dr Agnieszka Ludwiczuk – załącznik 2

Transkrypt

Załącznik 2
AUTOREFERAT
„Chromatografia
jonowa w analizie próbek klinicznych
pacjentów z chorobami i zaburzeniami o złożonej etiologii”
Anna Błażewicz
UNIWERSYTET MEDYCZNY w LUBLINIE
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej
Zakład Chemii Analitycznej Katedry Chemii
Lublin 2016
dr Anna Błażewicz– załącznik 2
2
SPIS TREŚCI
1. Posiadane dyplomy i stopnie naukowe
4
2. Ukończone kursy i szkolenia
3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych
5
4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca
2003 roku o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach
i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.)
5
a) tytuł osiągnięcia naukowego
5
b) autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa
5
c) omówienie celu naukowego i osiągniętych wyników
8
d) podsumowanie głównych osiągnięć prac włączonych do cyklu habilitacyjnego,
noszące znamiona nowości naukowej
5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych
27
33
a) pozostałe osiągnięcia naukowo-badawcze przed uzyskaniem stopnia doktora
nauk farmaceutycznych
33
b) pozostałe osiągnięcia naukowo-badawcze po uzyskaniu stopnia doktora nauk
farmaceutycznych
35
c) kierowanie międzynarodowymi i krajowymi projektami badawczymi
40
d) współpraca z jednostkami naukowymi w kraju i za granicą
41
e) wykłady na sympozjach i konferencjach
42
f) patenty
42
g) działalność popularyzująca naukę
43
h) recenzowanie publikacji w czasopismach międzynarodowych i krajowych
43
i)
członkostwo w radach naukowych
towarzystwach naukowych
czasopism
i
konferencji
oraz
43
j) działalność dydaktyczna i organizacyjna
43
k) promotorstwo i opieka naukowa nad studentami
44
l) nagrody i wyróżnienia
45
ł) nagrody i działalność kierowanych przeze mnie studenckich kół naukowych
46
6. Autorstwo lub współautorstwo prac naukowych lub innych prac twórczych
48
7. Bibliometryczne wskaźniki dokonań naukowych
48
3
1. Posiadane dyplomy i stopnie naukowe
Dyplom magistra chemii uzyskałam w 1997 r. na Wydziale Chemii Uniwersytetu
Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie po obronie pracy magisterskiej pt.: „Badania nad
ekstrakcyjnym wydzielaniem mikroilości palladu (II) z układów chlorkowych za pomocą
Cyanexu 301 i Cyanexu 302”. Praca została wykonana w Zakładzie Chemii
Nieorganicznej i Ogólnej. Promotorem pracy był prof. dr hab. Zbigniew Hubicki.
Dyplom doktora nauk farmaceutycznych uzyskałam w 2004 r. na Wydziale
Farmaceutycznym z Oddziałem Analityki Medycznej Akademii Medycznej (obecnie:
Uniwersytetu Medycznego) w Lublinie. Tytuł rozprawy doktorskiej: „Modyfikacja
LiChroprepu-NH2 wybranymi sulfonowanymi odczynnikami chelatującymi i zastosowanie
otrzymanych sorbentów w analizie śladowej jonów metali” (promotor: prof. dr hab.
Ryszard Kocjan; recenzenci: prof. dr hab. dr h.c. Edward Soczewiński, prof. dr hab.
Zbigniew Hubicki).
2. Ukończone kursy i szkolenia
 KURS IX EDYCJI Studium Podyplomowego z zakresu Chromatografia
i techniki pokrewne w różnych wariantach oznaczeń śladowych, Uniwersytet
Mikołaja
Kopernika,
Wydział
Chemii,
Zakład
Chemii
Środowiska
i Ekoanalityki, Toruń, 2003.
 Warsztaty
naukowe
pt.
„Nowe
horyzonty
i
wyzwania
w
analityce
środowiskowej i monitoringu”, Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny,
Centrum Doskonałości Analityki i Monitoringu Środowiska, 2003.
