M. 2013. Budowa i właściwości pektyn. Postępy Biochemii,
59(1): 89-94, IF: 0,00; MNiSW = 8 pkt
2.
Wikiera A. (80%), Irla M., Mika M. 2014. Prozdrowotne właściwości pektyn. Postępy
Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 68: 590-596, IF: 0,57; MNiSW = 15 pkt
3.
Wikiera A. (80%), Mika M., Grabacka A. 2015. Multicatalytic enzyme preparations as
effective alternative to acid in pectin extraction. Food Hydrocolloids, 44: 156-161,
IF: 3,86; MNiSW = 45 pkt
4.
Wikiera A. (80%), Mika M., Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B. 2015. Development
of complete hydrolysis of pectin from apple pomace. Food Chemistry, 172(1): 675-680,
5.
Wikiera A. (80%), Mika M., Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B. 2015. Application of
Celluclast 1.5L in pectin extraction. Carbohydrate Polymers, 134: 251-257,
6.
Wikiera A. (80%), Mika M., Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B. 2016. Endoxylanase and endo-cellulase - assisted extraction of pectin from apple pomace. Carbohydrate Polymers, 142: 199-205, IF: 4,22; MNiSW = 40 pkt
7. Wikiera A. (80%), Barański D., Starzyńska-Janiszewska A., Byczyński Ł. 2015. Effects of
extraction condition on biological activity of apple pectin. XIX Międzynarodowa Konferencja Laboralim: o analytických metódach v potravinárstve, 5-6 marca 2015 r., Gabčíkovo,
Słowacja. Zbornik vedeckych prac s. 385-388, IF: 0,00; MNiSW = 0 pkt
Sumaryczny impact factor i liczba punktów MNiSW dla wskazanego cyklu publikacji to:
IF = 16,92; MNiSW = 188 pkt (dane z roku ukazania się publikacji).
Oświadczenia współautorów powyższych prac określające ich indywidualny wkład w powstanie publikacji znajdują się w załączniku nr 5.
2
b) Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich
ewentualnego wykorzystania
Wprowadzenie
Pektyny to heteropolisacharydy stanowiące 30-40% suchej masy ścian komórek roślin
wyższych [1], charakteryzujące się niezwykle skomplikowaną i różnorodną strukturą zależną
od gatunku rośliny, typu tkanki i jej wieku. Zawsze można w nich jednak wyróżnić homogalakturonian (HG), czyli linearny homopolimer kwasu galakturonowego o różnym stopniu metylacji i acetylacji; ramnogalakturonian I (RG-I) będący heteropolimerem o szkielecie zbudowanym
z powtarzających się dimerów kwasu galakturonowego i ramnozy, do którego przyłączone są
różne boczne łańcuchy cukrowe, głównie arabiniany i galaktany; oraz ramnogalakturonian II
(RG-II) będący poligalakturonianem z licznymi łańcuchami bocznymi zawierającymi nietypowe cukry, jak metylo-L-fukoza, kwas acerowy czy kwas 3-deoksy-D-manno-2-oktulosonowy
[2]. Wymienione komponenty pektyn mogą łączyć się kowalencyjnie, tworząc pektynową sieć
w ścianie pierwotnej i blaszce środkowej ściany komórkowej roślin. Utworzona w ten sposób
struktura może być dalej modyfikowana przez znajdujące się w ścianie komórkowej enzymy.
Do najważniejszych modyfikacji pektyn należą metylacja, acetylacja, ksylozylacja i apiozylacja
reszt kwasu galakturonowego [3]. Szczegóły dotyczące budowy pektyn in muro, jak również
zmiany dokonujące się w ich strukturze podczas ekstrakcji, zostały opisane szerzej w pracy
przeglądowej stanowiącej pozycję nr 1 cyklu publikacji będących podstawą złożonego przeze
mnie wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego.
Pektyny, ze względu na właściwości biologiczne, fizyczne i chemiczne budzą wielkie
zainteresowanie naukowców, znajdują też coraz szersze zastosowanie w różnych gałęziach
przemysłu, o czym świadczy ciągle wzrastający na nie popyt. W przemyśle spożywczym pektyny są stosowane m.in. jako składnik żelujący w produkcji dżemów i galaretek, jako zagęszczacz, emulgator i stabilizator napojów z mleka acydofilnego, margaryn, majonezów i sosów
sałatkowych [4], jako substytut tłuszczu w produktach cukierniczych, wypiekach i lodach [5]
oraz jako czynnik poprawiający właściwości użytkowe filmów i powłok białkowych [6]. Pektyny natywne spożywane wraz z dietą spełniają ważną rolę w walce z nadmiarem cholesterolu
we krwi, otyłością i cukrzycą typu II. Odpowiednio spreparowane mogą natomiast dodatkowo
wykazywać działanie przeciwzapalne, a nawet hamować rozwój nowotworów i indukować
3
apoptozę komórek rakowych, o czym piszę szerzej w pracy nr 2 prezentowanego osiągnięcia
naukowego.
Na skalę przemysłową pektyny pozyskuje się głównie ze skórek owoców cytrusowych i
wytłoków jabłkowych, będących odpadem po produkcji soków. Zawartość pektyn w tych surowcach szacuje się na 16-20% w przypadku wytłoków jabłkowych [7,8] i 20-30% w przypadku skórek cytrusów [9,10]. Stale poszukuje się też alternatywnych źródeł tego polimeru. Szczególnie dużym zainteresowaniem cieszą się odpady przemysłu tłuszczowego (łuski soi i głowy
słonecznika), cukrowniczego (wytłoki buraków cukrowych) i cukierniczego (łuski ziarna kakao) [11]. Typowa przemysłowa metoda izolacji pektyn, zgodnie z opisem przedstawionym w
pracy nr 1 niniejszego wniosku, opiera się na ekstrakcji kwasami: solnym, siarkowym, azotowym lub cytrynowym prowadzonej w pH 1-3, w temperaturze 80-100oC przez 1-12 godzin.
Podczas jej przebiegu obowiązuje zasada: im drastyczniejsze warunki tym niższy stopień polimeryzacji i estryfikacji oraz mniejsza zawartość cukrów obojętnych w uzyskanej pektynie.
Wydajność przemysłowej ekstrakcji waha się w przedziale 10-15 g pektyny ze 100 g wytłoków
jabłkowych [9] i 15-18 g pektyny ze 100 g skórek cytrusów [12]. Dla żadnego z surowców nie
jest więc to ekstrakcja kompletna. Do innych niewątpliwych wad stosowanej przemysłowo
technologii izolacji pektyn należy zaliczyć: (i) konieczność dokładnego rozdrobnienia surowca,
co utrudnia późniejszą filtrację, (ii) konieczność wstępnego wielokrotnego ługowania surowca,
co zapobiega ciemnieniu produktu, ale jednocześnie generuje straty surowca i wielokrotnie
zwiększa objętość ścieków, (iii) bardzo niskie pH procesu, które w połączeniu z wysoką temperaturą powoduje korozję i szybkie zużywanie się sprzętu. Problem stanowić może również (iiii)
utylizacja znacznej ilości mocno zakwaszonych ścieków i odpadów. Stąd stale próbuje się doskonalić tradycyjną metodę ekstrakcji pektyn np. przez zastosowanie wrzącej (140oC) sprężonej
wody [13] lub wstępne potraktowanie surowca mikrofalami [14], ultradźwiękami [15], a nawet
substancjami chelatującymi takimi jak EDTA, które osłabiają interakcje między pektyną i
dwuwartościowymi kationami [16]. Moim zdaniem najlepszą alternatywą dla kwasowej ekstrakcji pektyn, pozwalającą wyeliminować większość wad tej technologii, a być może również
otrzymać polimer o jeszcze ciekawszych właściwościach, będzie zastąpienie kwasów enzymami, a więc katalizatorami bardziej selektywnymi, zdolnymi do efektywnej pracy w łagodnych
warunkach i przy bardzo niskich stężeniach.
4
Cel i zakres badań
Celem prac badawczych, których wyniki złożyły się na cykl publikacji stanowiących
podstawę złożonego przeze mnie wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego, było w
pierwszej kolejności opracowanie takiej metody ekstrakcji pektyny z wytłoków jabłkowych,
która przy dużej wydajności będzie spełniała wymogi zielonej chemii. Polska jest drugim na
świecie producentem jabłek, a wytłoki będące odpadem z ich przetwarzania to w naszym kraju
potencjalnie najlepszy surowiec do izolacji pektyny, ciągle nie do końca zagospodarowany. W
charakterze czynnika ekstrakcyjnego zastosowałam zarówno tanie, łatwo dostępne wieloaktywnościowe preparaty enzymatyczne, jak i oczyszczone, monoaktywnościowe preparaty endocelulazy i endo-ksylanazy. Pierwsza ścieżka badawcza wydawała się szczególnie istotna dla
ewentualnych zastosowań przemysłowych. Druga, umożliwiała wskazanie aktywności enzymatycznej najistotniejszej dla procesu uwalniania pektyny, stwarzając jednocześnie szansę poznania ciągle niejasnych powiązań frakcji pektynowej z filamentami celulozowymi i hemicelulozowymi w ścianie komórkowej. Wszystkie otrzymywane pektyny poddawano szczegółowej
analizie ilościowej i jakościowej, która miała na celu poznanie zależności pomiędzy sposobem
ekstrakcji a składem polimeru i jego masą cząsteczkową. Dla weryfikacji przypuszczenia, że
łagodne warunki izolacji mogły wpłynąć korzystnie na właściwości biologiczne pektyny oceniano jej zdolność do wygaszania wolnych rodników i redukcji jonów żelaza oraz wpływ na
proliferację i inwazyjność komórek różnych linii nowotworowych. W celach porównawczych
przeprowadzono również ekstrakcję pektyny z wytłoków jabłkowych metodą konwencjonalną z
wykorzystaniem kwasu siarkowego, a uzyskany polimer poddano analogicznym analizom jak
pektyny otrzymywane enzymatycznie.
Oddzielny cel badawczy, który wynikł w trakcie analizy składu pektyn, stanowiło opracowanie metody ich hydrolizy, pozwalającej na całkowitą depolimeryzację z zachowaniem
fizycznych, jak i chemicznych właściwości wszystkich uwalnianych monomerów. Tylko taka
hydroliza mogła umożliwić precyzyjne i jednoznaczne określanie składu i struktury izolowanych enzymatycznie pektyn technikami wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Opisywane
wcześniej w literaturze metody hydrolizy były nieskuteczne wobec pektyn tego typu, a ich zastosowanie wiązało się ze znaczącym, u niektórych badaczy wynoszącym nawet 40%, niedoszacowaniem łącznej sumy cukrów obojętnych i kwasu galakturonowego w cząsteczkach polimeru.
5
Materiały i metody badawcze
Surowiec i enzymy
W badaniach użyto suszone wytłoki jabłkowe pozyskane z firmy Pektowin S.A. (aktualnie Naturex Company), będące produktem odpadowym po tłoczeniu soku bez użycia enzymów, wykorzystywane standardowo do przemysłowej produkcji pektyny w tym zakładzie. Materiał przed ekstrakcją ługowano kilkakrotnie wodą destylowaną, tak aby stężenie ekstraktu
refraktometrycznego wody ługującej było poniżej 1%. Wyługowane wytłoki suszono do stałej
masy (60oC, 24 godz.), część przesiewano przez sito 4 mesh (4,75 mm), a część rozdrabniano
do ziaren przechodzących przez sito 40 mesh (0,47 mm). W badaniach stosowano też wytłoki
nieługowane. Zawartość suchej masy w wytłokach przygotowanych do ekstrakcji pektyn wynosiła 94,77%.
Do ekstrakcji pektyny stosowano trzy wieloaktywnościowe preparaty enzymatyczne
rozluźniające tkanki roślinne: Celluclast® 1.5L (Novozymes Corp.), Viscoferm® (Novozymes
Corp) i Econase® CE (AB Enzymes Corp.) oraz preparaty monoaktywnościowe endo-celulazę
(endo-β-1,4-glukanaza, EC 3.2.1.4) i endo-ksylanazę (endo-β-1,4-ksylanaza, EC 3.2.1.8) zakupione w firmie Sigma Chemical Co. W preparatach wieloaktywnościowych, przed zastosowaniem analizowano poziom aktywności rozluźniających tkanki roślinne: ogólnej pektynolitycznej, pektynoesterazy i poligalakturonazy [17], celulazy i ksylanazy [18], 1,3-β-glukanazy i ramnogalakturonazy [19] oraz mannozydazy i arabanazy.
Ekstrakcja pektyny metodą kwasową
Pektynę z wytłoków jabłkowych o stopniu rozdrobnienia 4 i 40 mesh ekstrahowano
kwasem siarkowym przy stałym wytrząsaniu (200 rpm) i stosunku wytłoki (g) : ekstrahent (ml)
wynoszącym 1:5, 1:8, 1:10, 1:15, 1:20 i 1:25. Temperaturę ekstrakcji ustalono na 85oC, pH na
2, a czas na 3 godziny, zgodnie z parametrami stosowanymi w przemyśle [20]. Ekstrakcje wykonano w 6 powtórzeniach.