 Specjalistyczny kurs języka angielskiego-medycznego dla wykładowców grup
anglojęzycznych zorganizowany przez Uniwersytet Medyczny w Lublinie
w ramach projektu „Nowe kierunki dla kadr medycznych” współfinansowany
ze środków Unii Europejskiej, Lublin, 04.2009-05.2010.
 Szkolenie z chemometrii, Katedra i Zakład Chemii Leków, UM w Lublinie,
2011.
 Kurs pt. „Zastosowania statystyki w medycynie z użyciem oprogramowania
STATISTICA”, Lublin, 2013.
 Kurs LC-MS/MS, Lublin, 2013
4
 Seminarium pt. „Nie tylko LC/MS/MS w analizie ilościowej i jakościowej”,
Interdyscyplinarne Centrum Badań Naukowych KUL, Lublin, 2015.
3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych
1.10.1997 – 31.01.2006 - asystent w Katedrze i Zakładzie Chemii Nieorganicznej
i Analitycznej, Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Analityki Medycznej Akademii
Medycznej im. Prof. Feliksa Skubiszewskiego w Lublinie (obecnie Uniwersytetu
Medycznego).
1.02.2006 – do chwili obecnej – adiunkt w Zakładzie Chemii Analitycznej Katedry
Chemii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie.
4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003
roku o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule
w zakresie sztuki (dz. U. Nr 65, poz. 595 ze zm.)
a) tytuł osiągnięcia naukowego:
„Chromatografia
jonowa
w
analizie
próbek
klinicznych
pacjentów
z chorobami i zaburzeniami o złożonej etiologii”
Osiągnięciem przedstawionym do oceny jest monotematyczny cykl 7 publikacji
i 2 rozdziałów w książkach międzynarodowych, opublikowany w latach 2010-2016,
o łącznym IF wynoszącym 14,743 (159 pkt. MNiSW).
b) autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa
[P-1] A. BŁAŻEWICZ, G. ORLICZ-SZCZĘSNA, A. PRYSTUPA, P. SZCZĘSNY: Use
of ion chromatography for the determination of selected metals in blood serum of
patients with type 2 diabetes. J. Trace Elem. Med. Biol. 2010 vol. 24 nr 1 s. 14-19.
(IF=2,176; KBN/MNiSW=20)
Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badawczej i metodyki
oznaczania jonów metali w próbkach osoczy, przeprowadzeniu badań doświadczalnych,
w tym optymalizacji i walidacji procedur analitycznych, analizie danych doświadczalnych,
graficznym przedstawieniu wyników i ich interpretacji pod kątem zastosowania techniki IC
na tle innych nowoczesnych technik analitycznych oznaczania metali w próbkach
klinicznych, interpretacji i dyskusji wyników doświadczalnych w odniesieniu do danych
5
literaturowych, zebraniu literatury, napisaniu całości pracy w j. ang. oraz redakcji pracy,
przygotowaniu odpowiedzi na recenzje. Mój udział procentowy szacuję na 60%.
[P-2] A. BŁAŻEWICZ, W. DOLLIVER, S. SIVSAMMYE, A. DEOL, R. RANDHAWA, G.
ORLICZ-SZCZĘSNA, R. BŁAŻEWICZ: Determination of cadmium, cobalt, copper,
iron, manganese and zinc in thyroid glands of patients with diagnosed nodular
goitre using ion chromatography. J. Chromatogr. B 2010 vol. 878 nr 1 s. 34-38.
oznaczania jonów metali w próbkach tarczyc, przeprowadzeniu badań doświadczalnych,
w tym optymalizacji i walidacji procedur analitycznych, przygotowaniu tkanek do analizy IC,
analizie danych doświadczalnych, graficznym przedstawieniu wyników i ich interpretacji,
interpretacji i dyskusji wyników doświadczalnych w odniesieniu do danych literaturowych,
zebraniu literatury, napisaniu całości pracy w j. ang. oraz redakcji pracy, odpowiedzi
na recenzje. Mój udział procentowy szacuję na 60%.
[P-3] A. BŁAŻEWICZ, G. ORLICZ-SZCZĘSNA, P. SZCZĘSNY, A. PRYSTUPA,
A. GRZYWA-CELIŃSKA, M. TROJNAR: A comparative analytical assessment
of iodides in healthy and pathological human thyroids based on IC-PAD method
preceded by microwave digestion. J. Chromatogr. B 2011 vol. 879 nr 9/10 s. 573578.
Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu nowatorskiej procedury
przygotowania tkanek tarczyc do analizy z udziałem IC z detekcją amperometrii pulsacyjnej
(PAD) do oznaczania jodu, przygotowaniu metodyki IC-PAD, opracowaniu parametrów
walidacyjnych, przeprowadzeniu części eksperymentalnej, dyskusji wyników, zebraniu
literatury, napisaniu całości pracy w j. ang., prowadzeniu korespondencji z redakcją
czasopisma. Mój udział procentowy szacuję na 60%.
[P-4] A. BŁAŻEWICZ, M. KLATKA, A. ASTEL, M. PARTYKA, R. KOCJAN: Differences
in trace metal concentrations (Co, Cu, Fe, Mn, Zn, Cd, and Ni) in whole blood,
plasma, and urine of obese and nonobese children.
Biol. Trace Elem. Res. 2013 vol. 155 nr 2 s. 190-200.
oznaczania jonów metali w próbkach płynów ustrojowych (krew, osocze, mocz),
zaplanowaniu i przeprowadzeniu wszystkich etapów procesu analitycznego, dyskusji
wyników,
zebraniu
literatury,
napisaniu
6
całości
pracy
w
j.
ang.,
prowadzeniu
korespondencji z redakcją czasopisma. Mój udział procentowy szacuję na 65%.
[P-5] A. BŁAŻEWICZ, M. KLATKA, W. DOLLIVER, R. KOCJAN: Determination of total
iodine in serum and urine samples by ion chromatography with pulsed
amperometric detection - Studies on analyte loss, optimization of sample
preparation procedures, and validation of analytical method. J. Chromatogr. B
2014 vol. 962 s. 141-146.
oznaczania jonów jodu w próbkach płynów ustrojowych (osocze, mocz), przeprowadzeniu
pomiarów stabilności analitów w dwóch rodzajach próbek, optymalizacji procedur
przygotowania próbek, zaplanowaniu wszystkich etapów procesu analitycznego, dyskusji
wyników, napisaniu całości pracy w j. ang., prowadzeniu korespondencji z redakcją
czasopisma. Mój udział procentowy szacuję na 70%.
[P-6] A. BŁAŻEWICZ: Selected problems on ion chromatography determinations of
trace elements in clinical samples. Curr. Chromatogr. 2014 vol. 1 nr 1 s. 2-14
(IF=0; KBN/MNiSW=0)
Jest to praca w całości zaplanowana i napisana przeze mnie, dotycząca przeglądu
problematyki IC w aspekcie próbek klinicznych. Czasopismo powstało w 2014 r. i dlatego
jeszcze nie uzyskało punktacji. Zaproszenie do napisania w/w artykułu w numerze
inauguracyjnym uważam za swój sukces, a Current Chromatography za czasopismo
prestiżowe, skupiające wybitnych specjalistów z dziedziny chromatografii (nie tylko
jonowej) w radzie naukowej. Byłam pierwszym z Polski członkiem rady naukowej tego
czasopisma, a w 2014 r. jedynym polskim członkiem w radzie redakcyjnej. Mój udział
wynosi 100%.
[P-7] A. BŁAŻEWICZ, A. MAKAREWICZ, I. KORONA-GŁOWNIAK, W. DOLLIVER,
R. KOCJAN: Iodine in autism spectrum disorders.
J. Trace Elem. Med. Biol. 2016 vol. 34 s. 32-37.
oznaczania jonów jodu w próbkach moczu dzieci z autyzmem, przeprowadzeniu części
doświadczalnej, interpretacji, dyskusji wyników, zebraniu literatury, napisaniu całości
projektu dotyczącego problematyki IC w aspekcie zastosowań w badaniach autyzmu,
wystąpieniu o zgodę komisji bioetycznej, napisaniu całości pracy w j. ang., prowadzeniu
korespondencji z redakcją czasopisma. Mój udział procentowy szacuję na 70%.