Ekstrakcja pektyny przy użyciu enzymów
Parametry ekstrakcji pektyny preparatami wieloaktywnościowymi optymalizowano w
kilku etapach. W pierwszym etapie optymalizowano pH procesu przy stałej temperaturze
(40oC), czasie (3 godz.) i dawce preparatów enzymatycznych (50 µl/1 g wytłoków). Po ustaleniu wartości pH optymalnej dla działania każdego preparatu zbadano wpływ rozdrobnienia materiału ekstrakcyjnego i objętości roztworu ekstrahującego na wydajność izolacji pektyny. Po6
dobnie jak w ekstrakcji kwasowej stosowano wytłoki jabłkowe o stopniu rozdrobnienia 4 i 40
mesh, a objętość roztworu ekstrahującego przypadającą na 1 g surowca ustalono na 5, 8, 10, 15,
20 i 25 ml. Ekstrakcję prowadzono przez 3 godz. w temp. 40oC przy pH optymalnym dla poszczególnych preparatów i dawce enzymów wynoszącej 50 µl/g. Kolejno podjęto próbę ustalenia temperatury, czasu i dawki preparatów, przy których proces ekstrakcji pektyny będzie przebiegał z największą wydajnością. W tym celu doświadczenia prowadzono w 4 powtórzeniach
stosując metodę powierzchni odpowiedzi (RSM) z trzyczynnikowym i trzypoziomowym centralnym planem kompletnym. Parametry wejściowe doświadczenia ustalono na poziomie: temp.
40, 50 i 60oC, czas ekstrakcji 6, 10 i 18 godz., dawki preparatów 10, 25 i 50 µl/1 g wytłoków
jabłkowych. Każdą ekstrakcję prowadzono w wyznaczonym uprzednio, optymalnym dla działania poszczególnych preparatów pH, przy optymalnym stosunku (w/v) wytłoki : roztwór ekstrahujący i wobec surowca, którego stopień rozdrobnienia uznano wcześniej za optymalny.
Ekstrakcję pektyny z wytłoków jabłkowych w obecności wodnych roztworów endocelulazy, endo-ksylanazy i obu preparatów jednocześnie prowadzono przy stałym wytrząsaniu
(200 rpm), w warunkach optymalnych dla działania tych enzymów tj. pH 5 i temp. 40oC, przy
stosunku wytłoki : ekstrahent równym 1 g :15 ml. Dawkę każdego z preparatów ustalono na 50
U/g, a czas ekstrakcji na 10 godz. Stosowano wytłoki rozdrobnione do ziaren przechodzących
przez sito 40 mesh (0,47 mm). Każdą ekstrakcję wykonano w 5 powtórzeniach.
Strącanie pektyny
Po ekstrakcji próbki studzono do 20oC i wirowano (4100 rpm, 10 min, 4oC). Supernatant
przepuszczano przez miękki sączek, osad przemywano wodą destylowaną, ponownie wirowano
i sączono. Zebrane przesącze zalewano 96% etanolem o temp. 4oC. Objętość etanolu ustalano
tak, by jego końcowe stężenie wynosiło 70%. Strąconą pektynę odwirowywano (4000 rpm, 20
min, 4oC), przemywano 70% etanolem i jeszcze raz wirowano, przenoszono ilościowo do naczynek wagowych i suszono do stałej masy w temp. 60oC przez 24 godziny. Otrzymane pektyny rozdrabniano do ziaren przechodzących przez sito 60 mesh (0,251 mm).
Analiza wydajności ekstrakcji i składu pektyn
 Wydajność ekstrakcji pektyn obliczano ze stosunku suchej masy wyizolowanej pektyny do
suchej masy użytych do ekstrakcji wytłoków jabłkowych x 100%;
 Zawartość wody w pektynach wyliczano jako ubytek masy po trzygodzinnym suszeniu (do
stałej masy) w temp 105oC;
7
 Popiół oznaczano wagowo po spaleniu pektyn w piecu muflowym (600oC, 2 godz.);
 Zawartość substancji nierozpuszczalnych i klarowność roztworów pektyn oceniano zgodnie z procedurą opracowaną przez Ohishi i in. [21];
 pH wodnych roztworów pektyn (1g/100 ml) badano w temp 25oC po 5 godz. rozpuszczania
polimeru w temp. 60oC;
 Białko całkowite wyliczano jako N x 6,25 gdzie N oznaczano metodą Nesslera w modyfikacji Hacha [22];
 Sumę fenoli oznaczano spektrofotometrycznie metodą z odczynnikiem Folina-Ciocalteu;
 Masę cząsteczkową oznaczano metodą HPLC na kolumnie TSKgel GMPWxl (300 x 7,8
mm, 13 µm) stosując detektor RI i wzorce dekstranowe o masach 25,4-1050 kDa;
 kwas galakturonowy (GalA) oznaczano dwoma metodami. W pracy 3 próbki pektyn najpierw poddawano hydrolizie kombinowanej kwasowo-enzymatycznej opisanej przez Garna
i in. [23], a otrzymane hydrolizaty nanoszono na kolumnę Carbo-Pac PA 100 (250 x 4 mm)
i eluowano izokratycznie mieszaniną CH3COONa i NaOH (1:1). W pracach 5 i 6 zastosowano autorską hydrolizę pektyn opisaną w publikacji 4. W tym przypadku rozdział hydrolizatów prowadzono na kolumnie Hyper-Carb (100 x 4,6 mm) używając 0,05% TFA jako
fazę mobilną.
 Cukry obojętne (NS): glukozę, galaktozę, arabinozę, ramnozę, ksylozę, mannozę i fukozę
po kombinowanej [23] (praca 3) lub autorskiej (prace 5 i 6) hydrolizie pektyn rozdzielano
na kolumnie CarboPacTM PA 20 (150 x 3 mm), w temp. 20oC i oznaczano z użyciem detektora elektrochemicznego zgodnie z metodyką podaną przez Arnous i Meyer [24].
 Stopień metylacji (DM) i acetylacji (DAc) pektyn oznaczano techniką HPLC na kolumnie
C18 (250 x 4,6 mm) po uprzednim zmydleniu próbek zgodnie z pracą Levigne i in. [25].
Oznaczanie aktywności biologicznej pektyn
Antyoksydacyjne i antyrodnikowe właściwości uzyskanych pektyn szacowano na podstawie testów neutralizacji syntetycznych wolnych rodników ABTS+• [26] i DPPH• [27] wyznaczając IC50, tj. takie stężenie roztworu pektyny, które zmniejsza stężenie wolnego rodnika o
50%. Oznaczono również siłę redukującą pektyn pojmowaną jako zdolność do redukcji w warunkach in vitro jonów Fe(III) do Fe(II).
Potencjał antynowotworowy pektyn oceniano na podstawie ich wpływu na proliferację
(żywotność) i inwazyjność linii komórkowych nowotworów jelita grubego człowieka Caco-2 i
HT-29 oraz komórek czerniaka B16F10 w hodowlach in vitro. Pektyny stosowano w dawkach
8
od 0,25 do 1 mg na ml płynu hodowlanego. Żywotność komórek nowotworowych w obecności
pektyn oznaczano w teście z fioletem krystalicznym, a ich inwazyjność szacowano na podstawie zdolności do penetracji warstwy matriżelu (BD Biosceiences, MA, USA) pokrywającego
inserty z błoną o średnicy porów równej 8 µm.
Omówienie wyników
Użycie preparatów enzymatycznych w procesie ekstrakcji pektyn z wytłoków jabłkowych wydaje się być dobrą alternatywą dla powszechnie stosowanych w tym celu kwasów.
Enzymy są bardzo aktywne i w odróżnieniu od kwasów wysoce specyficzne wobec swoich
substratów. Mogą działać skutecznie nawet w bardzo łagodnych warunkach temperatury i pH.
Problem stanowi jednak znalezienie preparatu, który przy niskich kosztach użycia zapewniałby
absolutnie selektywną dezintegrację struktury tak złożonej jak roślinna ściana komórkowa. W
swoich pracach do zadań takich wytypowałam 3 dostępne powszechnie na rynku preparaty wieloaktywnościowe, stosowane już wcześniej z powodzeniem w technologii żywności i żywieniu
zwierząt: Viscozyme, Celluclast 1.5L i Econase CE. Każdy z nich według danych producenta
posiadał zdolność rozluźniania tkanek roślinnych opartą na wysokiej aktywności celulolitycznej
bądź ksylanolitycznej, co zgodnie z wynikami prac innych badaczy [28,29,30], dawało szansę
selektywnego odhydrolizowania pektyn od pozostałych polimerów ściany komórkowej. Badania rozpoczęto od wieloetapowego procesu ustalenia warunków optymalnych dla uwalniania
pektyny z wytłoków jabłkowych przez każdy z testowanych preparatów (praca 3). Okazało się,
że największą skuteczność w procesie ekstrakcji pektyny preparaty te wykazywały już w temp.
40-50oC w pH równym 4,5. Żaden z nich nie wymagał stałego buforowania środowiska reakcji,
dlatego nie stosowano buforu, tylko dalsze ekstrakcje prowadzono przy użyciu wody o wstępnie ustalonym pH. Doświadczenia przeprowadzone na nieługowanych wytłokach, których użycie w kwasowej izolacji pektyny jest niedopuszczalne, bo prowadzi do ciemnienia nieenzymatycznego pokazały, że w warunkach optymalnych dla ekstrakcji enzymatycznej tj. w pH 4,5 i
50oC proces ten nie zachodził. Zmiana warunków ekstrakcji dała więc możliwość skrócenia, a
nawet pominięcia etapu dokładnego wymywania cukrów prostych z materiału ekstrakcyjnego
(ługowania), co w praktyce przemysłowej powinno prowadzić do zminimalizowania ilości generowanych ścieków i ograniczenia strat surowca. Ponadto przy zastosowaniu łagodnych warunków ekstrakcji enzymatycznej może zostać wyeliminowany kolejny duży problem związany
ze standardowym procesem kwasowym, tj. szybkie korodowanie aparatury. W dalszych badaniach zauważyliśmy, że żaden z testowanych preparatów wieloaktywnościowych, w odróżnie9
niu od kwasu, do skutecznego działania nie wymagał ani dokładnego rozdrobnienia surowca
ani jego dużego uwodnienia. Największą wydajność enzymatycznej ekstrakcji pektyny obserwowano z wytłoków nie poddanych dodatkowemu mieleniu, tj. o średnicy cząstek równej 4
mesh oraz przy stosunku sucha masa (g): ekstrahent (ml) wynoszącym zaledwie 1:10 (Econase)
lub 1:15 (Viscoferm i Celluclast). Wydajnej ekstrakcji kwasowej sprzyjało natomiast bardzo
dokładne rozdrobnienie surowca (do 40 mesh) i jego dwukrotnie większe uwodnienie, podobne
do tego, jakie odnotowali inni badacze, wynoszące nawet 1g : 25 ml [8,16,31]. Ta część badań
pozwoliła nam wnioskować, że zastąpienie kwasów enzymami rozluźniającymi tkanki roślinne
w przemysłowej produkcji pektyny mogłoby dać, prócz wskazanych wcześniej korzyści, możliwość pominięcia kosztownego etapu mielenia surowca, a co za tym idzie ułatwienie późniejszej filtracji. Mogłoby także usprawnić proces strącania pektyny z roztworu (ze względu na
mniejszą objętość ekstrahenta do odparowania) i kolejny raz ograniczyć ilość ścieków.
Następnym etapem optymalizacji procesu enzymatycznej ekstrakcji pektyny było ustalenie czasu i dawki preparatów, przy których izolacja polimeru mogłaby przebiegać z największą wydajnością. Zmieniając te parametry w przedziałach odpowiednio: 6, 10 i 18 godzin oraz
10, 25 i 50 µl/1 g wytłoków zauważyliśmy, że wydajność ekstrakcji pektyny w najwyższym
stopniu zależała od dawki preparatów enzymatycznych, a w nieco mniejszym stopniu od czasu
trwania procesu. Ilość pektyny uwalnianej ze 100 g surowca w trakcie doświadczenia optymalizacyjnego zmieniała się w przedziałach od 3,41-11,78 g dla najmniej skutecznego preparatu,
którym był Econase, przez 8,24-17,86 g dla preparatu Viscoferm, po 8,07-18,95 g w obecności
najskuteczniejszego w badaniach preparatu Celluclast. W każdym przypadku maksymalną wydajność izolacji pektyny obserwowano przy najwyższej badanej dawce preparatów (50 µl/1 g
wytłoków) po 18 godzinnej ekstrakcji. Przedstawione w publikacji 5 próby dalszego podnoszenia wydajności ekstrakcji pektyny poprzez zwiększenie dawki preparatu Celluclast pokazały, że
ta prawie 19% wydajność procesu opisana w pracy nr 3 jest najwyższą jaką można osiągnąć
przy udziale tego koktajlu enzymatycznego. Maksymalna wydajność ekstrakcji kwasowej była
istotnie niższa od otrzymanej w obecności preparatów Celluclast i Viscoferm i wynosiła
14,52%. Podobną ilość pektyny można było otrzymać stosując preparat Celluclast w dawce
nieprzekraczającej 25 µl/1 g surowca (praca 5). Na wyższą od kwasowej skuteczność enzymatycznej ekstrakcji pektyn wskazywali wcześniej Panouillé i in. [32] oraz Ptichkina i in. [29], ale
izolowane przez nich polimery z dyni, kalafiora i cykorii miały znacząco niższe masy cząsteczkowe i zawierały istotnie mniej kwasu galakturonowego niż pektyna uzyskana z tego samego
10
źródła konwencjonalnie. Problemu takiego nie generowały zastosowane przez nas preparaty
enzymatyczne. Otrzymane przy ich użyciu pektyny w porównaniu do pektyny izolowanej kwasowo cechowała od 1,6 (Econase) do 2,5 razy (Celluclast) większa masa cząsteczkowa i porównywalna lub wyższa zawartość kwasu galakturonowego. Podczas ekstrakcji enzymatycznej
nie mogło więc dochodzić do depolimeryzacji pektyny, jak to miało miejsce w cytowanych
wyżej pracach [29,32] lecz przeciwnie, musiała być ona wycinana ze ścian komórkowych wraz
z fragmentami innych polisacharydów strukturalnych, a nawet z białkiem związanym z arabinogalaktanem-II i następnie razem z nimi strącana. Szczegółowa analiza pokazała, że pektyny
izolowane z wytłoków jabłkowych enzymami zawierały rzeczywiście istotnie więcej białka
(maksymalnie 2,43%) niż pektyna otrzymana z tego samego materiału konwencjonalnie
(0,95%). Jednak w żadnym przypadku wartości te nawet nie zbliżyły się do 30%, o których w
pektynach izolowanych preparatami celulolitycznymi i pektynolitycznymi donosili wcześniej
Panouillé i in. [32] i Zykwinska i in. [33]. Ilość białka w otrzymanych przez nas pektynach nie
przekraczała też norm przyjętych dla pektyn dopuszczonych do obrotu. Zgodnie z tymi normami zawartość azotu w pektynach nie powinna być większa niż 2,5%, co odpowiada ilości białka
równej 15,625% [34]. Duża masa cząsteczkowa otrzymanych przez nas pektyn (312-490 kDa)
musiała więc być konsekwencją przede wszystkim znacząco większej zwartości polisacharydów obojętnych i/lub poligalakturonianu. Niestety nie potwierdziła tego w pełni przedstawiona
w pracy nr 3 szczegółowa analiza HPLC. Jedynie w pektynie izolowanej preparatami Viscoferm i Econase oznaczono odpowiednio o 5,9 i o 3,2% więcej GalA, ale już o około 13% mniej
cukrów obojętnych niż w pektynie otrzymywanej konwencjonalnie. Suma obu tych składników
(NS + GalA) w pektynach izolowanych enzymami była średnio aż o 10% niższa niż w pektynie
ekstrahowanej kwasem, dla której wynosiła prawie 84% s.m. Wyniki takie wskazywały na błędy w oznaczeniu. Analizując szczegółowo prace innych autorów zaobserwowaliśmy, że podobne nieprawidłowości w szacowaniu składu pektyn izolowanych enzymatycznie są powszechne
[30,33,35]. W skrajnych przypadkach suma cukrów obojętnych i kwasu galakturonowego
oznaczonych w pektynach izolowanych enzymami nie sięgała nawet 60% s.m., podczas gdy,
niezależnie od pochodzenia pektyny, powinna zbliżać się do 90% [36]. W każdej z przytaczanych publikacji skład pektyny szacowano sprawdzonymi technikami wysokosprawnej chromatografii cieczowej, które wymagają jednak uprzedniej hydrolizy polimeru, a ta zależy ściśle od
budowy degradowanego związku. Na tej podstawie wysunęliśmy przypuszczenie, że stosowane
dotąd metody hydrolizy kwasowej [24,37,38], enzymatycznej [23,39] i kombinowanej [23]
11
poliuronidów nie są odpowiednie do kompletnej depolimeryzacji pektyn izolowanych enzymatycznie. Dlatego zasadniczym celem naszych dalszych badań stało się opracowanie metody
hydrolizy pektyn ekstrahowanych enzymami, która umożliwi całkowitą ich depolimeryzację z
zachowaniem fizycznych, jak i chemicznych właściwości wszystkich uwalnianych monomerów, co z kolei pozwoli na precyzyjne i jednoznaczne określanie składu i struktury takich pektyn technikami HPLC (praca 4). Do badań wykorzystaliśmy pektyny odznaczające się największymi masami cząsteczkowymi, izolowane z wytłoków jabłkowych przy użyciu enzymów (ksylanazy i preparatu Celluclast) oraz w celach porównawczych wytłoki jabłkowe. Hydrolizę prowadzono metodą chemiczną z zastosowaniem 2 M TFA w 100 i 120oC przez 1; 1,5; 2; 2,5; 3 i 4
godziny, oraz metodą kombinowaną kwasowo-enzymatyczną przy użyciu najpierw 0,2 M TFA
przez 72 godziny, a następnie przez kolejne 24 godziny preparatów pektynolitycznych Viscozyme L lub Energex L. W zhydrolizowanych próbkach oznaczano ilość kwasu galakturonowego (GalA) oraz cukrów obojętnych (NS) metodą HPLC. Zgodnie z przypuszczeniami stwierdzono, że warunki hydrolizy znacząco wpływały zarówno na ilość oznaczanego w pektynach
GalA, jak i NS. Najniższą skuteczność w procesie depolimeryzacji PGalA obserwowano w
obecności 2 M TFA działającego w 100oC i, choć w warunkach takich ilość uwalnianego GalA
zwiększała się wraz z wydłużaniem czasu hydrolizy, to nawet po 4 godzinach nie osiągnięto
hydrolizy kompletnej. Dopiero podniesienie temperatury do 120oC zintensyfikowało depolimeryzację PGalA tak, że po 2,5 godzinach była ona kompletna, a dalsze wydłużanie czasu powodowało już degradację wcześniej uwolnionego GalA. Porównując efekty hydrolizy kwasowej i
kombinowanej stwierdzono, że użycie enzymów umożliwia pełniejszą depolimeryzację PGalA
niż trwająca nawet 4 godziny hydroliza w 100oC, ale jest jednocześnie mniej skuteczne niż 2-3
godzinna hydroliza kwasowa w 120oC. Dużo bardziej wrażliwe na warunki hydrolizy niż PGalA były cukry obojętne. Największą ich ilość zarówno w pektynach, jak i w wytłokach jabłkowych oznaczono już po 2,5 godzinach działania kwasu w 100oC. Proponowane przez wielu
badaczy zwiększenie temperatury hydrolizy pektyn do 120oC [24,36,38] drastycznie obniżało
oznaczalność każdego z badanych cukrów. W warunkach, które wcześniej uznano za optymalne dla kompletnej depolimeryzacji PGalA (2 M TFA, 120oC, 2,5 godziny) suma oznaczonych
cukrów obojętnych we wszystkich badanych próbkach była niemal dwukrotnie mniejsza niż ta,
którą oznaczono po 2,5 godzinach hydrolizy w 100oC. Była też istotnie mniejsza od sumy cukrów oznaczonej po hydrolizach kombinowanych. Dodatkowo, wrażliwość poszczególnych
wiązań glikozydowych i tworzących je monosacharydów na stężony kwas i wysoką temperatu12
rę była zróżnicowana, co prowadziło do różnych strat każdego z cukrów i do błędnego oznaczenia ich zawartości w pektynach. Cukrem bardzo szybko reagującym na działanie wysokiej
temperatury i stężonego kwasu była wchodząca w struktury RG-I i RG-II ramnoza. Jej niedoszacowanie w warunkach hydrolizy zoptymalizowanej na uwalniane GalA przekraczało 65%.
Jeszcze bardziej wrażliwa na warunki, w których prowadzono depolimeryzację pektyn, okazała
się mannoza. Jej straty po hydrolizie prowadzonej w 120oC wyniosły od 91 do 100%. Ilość
oznaczanej arabinozy zmieniała się w zależności od czasu i temperatury prowadzenia hydrolizy
nawet dwukrotnie, a fukozy, galaktozy, glukozy i ksylozy około 1,8 razy. Porównując skuteczność uwalniania NS osiągniętą w obecności kwasów ze skutecznością hydrolizy kombinowanej
zauważono, że użycie preparatów enzymatycznych pozwala oznaczyć cukry z błędem mniejszym niż drastyczna hydroliza kwasowa (120oC), ale większym niż trwająca 2,5 godziny hydroliza 2 M TFA w 100oC. Sumując oznaczone ilości NS i GalA zauważono, że zarówno hydroliza
kwasowa w 100oC (zoptymalizowana na uwalnianie NS), jak i w 120oC (zoptymalizowana na
uwalnianie GalA) zawsze prowadziły do znacznego niedoszacowania składu pektyn. Najmniejszy, ale i tak znaczny stopień niedoszacowania składników pektyn obserwowano po zastosowaniu hydrolizy kombinowanej kwasowo-enzymatycznej z udziałem preparatu Energex L. Jednak
tu dodatkowy problem stanowił czas trwania hydrolizy (łącznie aż 96 godzin) i dobór enzymu,
np. użycie do hydrolizy sugerowanego wcześniej przez Garna i in. [23] preparatu Viscozyme
wobec pektyn izolowanych enzymatycznie nie przyniosło oczekiwanych efektów. Podsumowując otrzymane wyniki stwierdzono, że dla precyzyjnego oznaczenia technikami wysokosprawnej chromatografii cieczowej zawartości NS i GalA w pektynach ekstrahowanych enzymatycznie konieczne jest uprzednie przeprowadzenie dwóch równoległych hydroliz kwasowych badanych próbek. Jednej łagodniejszej (100oC, 2,5 godz., 2 M TFA) w celu oznaczenia profilu cukrów obojętnych i drugiej przebiegającej w wyższej temperaturze (120oC, 2,5 godz., 2 M TFA)
w celu oznaczenia GalA. Tylko wtedy błędy związane ze zróżnicowaną wrażliwością na warunki hydrolizy NS i PGalA będą minimalne. W dalszych badaniach stosowano już tylko taki
sposób hydrolizy otrzymywanych pektyn, a suma oznaczonych w nich NS i GalA niezależnie
od sposobu ekstrakcji zawsze stanowiła co najmniej 91% s.m. (prace 5 i 6).
Wyniki przedstawione w pracy 3 wskazywały jednoznacznie, że testowane preparaty
enzymatyczne Celluclast, Viscoferm i Econase różniły się wyraźnie zdolnością do uwalniania
pektyny ze struktur ścian komórkowych. Tylko pierwsze dwa, użyte w optymalnych dla siebie
warunkach, gwarantowały dużo wydajniejszą ekstrakcję polimeru z wytłoków jabłkowych niż
13
stosowany w tym celu kwas siarkowy. Jako oczywistą przyczynę obserwowanych różnic w
przydatności poszczególnych preparatów do ekstrakcji pektyny wskazaliśmy odmienny profil
ich aktywności. W warunkach sprzyjających wydajnemu uwalnianiu pektyny z wytłoków jabłkowych (pH 4,5; temp 50oC) Celluclast odznaczał się bardzo wysoką i zrównoważoną aktywnością ksylanazy i celulazy. Prezentował też dużą zdolność do hydrolizy mannanów, nie był
natomiast aktywny wobec arabinianów i ramnogalakturonianów. Viscoferm miał podobną aktywność ksylanolityczną, ale aktywność celulazy była w nim około 2,5x mniejsza niż w preparacie Celluclast. Jako jedyny wykazywał natomiast zdolność do hydrolizy arabinianów. Trzeci
ze stosowanych produktów wieloenzymowych, Econase w pH 4,5 i temp 50oC cechowała
przede wszystkim wysoka aktywność celulazy (podobna jak w Celluclast) i β-1,3-glukanazy.