7
[R-1] A. BŁAŻEWICZ: A review of spectrophotometric and chromatographic methods
and sample preparation procedures for determination of iodine in miscellaneous
matrices. W: Macro to nano spectroscopy. Ed. by Jamal Uddin, Rijeka 2012,
InTech, 371-398.
(KBN/MNiSW=5)
Udział procentowy wynosi 100%.
[R-2] A. BŁAŻEWICZ: Ion chromatography, W: Iodine chemistry and applications.
Ed. by Tatsuo Kaiho, Hoboken 2015, John Wiley & Sons, Inc. s. 25-54.
(KBN/MNiSW=5)
Udział procentowy wynosi 100%.
W w/w pracach jestem jednocześnie autorem korespondencyjnym.
c) omówienie celu naukowego i osiągniętych wyników
Wstęp
Chromatografia jonowa (IC) jest techniką instrumentalną stosowaną w oznaczaniu
jakościowym i ilościowym jonów. Wysokosprawna chromatografia jonowa jest odmianą
chromatografii cieczowej (LC), dlatego wymaga stosowania podobnych urządzeń jak
wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC). Główne różnice dotyczą charakteru
analitu, rodzaju wypełnień kolumn (faz stacjonarnych), rodzaju eluentów i rodzaju detekcji.
Obecnie można wyróżnić dwa główne typy IC, mianowicie chromatografię jonową
z supresją (czyli tłumieniem przewodnictwa tła) i chromatografię jonową bez supresji.
Jedną z zalet supresji jest możliwość oznaczania niewielkich stężeń jonów w obecności
dużych stężeń innych jonów, przykładowo stosunek stężeń oznaczanych jonów w próbce
może być niekiedy rzędu 1:10000 jak w oznaczaniu bromianów (V) w obecności jonów
chlorkowych BrO3-/Cl- (Michalski, 2009).
Duża selektywność rozdzielania chromatograficznego ma szczególne znaczenie
w analizie próbek biologicznych (w tym klinicznych), w których stężenia poszczególnych
jonów bardzo się różnią. Podstawowym mechanizmem rozdzielania jonów jest zwykle
wymiana jonowa, rozdzielanie z udziałem par jonowych, jonowykluczanie lub rozdzielanie
za pomocą tworzenia chelatów.
Wśród innych zalet IC świadczących o tym, iż jest to dogodna technika analityczna
należy
wymienić
możliwość
jednoczesnego
oznaczania
jonów
organicznych
i nieorganicznych, kationów oraz anionów, względnie krótkie czasy rozdzielania analitów
(od kilkunastu do kilku minut w tzw. szybkiej IC, ang. fast IC) i możliwość stosowania
różnego
typu
detektorów
potencjometryczny,
(konduktometryczny,
fluorescencyjny,
spektrofotometryczny
chemiluminescencyjny,
8
UV/Vis,
refraktometryczny,
spektrometrii mas z plazmą indukcyjnie sprzężoną, spektrometrii emisji optycznej ze
wzbudzeniem w plazmie indukcyjnie sprzężonej). Ponadto dbałość o środowisko
w kontekście niewielkich ilości zużywanych eluentów (w porównaniu z metodami
klasycznymi), niewielka ilość próbki potrzebna do analizy (co ma duże znaczenie
w przypadku próbek pochodzących od pacjentów) oraz możliwość specjacji jonów.
Należy podkreślić również użycie mniej toksycznych eluentów w porównaniu do
HPLC (zwykle to roztwory rozcieńczonych kwasów, bądź zasad), dokładność,
wykrywalność, precyzję oraz możliwość łączenia IC z innymi technikami (zwykle z MS, lub
ICP-MS) (Haddad i Jackson, 1990; Weiss, 2004; Michalski, 2011; Błażewicz, 2014).
Kierunki w jakich podąża obecnie IC to głównie synteza nowych faz stacjonarnych,
pozwalających na szybkie i wydajne rozdzielania jonów, miniaturyzacja i poszerzenie
zastosowań w chemii, biochemii, biologii molekularnej, farmakologii, czy ochronie
środowiska. Każdego roku pojawia się kilka tysięcy publikacji naukowych dotyczących
chromatografii jonowej (Błażewicz, 2014).