Jego zdolność do degradacji ksylanów była natomiast około 2,5x mniejsza niż w pozostałych
preparatach. Wszystkie testowane preparaty w warunkach sprzyjających ekstrakcji pektyny
ujawniały jedynie śladową aktywność pektynolityczną, w tym pektynoesterazową, przy czym
była ona najwyższa w preparacie Econase (praca 3). Niestety nawet ta szczegółowa znajomość
profilu enzymatycznego testowanych preparatów nie pozwalała nam jednoznacznie stwierdzić,
która z aktywności była najważniejsza w procesie uwalniania pektyny. Wiedzy takiej nie dostarczała również literatura tematu. Na podstawie prac Fissore i in. [36] można było przypuszczać, że pierwszoplanową rolę w uwalnianiu pektyn ze struktur ścian komórkowych odgrywa
ksylanaza, podczas gdy prace Naghshineh i in. [40] wskazywały na wiodącą rolę celulazy. Nasze wyniki nie wykluczały żadnej z tych możliwości. W celu rozstrzygnięcia tego problemu
przeprowadziliśmy więc dalsze badania, tym razem z użyciem oczyszczonych, monoaktywnościowych preparatów enzymatycznych (praca 6). Pektyny izolowaliśmy z suszonych wytłoków
jabłkowych w obecności kolejno: endo-celulazy (EC 3.2.1.4, endo-β-1,4-glukanazy), endoksylanazy (EC 3.2.1.8, endo-β-1,4-ksylanazy) oraz obu aktywności jednocześnie. Każdy z enzymów stosowano w dawce 50 U na 1 g wytłoków, a ekstrakcję prowadzono przez 10 godzin
przy stałym wytrząsaniu w optymalnych dla działania tych enzymów warunkach, tj. w 40oC
przy pH 5 i stosunku sucha masa surowca (g) : ekstrahent (ml) wynoszącym 1:15. Analiza
otrzymanych wyników wskazała jednoznacznie, że najważniejsza dla uwalniania pektyny ze
struktur ścian komórkowych była dezintegracja ksylanów. Nawet jeśli przebiegała ona tylko i
wyłącznie w obecności endo-ksylanazy pozwalała uzyskać ze 100 g wytłoków aż 19,8 g pektyny, w tym 12,1 g kwasu galakturonowego. Wynik taki, w oparciu o własne obserwacje i dane
literaturowe [8,41], należy uznać za ekstrakcję kompletną. Mniejsze znaczenie dla procesu
14
uwalniania pektyny z tkanek roślinnych miała hydroliza celulozy. Jej rozkład przez endocelulazę prowadził do uwolnienia ze 100 g wytłoków 15,2 g pektyny zawierającej 10,7 g czyli
aż 70,5% GalA. Ponadto zauważyliśmy, że podczas odhydrolizowywania pektyny ze struktur
ścian komórkowych pomiędzy endo-ksylanazą i endo-celulazą dochodziło do kooperacji, która
wpływała ujemnie na wydajność procesu ekstrakcji, ale jednocześnie pozwalała otrzymać polimer o prawie 75% zawartości kwasu galakturonowego. Dalsza szczegółowa analiza masy i
składu tak otrzymywanych pektyn oraz pektyn izolowanych wcześniej przy użyciu preparatu
wieloaktywnościowego Celluclast i kwasu siarkowego pokazała, że wszystkie badane produkty,
mimo iż pochodziły z tego samego surowca, różniły się od siebie zasadniczo. Największą masą
cząsteczkową odznaczała się pektyna izolowana oczyszczoną endo-ksylanazą (890 kDa),
mniejszą masę miała pektyna otrzymana w wyniku akcji katalitycznej endo-celulazy (590 kDa).
Było to bez wątpienia wynikiem różnic w specyficzności substratowej obu użytych enzymów.
Endo-celulaza, czyli 4-glukanohydrolaza-1,4-(1,3; 1,4)-β-D-glukanu to enzym, który według
aktualnej wiedzy umożliwia hydrolizę do oligomerów nie tylko samej celulozy, ale także, choć
w mniejszym stopniu, ksyloglukanów (42). W naszych doświadczeniach musiał więc hydrolizować oba te polisacharydy na tyle skutecznie by uwalniać pektynę lepiej oczyszczoną, bez
tzw. cukrów balastowych. Endo-1,4-β-ksylanaza natomiast jest enzymem o większej specyficzności substratowej, aktywnym niemal wyłącznie wobec wiązań pomiędzy resztami ksylozy w
ksylanie (43). Podczas prowadzonej z jej udziałem ekstrakcji nie mogło więc dochodzić do
niszczenia struktur typowych dla pektyny, jak RG-I i RG-II (świadczy o tym choćby największa zawartość w takiej pektynie ramnozy, arabinozy, fukozy i galaktozy). Wręcz przeciwnie,
pektyna musiała być uwalniana przez ksylanazę razem z fragmentami celulozy i mannanów
(duża zawartość glukozy i mannozy), białkiem (4,4%), a nawet fenolami. Udział tych ostatnich
oszacowano na 1,3%, podczas gdy w pektynie izolowanej kwasem fenole stanowiły zaledwie
0,71%. Kooperacja endo-celulazy i endo-ksylanazy, podobnie jak działanie opartego na tych
aktywnościach preparatu Celluclast, prowadziła do ekstrakcji pektyny o masie cząsteczkowej w
granicach 420-470 kDa, a więc nadal istotnie większej niż masa pektyny otrzymywanej z tego
samego surowca kwasem. Pektyna taka była też istotnie bogatsza od otrzymywanej konwencjonalnie zarówno w kwas galakturonowy, jak i arabinozę i ramnozę. Zawierała za to zdecydowanie mniej glukozy, a więc cukru nietypowego dla pektyn. Jak się okazało, sposób ekstrakcji
wpływał także znacząco na stopień metylacji otrzymywanych produktów. Do tej pory wiadomo
było, że DM pektyn tego samego pochodzenia zależy przede wszystkim od temperatury, pH i
15
czasu prowadzenia ekstrakcji. Im niższe pH, wyższa temperatura i dłuższy czas procesu tym
większa wydajność izolacji pektyny, ale jednocześnie niższy stopień jej estryfikacji [20,37].
Nasze badania pokazały, że czynnikiem różnicującym DM pektyn może być także rodzaj użytego do izolacji enzymu, nawet jeśli nie wykazuje on aktywności pektynoesterazy (praca 6).
Pektynę o najwyższym stopniu metylacji (DM=73,4%), właściwie nieosiągalnym w przypadku
konwencjonalnej ekstrakcji z wytłoków jabłkowych [20], otrzymano przy użyciu endoksylanazy. Działająca w tych samych warunkach endo-celulaza uwalniała polimer o DM równym 66,3%, a kooperacja obu tych enzymów pozwalała uzyskać pektynę o DM=67,5%. Dla
porównania, stopień metylacji pektyny jabłkowej izolowanej kwasem siarkowym przy zachowaniu stosunkowo łagodnych warunków procesu (pH 2, 85oC, 3 godz.) wynosił 56,1% i był
niższy również od tego, jaki uzyskiwano w obecności różnych dawek preparatu Celluclast (praca 5). Podsumowując, przeprowadzone przez nas ekstrakcje enzymatyczne w porównaniu do
ekstrakcji kwasowej zawsze sprzyjały otrzymywaniu pektyny o wyższym stopniu metylacji i
większej masie cząsteczkowej. Pektyny takie zawierały też istotnie więcej GalA (nawet o 15%),
galaktozy, ramnozy i fukozy oraz białka i fenoli.
Opisane różnice w składzie pektyn izolowanych enzymatycznie i kwasowo nie mogły
pozostać bez wpływu na ich właściwości biologiczne, chemiczne i fizyczne. W swoich pracach
skupiliśmy się tylko na tych pierwszych. Większa zawartość białka i fenoli pozwalała przypuszczać, że pektyny ekstrahowane enzymami mogą np. mieć lepsze właściwości antyoksydacyjne niż ich odpowiedniki otrzymane metodą kwasową. Z kolei większy udział w strukturze
polimeru frakcji rozgałęzionych, zwłaszcza galaktanów i arabinogalaktanów, zgodnie z aktualną wiedzą [44,45] dawał takiej pektynie realną możliwość oddziaływania z galektyną 3 (Gal-3),
tj. lektyną mającą istotne znaczenie m.in. dla przerzutowania komórek rakowych [44,46]. W
celu weryfikacji tych przypuszczeń przeprowadziliśmy badania, z których część została opisana
w pracach 5 i 7, a pozostałe tu nie prezentowane ukażą się wkrótce. Okazało się, że w testach in
vitro pektyny izolowane z wytłoków jabłkowych endo-celulazą, jak i endo-ksylanazą wykazywały rzeczywiście wielokrotnie większy potencjał antyoksydacyjny mierzony jako zdolność
redukcji jonów Fe(III) niż produkt otrzymany z tego samego surowca konwencjonalnie. Z kolei
pektyny ekstrahowane z udziałem preparatu Celluclast prezentowały zaskakująco wysoką aktywność neutralizacji syntetycznych wolnych rodników DPPH i ABTS+, zależną od dawki preparatu użytej do ekstrakcji (0,25; 0,5 i 0,75 µl/g) (praca 5). Pomiędzy wynikami otrzymanymi
w obu testach, podobnie jak w pracach innych badaczy, istniała bardzo wysoka dodatnia kore16
lacja (nawet R=0,988 przy p=0,01). Zawsze kilkakrotnie wyższą skuteczność neutralizacji wolnych rodników pektyny prezentowały w środowisku hydrofilowym, a więc wobec ABTS•+,
mniejszą aktywność miały natomiast w środowisku hydrofobowym, typowym dla DPPH•. Najniższa wartość współczynnika IC50 dla pektyny izolowanej Celluclastem wynosiła zaledwie
0,53 mg/ml wobec ABTS•+ i 1,85 mg/ml wobec DPPH•. Oznacza to, że pektyna izolowana enzymatycznie miała dużo wyższy potencjał antyrodnikowy niż inne, opisywane dotąd w literaturze pektyny jabłkowe [13,47]. Dla porównania pektyna ekstrahowana z wytłoków jabłkowych
kwasem w naszych badaniach redukowała o 50% ilości ABTS•+ i DPPH• przy stężeniu odpowiednio 2,6 i 5,5 razy większym. Jeszcze mniejszy potencjał antyrodnikowy wykazywała pektyna handlowa.
Pektyny otrzymane w wyniku działania różnych dawek preparatu Celluclast okazały się
być zaskakująco aktywne nie tylko w procesie usuwania wolnych rodników, ale także jako inhibitory proliferacji i migracji linii komórek gruczolakoraka jelita grubego człowieka Caco-2
(praca 5). Aktywność taką wykazywały nawet wówczas, gdy ich stężenie w pożywce hodowlanej wynosiło zaledwie 0,25 mg/ml. Zdolność niektórych pektyn, szczególnie modyfikowanych,
niskocząsteczkowych do hamowania proliferacji i migracji oraz indukowania apoptozy komórek nowotworowych była wcześniej opisywana [23,44,48,49]. Jak dotąd nie pokazywano jednak, że działanie takie mogą wykazywać także pektyny wielkocząsteczkowe. Również w naszych badaniach pektyny jabłkowe otrzymywane w sposób konwencjonalny i posiadające masy
rzędu 215-249 kDa nie wpływały w istotny sposób na badane funkcje życiowe komórek Caco2. Zupełnie inaczej zachowywały się jednak pektyny ekstrahowane z tego samego surowca, ale
przy użyciu preparatu wieloaktywnościowego Celluclast 1.5L. Mimo istotnie większej masy
cząsteczkowej (325-473 kDa) hamowały one in vitro zarówno proliferację, jak i zdolność penetrowania macierzy zewnątrzkomórkowej (inwazyjność) komórek gruczolakoraka, a siła tego
działania była dodatnio skorelowana z ich dawką. Największe właściwości antynowotworowe
wykazywały pektyny otrzymane przy średniej i dużej dawce preparatu Celluclast stosowane w
największym badanym stężeniu wynoszącym 1 mg/ml pożywki hodowlanej. Inhibitowały one
proliferację komórek Caco-2 względem hodowli kontrolnej (bez dodatku pektyny) maksymalnie o 30%, a inwazyjność komórek w ich obecności zmniejszała się nawet o 41%. Według wielu badaczy za antynowotworowe działanie pektyn odpowiada głównie frakcja homogalakturonianu i ramnogalakturonianu I [45,50]. Gunning i in. [51] wskazują dodatkowo na duże znaczenie dla tej aktywności odsłoniętych łatwo dostępnych dla Gal-3 łańcuchów β-1,4-galaktanu. Za
17
słusznością obu tych teorii przemawiają również nasze wyniki. Wykazujące silne antynowotworowe działanie pektyny izolowane Celluclastem były bogatsze w HG niż pektyna otrzymana
konwencjonalnie, odznaczały się też większą zawartością galaktozy i ramnozy, świadczącej o
znacznym udziale w polimerze frakcji RG-I. Również Wang i Lü [13] sugerują, że antyproliferacyjne działanie wobec komórek linii HT-29 otrzymanej przez nich niskocząsteczkowej pektyny jabłkowej było istotnie większe niż działanie handlowej pektyny jabłkowej właśnie ze
względu na wyższą w tej pierwszej zawartość arabinozy i galaktozy. Bardzo wysoką zawartością obu tych cukrów odznaczały się także pektyny otrzymane przez nas preparatami endoksylanazy i endo-celulazy. One także pomimo jeszcze większych mas cząsteczkowych hamowały proliferację komórek nowotworowych. Potwierdziliśmy to nie tylko wobec linii komórek
Caco-2, ale także w badaniach na komórkach linii gruczolakoraka HT-29 i mysiego czerniaka
B16F10 (praca 7). Najbardziej wrażliwe na obecność takich pektyn w pożywce były komórki
HT-29. Przy stężeniu pektyny wynoszącym 1 mg/ml ich zdolność do proliferacji zmniejszyła
się maksymalnie o około 40%, podczas gdy komórki Caco-2 i B16F10 w tych samych warunkach reagowały maksymalnie około 18% spadkiem tempa proliferacji. W kolejnych, dopiero
przygotowywanych do druku pracach pokazujemy, że pektyny izolowane z wytłoków jabłkowych enzymami mogą także hamować z dużą siłą adhezję, migrację oraz formowanie i rozwój
guza różnych linii nowotworów hormonozależnych.
Podsumowanie
Zaprezentowane przez nas badania dowodzą, że pektyny można izolować z wytłoków
jabłkowych z bardzo dużą wydajnością nawet przy użyciu już dostępnych na rynku, tanich wieloaktywnościowych preparatów enzymatycznych takich jak Celluclast® 1.5L czy Viscoferm®.
Preparaty takie nie powinny wykazywać aktywności pektynolitycznej, muszą natomiast odznaczać się wysoką aktywnością ksylanolityczną. Jak pokazujemy, dezintegracja ksylanów jest
kluczowa dla uwalniania pektyn ze struktur ścian komórkowych i nawet jeśli będzie ona skutkiem tylko i wyłącznie działania endo-ksylanazy może doprowadzić do kompletnej (tj. około
20% z wytłoków jabłkowych) ekstrakcji pektyny. Hydroliza celulozy również umożliwia izolację pektyny z wytłoków jabłkowych, ale jest to proces mniej wydajny, choć zapewniający
otrzymanie polisacharydu o większym udziale kwasu galakturonowego, w mniejszym stopniu
obciążonego glukozą. Dowodzimy, że pektyny uwalniane z wytłoków jabłkowych na skutek
akcji katalitycznej preparatów bazujących na ksylanazie bądź celulazie są podobne do pektyn in
muro. Oznacza to, że w przeciwieństwie do pektyn otrzymywanych konwencjonalnie zawierają
18
oprócz HG znaczne ilości rozgałęzionych frakcji RG-I i RG-II, niszczonych podczas standardowej ekstrakcji przez kwas i wysoką temperaturę. Są także w wyższym stopniu zmetylowane
oraz bogatsze w białko i fenole. Pokazujemy, że takie różnice strukturalne sprawiają, że pektyny izolowane enzymatycznie w odróżnieniu od produktu ekstrahowanego kwasem wykazują
wielokrotnie większy potencjał antyoksydacyjny i antyrodnikowy. Mają również niedostępną
dla pektyn handlowych zdolność hamowania proliferacji i zmniejszania inwazyjności komórek
nowotworowych, widoczną nawet w bardzo niskich dawkach.
Proponowane przez nas zastąpienie podczas ekstrakcji pektyn kwasu mineralnego preparatami enzymatycznymi wiąże się nie tylko z możliwością otrzymania produktu o ciekawej
aktywności biologicznej, ale jak udowadniamy, niesie za sobą również typowe dla tzw. zielonej
chemii zalety. Przede wszystkim (i) zwiększa wydajność procesu, mimo że (ii) przebiega w
bardzo łagodnych warunkach (pH 4,5-5; temp. 40-50oC) niewymagających dużego nakładu
energii i niepowodujących korozji sprzętu. (iii) Nie wymaga wysokiego uwodnienia ani rozdrabniania surowca, w efekcie pozwala (iiii) zmniejszyć ilość generowanych ścieków. Dodatkowo, (iiiii) odpady powstałe w wyniku enzymatycznej ekstrakcji pektyny nie są zakwaszone,
można je więc z łatwością dalej wykorzystać, np. jako wartościową karmę dla zwierząt.
Zupełnie odrębne zagadnienie omówione w naszych pracach stanowiło zaproponowanie
metody hydrolizy pektyn izolowanych enzymatycznie, która umożliwi precyzyjne oznaczanie
ich składu technikami HPLC. Było to konieczne ze względu na szczególnie złożoną strukturę
takich polimerów. Wykazaliśmy, że warunki hydrolizy optymalne dla oznaczenia w pektynie
zawartości GalA różnią się zasadniczo od tych, które zapewniają dokładne oznaczenie NS. Nie
można więc stosować jednej uniwersalnej hydrolizy dla prawidłowego oznaczenia obu tych
składników pektyn. Kwas poligalakturonowy ulega pełnej hydrolizie po 2,5 godzinnej inkubacji
z 2 M TFA w temp. 120oC. Warunki te powodują jednak daleko posuniętą degradację obecnych
w pektynach NS. Hydroliza optymalna dla oznaczenia takich cukrów powinna przebiegać w
obecności 2 M TFA w temp. 100oC przez 2,5 godziny.
Przedmiotem moich najbliższych badań będą właściwości chemiczne i fizyczne izolowanych enzymami pektyn jabłkowych. Podniesiona zawartość białka i fenoli w tych polimerach pozwala przypuszczać, że mogą one prezentować większe niż pektyna otrzymywana konwencjonalnie zdolności emulgujące. Z kolei wielkie masy cząsteczkowe w połączeniu z dużą
zawartością kwasu galakturonowego mogą nadawać takim pektynom znaczne właściwości żelujące. Przeprowadzone badania pilotażowe, na razie tylko przy użyciu wiskozymetru kapilar19
nego pokazały, że 1% wodne roztwory pektyn ekstrahowanych enzymatycznie mają nawet
dwukrotnie większą lepkość niż roztwór pektyny izolowanej kwasem.
Zamierzam też kontynuować badania nad właściwościami prozdrowotnymi otrzymanych polimerów. Właśnie kończę prace, których celem była identyfikacja składników pektyn
odpowiedzialnych za ich działanie antyoksydacyjne. Planuję natomiast doświadczenia, które
pozwolą oszacować ewentualny potencjał prebiotyczny otrzymywanych enzymami pektyn.
Mają one objąć symulację in vitro całego przewodu pokarmowego człowieka, tak by można
było ocenić skutki fermentacji takich pektyn przez mikroflorę okrężnicy.
W związku z zaletami jakie może nieść ze sobą enzymatyczna ekstrakcja pektyn podjęłam działania zmierzające do przeniesienia tej metody w warunki przemysłowe. Pierwsze badania, na razie w skali pół-makro, są prowadzone w firmie PPH Emix, zainteresowanej przemysłową produkcją pektyn izolowanych enzymatycznie.
Bibliografia
[1] Jayani R.S., Saxena S., & Gupta R. 2005. Microbial pectinolytic enzymes: a review. Process Biochemistry, 40: 2931-2944.
[2] Caffall K.H., & Mohnen D. 2009. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research, 344: 1879-1900.
[3] Voragen A.G., Coenen G., Verhoef R.P., & Schols H.A. 2009. Pectin, a versatile polysaccharide present in plant cell walls.
Structural Chemistry, 20: 263-275.
[4] Willats W.G., Knox P.J., Mikkelsen J.D. 2006. Pectin: new insights into an old polimer are starting to gel. Trends in Food
Science & Technology, 17: 97-104.
[5] Kalapathy U., Proctor A. 2001. Effect of acid extraction and alcohol precipitation conditions on the yield and purity of soy
hull pectin. Food Chemistry, 73: 393-396.
[6] Perez C.D., De Nobilla M., Rizzo S., Gerschenson L., Descalzo A., Rojas A.M. 2013. High methoxyl pectinmethylcellulose films with antioxidant activity at a functional food interface. Journal of Food Engineering, 116: 162-169.
[7] Gullón B., Falqué E., Alonso J.L., Parajó J.C. 2007. Evaluation of apple pomace as a raw material for alternative applications in food industries. Food Technology and Biotechnology, 45 (4): 426–433.
[8] Baississe S., Ghannem H., Fahloul D., Lekbir A. 2010. Comparison of structure and emulsifying activity of pectin extracted
from apple pomace and apricot pulp. World Journal of Dairy & Food Sciences, 5: 79-84.
[9] Srivastava P., Malviya R. 2011. Sources of pectin, extraction and its applications in pharmaceutical industry – An overview.
Indian Journal of Natural Product and Resources, 2: 10-18.
[10] Kanmani P., Dhivya E., Aravind J., Kumaresan K. 2014. Extraction and analysis of pectin from citrus peels: augmenting
the yield from citrus limon using statistical experimental design. Iranica Journal of Energy & Environment, 5 (3): 303-312.
[11] Iglesias M.T., Lozano J.E. 2004. Extraction and characterization of sunflower pectin. Journal of Food Engineering, 62:
215-223.
[12] Aina V.O., Barau M.M., Mamman O.A., Zakari A., Haruna H., Umar M.S., Abba Y.B. 2012. Extraction and characterization of pectin from peels of lemon (Citrus limon), grape fruit (Citrus paradisi) and sweet orange (Citrus sinensis). Brazilian
Journal of Physical Therapy, 3: 259-262.
[13] Wang X., Lü X. 2014. Characterization of pectic polysaccharides extracted from apple pomace by hot-compressed water.
Carbohydrate Polymers, 102: 174-184.
[14] Wang S., Chen F., Wu J., Wang Z., Liao X., Hu X. 2007. Optimization of pectin extraction assisted by microwave from
apple pomace using response surface methodology. Journal of Food Engineering, 78: 693-700.
[15] Xu Y., Zhang L., Bailina Y., Ge Z., Ding T., Ye X., Liu D. 2014. Effects of ultrasound and/or heating on the extraction of
pectin from grapefruit peel. Journal of Food Engineering, 126: 72-81.
[16] Yeoh S., Shi J., Langrish T.A. 2008. Comparison between different techniques for water-based extraction of pectin from
orange peels. Desalination, 218: 229-237.
20
[17] Patil S.R., Dayanand A. 2006. Optimization of process for the production of fungal pectinases from deseeded sunflower
head in submerged and solid-state conditions. Bioresource Technology, 97: 2340-2344.
[18] Anthony T., Chandra Raj K., Rajendran A., Gunasekaran P. 2003. High molecular weight cellulase-free xylanase from
alkali-tolerant Aspergillus fumigatus AR1. Enzyme and Microbial Technology, 32: 647-654.
[19] Salvador L.D., Suganuma T., Kitahara K., Fukushige Y., Tanuoem H. 2002. Degradation of cell wall materials from sweet
potato, cassava and potato by a bacterial protopectinase and terminal sugar analysis of the resulting solubilized products.
Journal of Bioscience and Bioengineering, 93: 64-72.
[20] Garna H., Mabon N., Robert C., Cornet C., Nott K., Legros H., Wathelet B., Paquot M. 2007. Effect of extraction conditions on the yield and purity of apple pomace pectin precipitated but not washed by alcohol. Journal of Food Science, 72: 19.
[21] Ohishi K., Kasai M., Shimada A., Hatae K. 2007. Effects of acetic acid on the rice gelatinization and pasting properties of
rice starch during cooking. Food Research International, 40: 224-231.
[22] Hach C.C., Brayton S.V., Kopelove A.B. 1985. A powerful Kjeldahl nitrogen method using peroxymonosulfuric acid.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 33: 1117-1123.
[23] Garna H., Mabon N., Wathelet B., Paquot M. 2004. New method for a two-step hydrolysis and chromatographic analysis
of pectin neutral sugar chains. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 4652–4659.
[24] Arnous A., Meyer A.S. 2008. Comparison of methods for compositional characterization of grape (Vitis vinifera L.) and
apple (Malus domestica) skins. Food and Bioproducts processing, 86: 79-86.
[25] Levigne S., Thomas M., Ralet M.C., Quemener B., Thibault J.F. 2002. Determination of the degrees of methylation and
acetylation of pectins using C18 column and internal standards. Food Hydrocolloids, 16: 547-550.
[26] Braca A., De Tommasi N., Di Bari L., Pizza C., Politi M., Morelli I. 2001. Antioxidant principles from Bauhinia tarapotensis. Journal of Natural Products, 64: 892-895.
[27] Rha H.J., Bae I.Y., Lee S., Yoo S.H., Chang P.S., Lee H.G. 2011. Enhancement of anti-radical activity of pectin from
apple pomace by hydroxamation. Food Hydrocolloids, 25(3): 545–548.
[28] Zykwinska A., Gaillard C., Boiffard M.H., Thibault J.F., Bonnin E. 2009. “Green labeled” pectins with gelling and emulsifying properties can by extracted by enzymatic way from unexploited sources. Food Hydrocolloids, 23: 2468-2477.
[29] Ptichkina N.M., Markina O.A. Rumyantseva G.N. 2008. Pectin extraction from pumpkin with the aid of microbial enzymes. Food Hydrocolloids, 22: 192-195.
[30] Yuliarti O., Matia-Merino L., Goh K. T., Mawson J., Brennan C. 2012. Characterization of gold kiwifruit pectin isolated
by enzymatic treatment. International Journal of Food and Science & Technology, 47: 633-639.
[31] Emaga T.H., Ronkart S.N., Robert C., Wathelt B., Paquot M. 2008. Characterisation of pectins extracted from banana
peels (Musa AAA) under different conditions using an experimental design. Food Chemistry, 108: 463-471.
[32] Panouillé M., Thibault J.F., Bonnin E. 2006. Cellulase and protease preparations can extract pectins from various plant
byproducts. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54: 8926-8935.