Zastosowanie IC w analizie próbek klinicznych to wyzwanie nie tylko o charakterze
analitycznym ze względu na charakter analitu i poziom jego stężenia w próbce.
Oznaczenia tego typu wymagają niezwykle czułych, precyzyjnych i dokładnych oznaczeń.
Problem mogą stanowić wartości odniesienia, ponieważ nie są znane zakresy
referencyjne dla większości pierwiastków we wszystkich typach próbek klinicznych
szerokiej populacji ludzi zdrowych. Ponadto, jeśli takowe zakresy są podawane
w publikacjach to zwykle dotyczą grupy osób nie zawsze spełniających właściwe kryteria
doboru do grupy kontrolnej (przykładowo cechy osobnicze takiej grupy nie zawsze
odpowiadają grupie badanej).
Dodatkowo
przygotowania
zdarza
próbek
się,
do
że brakuje podstawowych
analizy,
ich
transporcie,
informacji o sposobie
przechowywaniu,
użyciu
certyfikowanych materiałów odniesienia, itd. Tak jak we wszystkich oznaczeniach
śladowych, tak i w IC istotne są wszystkie czynniki przedanalityczne związane
z możliwością zanieczyszczenia próbki lub/i możliwością straty analitu (środowisko
laboratorium, odpowiedni dobór naczyń laboratoryjnych, jakość odczynników, procesy
adsorpcji, czy desorpcji zachodzące na lub ze ścianek naczyń laboratoryjnych, itd.).
Wymienione czynniki mają kluczowy wpływ na interpretację wyników w aspekcie
stosowania IC do oznaczania jonów w próbkach klinicznych, których matryca jest złożona.
Ocena wpływu zawartości różnych pierwiastków na występowanie choroby
czy zaburzenia będącego skutkiem odmiennego niż w stanie zdrowia poziomu
pierwiastków w organizmie, jest trudnym zadaniem wymagającym interdyscyplinarnego
podejścia do zagadnienia. Monitorowanie zaburzeń homeostazy pierwiastkowej ma
9
ogromne znaczenie dla klinicystów (Centeno i wsp., 2012), dlatego współpraca chemików
analityków z lekarzami jest kluczowa.
Liczba pierwiastków o znaczeniu klinicznym jest imponująca. Odgrywają one wiele
istotnych ról w organizmach żywych (Iyengar i wsp., 1978; Mayer i wsp., 1993; Nielsen,
1990; Guidotti i wsp., 2008). Wiele właściwości biologicznych pierwiastków nie zostało
wyjaśnionych, chociaż badania eksperymentalne są prowadzone od wielu dziesięcioleci.
Stale poszukuje się nowych rozwiązań analitycznych, które mogą pomóc
oszacować, głównie niedobór i toksyczność pierwiastków śladowych. Próg toksyczności
jest często niezidentyfikowany i prawdopodobnie jest bardzo zmienny. Wyjątkiem jest
ołów, dla którego poziom wynoszący 3,0 µmol/l we krwi przyjęto za toksyczny u dorosłych
(Goyer, 1997).
Zrozumienie
wyników
analizy
pierwiastkowej
jest
niezbędne
jeśli
chodzi
o diagnostykę, leczenie i prewencję. Prace dotyczące badania zawartości pierwiastków
w płynach biologicznych i tkankach pozwalają m.in. na wyjaśnienie związku pomiędzy
ekspozycją środowiskową i działaniem biologicznym danego pierwiastka, co służy
monitoringowi biologicznemu celem oceny zagrożenia dla zdrowia. Jak wiadomo,
pierwiastki toksyczne mogą konkurować z pierwiastkami niezbędnymi nawet przy niskich
poziomach ekspozycji (Lopez Alonso i wsp., 2004). Znajomość tych zależności może być
kluczowa dla zrozumienia interakcji kinetycznych pierwiastków i w konsekwencji ich
skutków oddziaływań na metabolizm. Lepsze zrozumienie wzajemnych oddziaływań
pierwiastków może pomóc w przewidywaniu podatności na toksyczność lub przewidywać
charakter zaburzeń i chorób związanych z dyshomeostazą pierwiastkową. Badania
korelacji międzypierwiastkowych udowodniły, że niezbędne pierwiastki (Co, Cr, Cu, K, Fe,
Mg, Mn, Mo, Se i Zn) mogą posiadać rolę ochronną przed toksycznymi (Yoo i wsp., 2002).