[33] Zykwinska A., Boiffard M.H., Kontkanen H., Thibault J.F., Bonnin E. 2008. Extraction of green labeled pectins and pectic
oligosaccharides from plant byproducts. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56: 8926-8935.
[34] FAO JECFA. 2009. Compendium of food additive specifications. Monographs 7, 71st meeting, Rome, 2009.
[35] Lim J., Yoo J., Ko S., Lee S. 2012. Extraction and characterization of pectin from Yuza (Citrus junos) pomace: A comparison of conventional-chemical and combined physical-enzymatic extractions. Food Hydrocolloids, 29: 160-165.
[36] Fissore E.N., Ponce N.M., Wider E.A., Stortz C.A. Gerschenson L.N., Rojas A.M. 2009. Commercial cell wall hydrolytic
enzymes for producing pectin-enriched products from butternut (Cucurbita moschata, Duchesne ex Poiret). Journal of Food
Engineering, 93: 293-301.
[37] Yapo B.M. 2009. Pectin quantity, composition and physicochemical behaviour as influenced by the purification process.
Food Research International, 42: 1197-1202.
[38] Methacanon P., Krongsin J., Gamonpilas Ch. 2014. Pomelo (Citrus maxima) pectin: Effects of extraction parameters and
its properties, Food Hydrocolloids, 35: 383-391.
[39] Rumpunen K., Thomas M., Badilas N., Thibault J.F. 2002. Validation of combined enzymatic and HPLC method for
screening of pectins in fruits of Japanese quince (Chaenomeles japonica). LWT – Food Science and Technology, 35: 490496.
[40] Naghshineh M., Olsen K., Georgiou C.A. 2013. Sustainable production of pectin from lime peel by high hydrostatic pressure treatment. Food Chemistry, 136: 472-478.
[41] Kliemann E., de Simas K.N., Amante E.R., Prudeňcio E.S., Teófilo R.F., Ferreira M.M., Amboni R.D.M. 2008. Optimisation of pectin acid extraction from passion fruit peel (Passiflora edulis flavicarpa) using response surface methodology. International Journal of Food Science and Technology, 44: 476-483.
[42] Samanta S., Basu A., Halder U.C., Sen S.K. 2012. Characterization of Trichoderma reesei endoglucanase II expressed
heterologously in Pichia pastoris for better biofinishing and biostoning. Journal of Microbiology, 50: 518-525.
21
[43] Collins T., Gerday C., Feller G. 2005. Xylanases, xylanase families and extermophilic xylanases. FEMS Microbiology
Reviews, 29: 3-23.
[44] Glinsky V.V., Raz A. 2009. Modified citrus pectin anti-metastatic properties: one bullet, multiple targets. Carbohydrate
Research, 344: 1788- 1791.
[45] Vayssade M., Sengkhamparn N., Verhoef R., Delaigue C., Goundiam O., Vigneron P., Voragen A.G.J., Schols H.A.,
Nagel M.D. 2010. Antiproliferative and proapoptotic actions of okra pectin on B16F10 melanoma cells. Phytother Research, 24: 982-989.
[46] Nakahara S., Oka N., Raz A. 2008. On the role of galectin-3 in cancer apoptosis. Apoptosis, 10: 267-275.
[47] Dou J., Meng Y., Liu L., Li J., Ren D., Gou Y. 2015. Purification, characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thinned-yang apple. International Journal of Biological Macromolecules, 72: 31-40.
[48] Bergman M., Djaldetti M., Salman H., Bessler H. 2010. Effect of citrus pectin on malignant cell proliferation. Biomedicine
and Pharmacotherapy, 64: 44- 47.
[49] Fan Y., Cheng H., Li S., Wang J., Liu D., Hao M., Gao X., Fan E., Tai G., Zhou Y. 2010. Relationship of the inhibition of
cell migration with the structure of ginseng pectic polysaccharides. Carbohydrate Polymers, 81: 340-247.
[50] Cheng H., Li S., Fan Y., Gao X., Hao M., Wang J., Zhang X., Tai G., Zhou Y. 2011. Comparative studies of the ginseng
polysaccharides on HT-29 human colon cancer cells. Medical Oncology, 28: 175-181.
[51] Gunning A.P, Pin C., Morris V.J. 2013. Galectin 3 - β-galactobiose interactions. Carbohydrate Polymers, 92: 529-533.
5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo badawczych
Problematyka pozostałych badań, w których brałam, bądź biorę udział obejmuje następujące
zagadnienia:
1) Enzymatyczna konwersja fitynianów pasz i jej rola w żywieniu zwierząt;
2) Optymalizacja biosyntezy enzymów zewnątrzkomórkowych przez szczep Aspergillus
niger 377-4;
3) Wpływ metyloksantyn na proces trawienia lipidów;
4) Katechiny jako stabilizator i bioaktywny składnik żywności;
5) Wykorzystanie fermentacji typu tempe do podnoszenia wartości żywieniowej surowców
roślinnych;
Ad. 1.
W roku 1997, a więc wkrótce po zatrudnieniu w Katedrze Biotechnologii Żywności AR
w Krakowie zostałam włączona w prowadzone w tej jednostce badania nad enzymatyczną
konwersją fitynianów pasz i możliwością jej wykorzystania w żywieniu zwierząt monogastrycznych. W ramach tej trwającej siedem lat współpracy byłam wykonawcą w czterech projektach badawczych (• „Use of enzymes as a waste management tools in poultry production"
Grant United States Department of Agriculture – RSED Project PL25, • „Jednoczesne stosowanie enzymów fosfolitycznych i obniżających lepkość w paszach dla drobiu zawierających pszenicę" Nr P06E 001 11, • „Efekty żywieniowe różnicowania stopnia konwersji fitynianów przy
zmiennych poziomach defosforylacji pasz” Nr 6 P06E 052 20, • „Produkty enzymatycznej
22
konwersacji fitynianów jako składniki żywności funkcjonalnej" PBZ-KBN/021/P06/31) oraz
współautorem sześciu publikacji i dziewięciu doniesień na konferencje międzynarodowe i krajowe.
Kwas fitynowy i jego sole, fityniany, powszechnie występują w tkankach roślinnych
i produktach pochodzenia roślinnego. Związek ten wiążąc jony metali, ogranicza ich dostępność w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt. Ponadto obniża strawność białek, skrobi i lipidów. Zawarty w fitynianach fosfor stanowi nawet 70% całkowitego fosforu mieszanek
paszowych i w ogromnej większości jest niedostępny dla zwierząt monogastrycznych [1,2,3].
Antyodżywcze działanie fitynianów można ograniczać poprzez ich enzymatyczną defosforylację. Nasze badania pokazały, że preparaty enzymatyczne o aktywności fitazy i fosfatazy kwaśnej kooperują ze sobą w procesie defosforylacji fitynianów. W doświadczeniach in vitro symulujących trawienie pasz dla drobiu w przewodzie pokarmowym ustalono optymalne dla przebiegu defosforylacji fitynianów dawki obu preparatów (750 FTU/kg i 3,156 ACPU/kg paszy)
stwierdzając jednocześnie, że nie tylko działające solo ale nawet kooperujące ze sobą enzymy
fosforolityczne nie mogą doprowadzić do całkowitej defosforylacji fitynianów paszy
[4,5,6,7,8]. Okazało się, że fitazy A wpływają asymptotycznie na stopień defosforylacji paszy i
konwersję kwasu fitynowego. Z kolei fosfataza kwaśna (fitaza B) intensyfikuje defosforylację
paszy tylko przy niskich dawkach fitazy (do 250 FTU/kg) mimo, iż niezależnie od dawki fitazy
A powoduje wzrost stopnia konwersji fitynianów [9,10]. Dalsze badania pokazały, że proces
defosforylacji fitynianów pasz przez enzymy fosforolityczne można jeszcze znacząco zintensyfikować stosując dodatkowo preparaty pektynolityczne [4, 11,12,13,14]. Co prawda, pektynazy
działając indywidualnie zwiększały dostępność fosforu z paszy tylko o 5-9% [14], ale współdziałając z fitazą i fosfatazą doprowadzały już do 84%, a w obecności kwasu cytrynowego nawet 96% defosforylacji mieszanki paszowej [4] podczas gdy koktajl samych enzymów fosforolitycznych uwalniał maksymalnie 68% fosforu zawartego w paszy [4]. Współdziałanie fitaz i
fosfataz z pektynazami prowadziło także do istotnego zwiększenia biodostępności białka [15] i
cukrów, a zwłaszcza pentoz [4,11] zawartych w mieszankach dla drobiu. Podobne wyniki udało
nam się uzyskać zastępując mieszankę enzymów czteroprocentowym dodatkiem wysuszonej i
zmielonej grzybni Aspergillus niger [11]. W kilku doświadczeniach żywieniowych przeprowadzonych na rosnących kurczętach brojlerach potwierdziliśmy pozytywny wpływ dodatku do
pasz fitaz i fosfataz [9,10], koktajlu enzymów fosforolitycznych z pektynazami [4,11] oraz
grzybni A. niger [5,11]. Wykazaliśmy, że 3-fitaza A i 6-fitaza A w dawce 750 FTU/kg mają
23
zbliżony wpływ na przyrost masy brojlerów, mineralizację ich kości oraz retencję P i Ca. Podczas gdy fosfataza kwaśna (fitaza B) wspomaga pobieranie paszy, wzrost masy ciała oraz mineralizację kości i retencję P, ale nie Ca. W warunkach wyższego stopnia konwersji kwasu fitynowego (większe dawki fitazy B) 3-fitaza A miała znacznie większy wpływ na parametry odchowu brojlerów niż 6-fitaza A, ale ograniczała retencję Ca [9,10]. Wzbogacenie diety w koktajl zawierający enzymy fosforolityczne i pektynolityczne, podobnie jak zastąpienie tego koktajlu enzymatycznego grzybnią, skutkowało dla przyjmujących taką dietę zwierząt dalszym
istotnym wzrostem retencji P i Ca, poprawą stopnia mineralizacji kośćca, większymi przyrostami masy ciała oraz spadkiem lepkości treści jelitowej [4,11]. Ptaki otrzymujące dietę suplementowaną w enzymy bądź grzybnię w porównaniu do zwierząt grupy kontrolnej (otrzymujących dietę wzbogaconą w P egzogenny) odznaczały się też istotnie mniejszą masą wydzielniczej części żołądka. Wydaje się, że przyjmowana dieta wpływała również na ich system odpornościowy, choć należy zauważyć, że efekt ten widoczny był tylko u ptaków otrzymujących w
paszy czteroprocentowy dodatek grzybni. Miały one istotnie powiększoną bursę Fabrycjusza - a
więc organ, w którym dochodzi do różnicowania limfocytów B, a skupiska grudek limfatycznych w błonie śluzowej i podśluzowej jelita cienkiego zajmowały niemal czterokrotnie mniejszą powierzchnię niż u ptaków z grupy kontrolnej [11].
[1] Ledoux D.R., Li Y.C., Veum T.L., Raboy V., Żyła K., Wikiera A. 1999. Low phytic acid barley improves performance and
bone mineralization in turkeys. Proceedings of the 12th European Symposium on Poultry Nutrition, Veldhoven, The Netherlands, WPSA – Dutch Branch, p. 51-53.
[2] Ledoux D.R., Li Y.C., Veum T.L., Raboy V., Żyła K., Wikiera A. 1999. Bioavailability of phosphorus in low phytic acid
barley. Proceedings of the 12th European Symposium on Poultry Nutrition, Veldhoven, The Netherlands, WPSA – Dutch
Branch, p. 66.
[3] Li Y.C., Ledoux D.R., Veum T.L., Raboy V., Żyła K., Wikiera A. 2001. Bioavailability of phosphorus in low phytic acid
barley. J. Appl. Poultry Res., 10: 86-91.
[4] Żyła K., Koreleski J., Świątkiewicz S., Wikiera A., Kujawski M., Piironen J., Ledoux D.R. 2000. Effects of phosphorolytic
and cell wall-degrading enzymes on the performance of growing broilers fed wheat-based diets containing different calcium
levels. Poultry Science, 79: 66-76.
[5] Żyła K., Koreleski J., Świątkiewicz S., Wikiera A., Ledoux D.R. 1999. Performance, phosphorus digestibility and selected
immune characteristic of growing broilers fed wheat-based diets supplemented with enzymes and fungal mycelium. Proceedings of the 12th European Symposium on Poultry Nutrition, Veldhoven, The Netherlands, WPSA – Dutch Branch, p.
67.
[6] Żyła K., Wikiera A., Chruściński M. 1999. Optymalizacja enzymatycznej defosforylacji i degradacji polisacharydów w
pszenno-sojowej mieszance dla brojlerów. Materiały I Krajowego Kongresu Biotechnologii, Wrocław, s. 190.
[7] Wikiera A., Żyła K. 1999. Profile elucji fosforanów inozytolu zawartych w paszach o zróżnicowanym poziomie aktywności endogennej fitazy. Materiały XXX Sesji Naukowej Komitetu Technologii i Chemii Żywności PAN, Kraków, s. 352.
[8] Żyła K., Wikiera A. 2002. Próby różnicowania stopnia konwersji fitynianów przy zmiennych poziomach defosforylacji
paszy. Materiały XXXIII Sesji Naukowej Komitetu Technologii i Chemii Żywności PAN, Lublin, płyta CD.
[9] Żyła K., Koreleski J., Mika M., Stodolak B., Świątkiewicz S., Wikiera A. 2003. Complete dephosphorylation and total
conversion of phytates in maize- soybean feeds fed to broilers. 14th European Symposium on Poultry Nutrition. 10-14
sierpnia 2003r., Lillehammer, Norwegia, p. 16-18.
24
[10] Żyła K., Mika M., Stodolak B., Wikiera A., Koreleski J., Świątkiewicz S. 2004. Towards complete dephosphorylation and
total conversion of phytates in poultry feeds. Poultry Science, 83: 1175-1186.
[11] Żyła K., Wikiera A., Koreleski J., Świątkiewicz S., Piironen J., Ledoux D.R. 2000. Comparison of the efficacies of a
novel Aspergillus niger mycelium with separate and combined effectiveness of phytase, acid phosphatase and pectinase in
dephosphorylation of wheat-based feeds fed to growing broilers. Poultry Science, 79: 1434-1443.
[12] Żyła K., Wikiera A. 2001. In vitro evaluation of commercial pectinases for possible enhancement of feed dephosphorylation by phytate-degrading enzymes. 13th European Symposium on Poultry Nutrition Proceedings, Blankenberge, Belgium,
pp. 219-220.
[13] Wikiera A., Kajzar I., Żyła K. 2001. Wpływ preparatów pektynolitycznych na intensyfikację procesów defosforylacji
fitynianów. Materiały XXXII Sesji Naukowej Komitetu Technologii i Chemii Żywności PAN, Warszawa.
[14] Wikiera A. 2004. Wpływ wybranych preparatów pektynaz i fosfataz na degradację fitynianów paszy trawionej metodą in
vitro. Żywność, Nauka, Technologia, Jakość; 3(40), 114-124.
[15] Mika M., Wikiera A., Żyła K., Perek P. 2004. Interakcje pektynaz i fosfataz w procesie zmian biodostępności białka z
paszy dla drobiu. Żywność, Nauka, Technologia, Jakość; 4(41), 107-116.
Ad. 2.
Jednym z ważnych nurtów badawczych mojej pracy naukowej była podjęta w ramach
współpracy z ZPOW „Pektowin” S.A. (dzisiaj Pektowin - A Naturex Company) analiza potencjału enzymatycznego szczepu Aspergillus niger 377-4. W szeroko zakrojonych doświadczeniach badałam wpływ temperatury, czasu, masy podłoża hodowlanego, jego wilgotności początkowej i składu na zdolność szczepu do biosyntezy poligalakturonazy, ksylanazy, glukanazy, fitazy i fosfatazy kwaśnej. Doświadczenia wykazały, że poprzez odpowiedni dobór
wymienionych parametrów hodowli uwarunkowaną genotypowo zdolność szczepu A. niger
377-4 do biosyntezy enzymów można modyfikować w bardzo szerokim zakresie. Wykorzystując moduł statystyczny Planowanie i Analiza Doświadczeń pakietu statystycznego Statgraphics
udało się wyznaczyć modele matematyczne procesów biosyntezy każdego z badanych enzymów. Dla każdego enzymu wyznaczono również optymalny dla efektywnej biosyntezy skład
podłoża oraz układ masy podłoża, wilgotności, temperatury i czasu hodowli. Ustalono, że najwyższą wydajność biosyntezy poligalakturonazy można osiągnąć prowadząc hodowlę powierzchniową Aspergillus niger 377-4 przez 77,7 godz., w temp. 28,9oC na podłożu o masie
początkowej 19,9 g i wilgotności równej 59,9%. Dla efektywnej biosyntezy fitazy przez badany
szczep masę podłoża hodowlanego należy ustalić na 19,9 g a wilgotność na 50%. Optymalna
temperatura dla tego bioprocesu to 33oC przy czasie trwania hodowli równym 83,9 godz. Najwyższą aktywność fosfatazy kwaśnej można osiągnąć prowadząc hodowlę pleśni na podłożu o
masie 17,8 g i wilgotności 60%, w temp. 27oC przez 81,3 godz. Efektywnej produkcji ksylanazy sprzyja natomiast krótkotrwała hodowla pleśni (73 godz.) w temp. 29,6oC, na podłożu o masie początkowej 19,9 g i wilgotności 50%. Szczep Aspergillus niger 377-4 można także nakierować na efektywną biosyntezę -glukanazy pod warunkiem, że jego hodowla prowadzona
25
będzie na podłożu o masie 20 g i wilgotności 59,9%, w temp. 27oC przez 80,4 godz [1]. Optymalny dla biosyntezy poszczególnych enzymów udział wytłoków buraczanych, otrąb pszennych i siarczanu amonu to odpowiednio 55,55 : 42,7 : 1,75 dla poligalakturonazy; 65,7 : 32,8 :
1,5 dla -glukanazy; 45,7: 52,8 : 1,5 dla ksylanazy; 45,55 : 52,7 : 1,75 dla fitazy i 46,15 : 53,1 :
1,5 dla kwaśnej fosfatazy [2].
[1] Wikiera A., Mika M., Starzyńska-Janiszewska A., Żyła K. 2015. The optimization of some extracellular enzymes biosyntesis by Aspergillus niger 377-4. Journal of Scientific & Industrial Research, 74: 145-149.
[2] Wikiera A., Pawlińska R., Żyła K. Wpływ składu podłoża na profil zewnątrzkomórkowych aktywności enzymatycznych
szczepu Aspergillus niger 377-4. Materiały XXXIII Sesji Naukowej Komitetu Technologii i Chemii Żywności PAN, Lublin
2002.
Ad. 3.
W latach 2010-2012 prowadziłam badania, których celem było ustalenie wpływu obecnych
w diecie człowieka alkaloidów purynowych, takich jak kofeina, teofilina i teobromina, na trawienie i biodostępność lipidów. Badania te wykazały, że w warunkach symulowanego in vitro
ludzkiego przewodu pokarmowego testowane metyloksantyny intensyfikują tworzenie emulsji
poprzez zwiększanie stopnia jej dyspersji, a siła ich proemulgacyjnego działania zależy od
rozmieszczenia grup metylowych w cząsteczkach i wzrasta zgodnie z szeregiem 1,3dimetyloksantyna (teofilina), 1,3,7-trimetyloksantyna (kofeina), 3,7-dimetyloksantyna (teobromina). Jednocześnie zauważono, że mimo intensyfikacji procesu emulgacji tłuszczu wszystkie
metyloksantyny powodują hamowanie enzymatycznej hydrolizy triacylogliceroli [1]. Wielkość
tego zahamowania zależała nie tylko od rodzaju i dawki metyloksantyn, ale także od długości
łańcuchów kwasów tłuszczowych hydrolizowanego tłuszczu. Wszystkie metyloksantyny ograniczały skuteczniej reakcję hydrolizy triacylogliceroli krótkołańcuchowych niż długołańcuchowych. Wykazano, że jest to efekt ich bezpośredniego oddziaływania na ludzką lipazę trzustkową. Kofeina i teobromina niezależnie od rodzaju hydrolizowanego przez lipazę substratu wykazywały mieszany typ inhibicji, tzn. zmniejszały jednocześnie szybkość maksymalną reakcji jak
i powinowactwo enzymu do substratu. Natomiast teofilina w reakcji lipolizy tripalmitynianu
glicerolu wykazywała inhibicję mieszaną, a podczas lipolizy trimaślanu glicerolu działała jak
klasyczny inhibitor niewspółzawodniczący [2].
[1] Wikiera A., Mika M. 2012. Wpływ metyloksantyn na emulgację i biodostępność lipidów masła szacowaną metodą in vitro.
Żywność, Nauka, Technologia, Jakość, 3(82): 55-63.
[2] Wikiera A., Mika M., Żyła K. 2012. Methylxanthine drugs are human pancreatic lipase inhibitors. Polish Journal of Food
and Nutrition Sciences, 62(2): 109-113.
26
Ad. 4.
W roku 2007 dołączyłam do grupy badawczej zajmującej się katechinami herbaty. Współpraca ta z małymi przerwami trwa do dzisiaj, a jej efektem jak dotąd jest siedem oryginalnych
prac badawczych i sześć doniesień na konferencje. Początkowo nasze badania dotyczyły wpływu czasu i temperatury parzenia liści białej herbaty na ilość i skład uwolnionych do ekstraktu
flawan-3-oli. Zauważyliśmy, że wraz ze wzrostem temperatury (20-100oC) i czasu (2-120 min)
ekstrakcji nie tylko rośnie ilość uwalnianych do roztworu katechin, ale także istotnie zmienia
się ich profil. Już przy piętnastominutowej inkubacji w temp. 80ºC dobrze widoczny był proces
epimeryzacji flawan-3-oli prowadzący do wzrostu stężenia (-) form (2S, 3R). W efekcie najwyższy udział stereoizomerów należących do (-) form (2S, 3R), wynoszący prawie 37%, oznaczono w roztworze otrzymanym po dwugodzinnej ekstrakcji w temperaturze 100ºC [1,2]. W
dalszych badaniach wykazano, że zarówno profil jak i stężenie flawan-3-oli w ekstraktach mają
decydujący wpływ na ich zachowanie podczas symulowanego in vitro trawienia. Stwierdzono,
że dodatek ekstraktów herbaty do trawionych w warunkach laboratoryjnych modelowych produktów powoduje istotne zahamowanie hydrolizy triacylogliceroli, białek i węglowodanów, a
daleko posunięta epimeryzacja obecnych w ekstraktach flawan-3-oli dodatkowo intensyfikuje
to działanie [2]. Ekstrakty herbaty, szczególnie te bogate w galusany katechin eliminują także
cholesterol z miceli kwasów żółciowych przez co mogą w istotny sposób obniżać jego dostępność [3].
W dalszych badaniach skupiliśmy się już tylko na czystych preparatach katechinowych i
możliwości ich wykorzystania do hamowania procesów oksydacyjnych i hydrolitycznych zachodzących podczas przechowywania oraz obróbki termicznej produktów wysokotłuszczowych. Przeprowadzone doświadczenia wykazały, że preparaty katechinowe mogą skuteczniej
hamować procesy peroksydacji tłuszczów niż zastosowane w tej samej ilości (50 mg%) syntetyczne antyoksydanty: δ-tokoferol czy BHT. Zarówno katechiny natywne jak i katechiny o niskim stopniu modyfikacji termicznej, prowadzącej do 20% udziału (-) form (2S, 3R), najskuteczniej przeciwdziałają procesom oksydacyjnym zachodzącym w wysokiej temperaturze. Natomiast preparaty katechinowe o wyższym stopniu modyfikacji termicznej, zakończonej 30%
udziałem (-) form (2S, 3R), są zdecydowanie efektywniejsze jako stabilizatory żywności przechowywanej w warunkach chłodniczych, w których zatrzymywały procesy oksydacyjne i znacząco hamowały procesy hydrolityczne [4]. Ponadto okazało się, że preparaty katechinowe w
sposób istotny i zależny od stopnia epimeryzacji modelowały procesy trawienia zawierającego
27
je produktu i absorbcję jelitową uwalnianych zeń składników odżywczych. W ich obecności
dochodziło do zmniejszenia stopnia emulgacji tłuszczu [5,6], znacznego ograniczenia hydrolizy
cukrów i spadku biodostępności glukozy nawet o 11% [7] oraz do nasilenia proteolizy przy
minimalnym, bo nie przekraczającym 5%, spadku biodostępności aminokwasów [8]. Wyniki
takie skłoniły nas do postawienia hipotezy, że preparaty katechinowe o odpowiednim udziale () form (2S, 3R) mogą działać jednocześnie nie tylko jako efektywny stabilizator żywności, ale
także jako czynnik prozdrowotny (obniżający biodostępność tłuszczu, cholesterolu i cukrów).
W celu weryfikacji tego założenia przeprowadzono doświadczenie żywieniowe z udziałem myszy z wyłączonym genem apoE. Kolejno oceniano wpływ wprowadzonych do diety katechin i
ich modyfikacji termicznej na rozwój miażdżycy, ogólny stan zdrowia zwierząt, potencjał energetyczny enterocytów i profil kwasów tłuszczowych w podskórnej tkance tłuszczowej. Prace te
były dofinansowane przez MNiSW ze środków projektu badawczego nr N N312 081438, w
którym byłam wykonawcą. Podobnie, jak w doświadczeniach in vitro, również w badaniach in
vivo skuteczniejsze okazały się katechiny modyfikowane termicznie. Najkorzystniejszy wpływ
na organizm zwierząt doświadczalnych obserwowano przy zastosowaniu preparatu o niskim
stopniu modyfikacji termicznej prowadzącej do 20% udziału (-) form (2S, 3R), a optymalna
dawka tego preparatu wynosiła 0,1% diety. Dwukrotnie większa ilość katechin powodowała już
stres oksydacyjny, skutkujący obniżeniem potencjału energetycznego enterocytów [9], przez co
znacząco pogorszyła ich działanie na organizm. Do najważniejszych korzyści wynikających z
zastosowania optymalnej dawki preparatu katechinowego zawierającego 20% (-) form (2S, 3R)
można zaliczyć: wzrost udziału wielonienasyconych kwasów tłuszczowych budujących podskórną tkankę tłuszczową [10], hamowanie rozwoju miażdżycy [11], zmniejszenie przyrostu
masy ciała wywołanego spożywaniem diety wysokotłuszczowej [11], redukcję ilości cholesterolu, triacylogliceroli i wolnych kwasów tłuszczowych w wątrobie i surowicy krwi [12],
zmniejszenie stężenia glukozy, produktów peroksydacji tłuszczów oraz cholesterolu LDL
względem HDL w surowicy krwi [12].
Na podstawie uzyskanych wyników można wnioskować, że dodatek katechin, szczególnie
tych poddanych modyfikacji termicznej, w celu stabilizacji żywności wysokotłuszczowej zawierającej cholesterol, może znacząco zmniejszać negatywne skutki wywołane jej spożyciem.
[1] Mika M., Wikiera A., Żyła K. 2008. Wpływ czasu i temperatury ekstrakcji na zawartość katechin w wodnych ekstraktach
herbaty białej. Żywność, Nauka, Technologia, Jakość, 6(61): 88-94.
[2] Mika M., Borczak B.E., Wikiera A. 2008. Wpływ temperatury przygotowania ekstraktów herbaty białej na skład flawan-3oli i ich oddziaływanie na strawność składników odżywczych z produktu mięsnego. Żywność, Nauka, Technologia, Jakość,
3(58): 123-131.
28
[3] Mika M., Wikiera A., Żyła K. 2008. Effects of non-fermented tea extracts on in vitro digestive hydrolysis of lipids and on
cholesterol precipitation. European Food Research and Technology, 4(226): 731-736.
[4] Mika M., Wikiera A., Żyła K. 2009. Effects of thermally modified green tea catechins on the oxidative and hydrolytic
stability of butter. Health; 1(3) 192-197.
[5] Wikiera A., Mika M., Żyła K. 2009. Wpływ katechin i wybranych stabilizatorów żywności na emulgację lipidów masła w
warunkach symulujących przewód pokarmowy. Żywność, Nauka, Technologia, Jakość, 3(64): 137-144.
[6] Mika M., Wikiera A. Wpływ katechin zielonej herbaty i katechin modyfikowanych termicznie na emulgację tłuszczu.
Materiały X Konferencji Naukowej z cyklu żywność XXI wieku “Żywność projektowana”. Kraków, 22-23.09.2011, s. 50.
[7] Mika M., Wikiera A. Wpływ katechin na biodostępność węglowodanów. Materiały X Konferencji Naukowej z cyklu żywność XXI w. “Żywność a bezpieczeństwo zdrowotne”. Kraków, 18-19.09.2014, s. 195.
[8] Mika M., Wikiera A. Wpływ katechin na biodostępność białek. Materiały XLII Sesji Naukowej Komitetu Nauk o Żywności PAN “Żywność-Zdrowie-Przyszłość”. Lublin, 25-26.06.2015, s. 164.
[9] Mika M., Wikiera A. Wpływ dodatku katechin do diety wysokotłuszczowej na potencjał energetyczny enterocytów myszy
apoE-knockout. Materiały XLI Sesji Naukowej Komitetu Nauk o Żywności PAN “Innowacyjność w nauce o żywności i
żywieniu”, Kraków, 2-3.07.2013, s. 226.
[10] Mika M., Wikiera A. Wpływ dodatku katechin do diety myszy na profil kwasów tłuszczowych podskórnej tkanki tłusczowej. Materiały X Konferencji Naukowej z cyklu żywność XXI w. “Żywność a bezpieczeństwo zdrowotne”. Kraków,
18-19.09.2014, s. 194.
[11] Mika M., Kostogrys R.B., Franczyk-Żarów M., Wikiera A. 2015. Wpływ dawki katechin modyfikowanych termicznie na
hamowanie rozwoju miażdżycy u myszy apoE-knockout. Nauka Przyroda Technologie, 9(3), DOI:
10.17306/J.NPT.2015.3.32.
[12] Mika M., Kostogrys R.B., Franczyk-Żarów M., Wikiera A., Maślak E. 2015. Anti-atherosclerotic activity of catechins
depends on their stereoisomerism. Atherosclerosis, 240: 125-130.
Ad. 5.
Fermentacja tempe to jeden z przykładów fermentacji w podłożu stałym (SSF), stanowiący
tradycyjny sposób przetwarzania nasion soi w produkt tempe przy udziale pleśni głównie z rodzaju Rhizopus. Prowadzone od kilku lat w Katedrze Biotechnologii Żywności UR w Krakowie
badania, w których od niedawna mam przyjemność uczestniczyć pokazują, że fermentacja tempe może być skuteczniejszym niż klasyczna obróbka hydrotermiczna sposobem podnoszenia
wartości żywieniowej nie tylko soi, ale także nasion innych roślin strączkowych [1,2,3], pseudozbóż np. gryki [4,5] czy komosy [6,7,8], a nawet makuchów lnianych [9,10]. Efekt działania
fermentacji można poprawiać np. poprzez stosowanie kultur mieszanych, zawierających obok
Rhizopus pleśnie z rodzaju Aspergillus [1] bądź bakterie Lactobacillus plantarum [3]. We
wszystkich rodzajach produktów tempe w porównaniu do produktów gotowanych obserwowaliśmy bardzo wyraźny, często wielokrotny wzrost siły antyrodnikowej korelujący istotnie ze
wzrostem zawartości fenoli. Znacząco wzrastała też zdolność redukcji jonów żelaza, a w niektórych produktach także zawartość białka [1,8,9] oraz aminokwasów aromatycznych i siarkowych [4]. W tempe z fasoli oznaczono dodatkowo dwa razy mniej niepożadanych oligosacharydów wzdęciogennych stachiozy i werbaskozy oraz trzy razy mniej rafinozy niż w ugotowanych nasionach [3]. Z kolei tempe z komosy i gryki charakteryzowało się wielokrotnie większą
zawartością witamin z grupy B: tiaminy i ryboflawiny [4,7,8]. W przeprowadzonych pilotażo29
wo testach sensorycznych, w ocenie trenowanego panelu, tempe z niesolonej gryki uzyskało
średni wynik 4 w pięciostopniowej skali ogólnej akceptowalności [4,5], a tempe z nasion komosy wynik bardzo dobry w skali siedmiostopniowej [8]. Można więc stwierdzić, że fermentacja typu tempe pozwoliła otrzymać z różnorodnych surowców roślinnych wygodne produkty
spożywcze o korzystnej wartości odżywczej i potencjale antyoksydacyjnym, dobrze wypadające w testach sensorycznych. Jak wskazują nasze ostatnie badania, produkty tempe mogą także
być wykorzystane jako funkcjonalny dodatek do żywności. Fermentowane wytłoki nasion lnu
wprowadzone do jogurtu i sera w ilości od 10 do 20% powodowały bardzo wyraźny wzrost
zawartości białka i fenoli w obu produktach. Spowodowały też korzystny wzrost potencjału
antyrodnikowego i siły redukującej [9,10,11].
[1] Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Wikiera A. 2015. Proteolysis in tempeh-type products obtained with Rhizopus and
Aspergillus strains from grass pea (Lathyrus sativus) seeds. Acta Scientiarum Polonorum: Technologia Alimentaria, 14(2):
125-132.
[2] Stodolak B., Starzyńska-Janiszewska A., Wikiera A. 2015. Wpływ dodatku wytłoków lnianych na potencjał antyoksydacyjny tempe z nasion lędźwianu. Żywność. Nauka.Technologia. Jakość, 6(103): 96-105.
[3] Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Wikiera A. 2015. Antioxidant potential and α-galactosides content of unhulled
seeds of dark common beans subjected to tempe-type fermentation with Rhizopus microsporus var. chinensis and Lactobacillus plantarum. Food Science and Technology Research, 21(6): 765-770.
[4] Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Duliński R., Bączkowicz M., Mickowska B., Wikiera A., Byczyński Ł. 2016.
Effect of solid-state fermentation tempe-type on antioxidant and nutritional parameters of buckwheat groats, as compared to
hydrothermal processing. Journal of Food Processing and Preservation, 40(2): 298-305.
[5] Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Bączkowicz M., Wikiera A., Mika M. Bioactive parameters of buckwheat tempe
as compared to roasted and cooked groats. International Conference „Biologically Active Compounds in Food”, Łódź,1516.10 2015, s.
[6] Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Wikiera A. Fungal solid-state fermentation to obtain quinoa flours of enhanced
antioxidant potential. International Conference „Biologically Active Compounds in Food”, Łódź,15-16.10 2015, s.
[7] Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Bączkowicz M., Wikiera A. Tempe-type fermentation to enhance nutritional and
bioactive parameters of quinoa seeds. 7th International Conference quality and safety in food production chain, Wrocław,
23-24.06.2016
[8] Starzyńska-Janiszewska A., Duliński R., Stodolak B., Mickowska B., Wikiera A. 2016. Prolonged tempe-type fermentation
in order to improved bioactive potential and nutritional parameters of quinoa seeds. Journal of Cereal Science, 71: 116-121.
[9] Stodolak B., Starzyńska-Janiszewska A., Anna Wywrocka-Gurgul, Wikiera A. 2016. Solid-state fermented flaxseed oil
cake of improved antioxidant capacity as potential food additive. Journal of Food Processing and Preservation, doi:
10.1111/jfpp.12855.
[10] Stodolak B., Starzyńska-Janiszewska A., Wikiera A. 2015. Wytłoki nasion lnu podane fermentacji typu tempe jako potencjalny dodatek do żywności. Materiały XLII Sesji Naukowej Komitetu Nauk o Żywności PAN “Żywność-ZdrowiePrzyszłość”. Lublin, 25-26.06.2015, s. 250.
[11] Stodolak B., Starzyńska-Janiszewska A., Wikiera A., Biodostępność białka i aktywność antyoksydacyjna sera z dodatkiem fermentowanych wytłoków lnianych (szacowane in vitro). XII Konferencja Naukowa z cyklu „Żywność XXI wieku”- Żywność a innowacje, Kraków 22-23.09 2016.
6. Podsumowanie działalności naukowo-badawczej
Całkowita liczba publikacji, których jestem współautorką wynosi 64, z czego 17 stanowią
oryginalne prace twórcze opublikowane w czasopismach posiadających współczynnik wpływu
30
- Impact Factor (5 z nich stanowi część osiągnięcia naukowego). Kolejnych 12 prac oryginalnych ukazało się w recenzowanych czasopismach nieposiadających współczynnika wpływu (z
czego jedna stanowi część osiągnięcia naukowego). 21 prac ukazało się w formie materiałów z
konferencji międzynarodowych (jedna jest częścią osiągnięcia naukowego), a 14 było prezentowanych na konferencjach krajowych. Wartość mojego dotychczasowego dorobku naukowego, liczona zgodnie z podanymi zasadami (punkty za pracę z roku jej wydania) wynosi 515
punktów MNiSW (z czego 188 przypada na osiągnięcie naukowe), a łączny IF to 32,69 (w tym
16,92 przypada na cykl publikacji stanowiących osiągnięcie naukowe). Liczba cytowań (z wyłączeniem autocytowań) według bazy Web of Science wynosi 127, a indeks Hirscha 5. W ramach pracy naukowej byłam wykonawcą w jednym projekcie międzynarodowym i pięciu projektach krajowych, współpracowałam także z kilkoma firmami przetwórstwa spożywczego (np.
ZPOW Pektowin SA Jasło, Wakpol SA Ruda Ślaska, OSM Nowy Sącz, PPH Emix Rusinowo).
Tabelaryczne zestawienie mojego dorobku naukowego przedstawiłam poniżej, natomiast
szczegółowy spis wszystkich publikacji i projektów badawczych, w których brałam udział
przedstawiłam w załącznikach 6 i 7.
Tabelaryczne zestawienie dorobku naukowego
Rodzaj publikacji
Liczba publikacji
przed doktoratem
Opublikowane w czasopismach
z listy JCR
Opublikowane w czasopismach
spoza listy JCR
Opublikowane w materiałach
konferencyjnych
Suma
po doktoracie
Punktacja wg roku
ukazania się publikacji
IF
MNiSW
3
14
32,69
441
1
11
-
74
12
23
-
-
16
48
32,69
515
Liczba cytowań na podstawie Web of Science – 127 (bez autocytowań);
Indeks Hirscha wg bazy Web of Science – 5
31

Załącznik nr 2 Autoreferat Enzymy jako bezpieczna alternatywa dla

Transkrypt

Podobne dokumenty

Budowa i właściwości pektyn

Apteki polecają: Herbatki ziołowe na jesień

Patera ozdobna , deska , Płyta do FINGER FOOD

02_Rozdzielanie karta pracy

bezpieczeństwo żywności - substancje dodatkowe