Dane literaturowe wskazują również, że niedobory żywieniowe dla pewnej grupy
pierwiastków mogą zwiększyć wchłanianie toksycznych metali przez niektóre tkanki, m.in.
niedobór cynku zwiększa zawartość kadmu w wątrobie, a niedobór żelaza i miedzi
zwiększa zawartość kadmu w nerkach (Fox i wsp., 1984). Kadm wpływa z kolei na
metabolizm cynku i miedzi. Niektóre badania na zwierzętach wykazały, że narażenie
na kadm powoduje wzrost wydalania niektórych niezbędnych metali, np. miedzi, cynku,
czy żelaza (Ashby i wsp., 1980; Chmielnicka i wsp., 1989). W jednym z eksperymentów
przeprowadzonych prawie 30 lat temu (Bremner i Campbell, 1978) wykazano,
że negatywne skutki zwiększonego spożycia kadmu u zwierząt mogą być zmniejszone
dzięki suplementacji cynku i miedzi. Wykazano, że zmiany w metabolizmie wapnia mogą
wpływać na wchłanianie ołowiu. Goyer (1997) udowodnił, że obniżona podaż wapnia
w diecie sprzyja wchłanianiu ołowiu oraz jego akumulacji w narządach. Wiele innych tego
10
typu przykładów można znaleźć w literaturze naukowej, a intencją ich podkreślenia jest
zwrócenie uwagi na fakt, że nie byłoby możliwe badanie interakcji międzypierwiastkowych
bez wcześniejszego dokładnego zbadania zawartości wielu pierwiastków w wielu
matrycach biologicznych.
Ogromnym wyzwaniem w dzisiejszych czasach jeśli chodzi o analizę śladową
stosowaną w kontekście medycznym jest zidentyfikowanie i zrozumienie podłoża chorób
i zaburzeń o złożonej etiologii. Pomimo intensywnych badań wiele funkcji pierwiastków nie
zostało jeszcze w pełni wyjaśnionych. Badania takie komplikują czynniki, o których
wspomniałam powyżej, a także wiele innych wpływających na poziom poszczególnych
pierwiastków w organizmie, choćby takich jak czynniki osobnicze, dieta, współistnienie
innych zaburzeń i chorób, stres, nałogi, itd. Celem stwierdzenia zaburzeń homeostazy
pierwiastkowej w organizmie dokonuje się zarówno badań pojedynczych pierwiastków lub
jeśli umożliwia to aparatura, badań wielopierwiastkowych, najlepiej w różnych rodzajach
próbek pochodzących od tego samego pacjenta. Chromatografia jonowa ma spory
potencjał w tym aspekcie.
Streszczenie
Celem prowadzonych przeze mnie badań było:
1. Opracowanie optymalnych procedur przygotowania próbek o złożonej matrycy
(krew, osocze, mocz, tkanki tarczycy) do analizy z użyciem chromatografii jonowej (IC)
z różnymi wariantami detekcji w celu oznaczenia zawartości jonów metali oraz jonów
jodkowych – publikacje [P-1, P-2, P-3, P-4, P-5].
2. Zastosowanie
zoptymalizowanych
procedur
przygotowywania
próbek
oraz
zwalidowanej metodyki IC oznaczania wybranych rodzajów jonów w próbkach
pochodzących od pacjentów z cukrzycą typu 2, wolem guzkowym tarczycy, otyłością
oraz autyzmem – [P-1, P-2, P-3, P-4, P-5, P-7]
ze szczególnym uwzględnieniem:
- oceny wpływu sposobu przechowywania próbek tkanek tarczyc na oznaczanie jodu
metodą chromatografii jonowej z detekcją amperometrii pulsacyjnej (IC-PAD)
– [P-3],
- porównania wyników IC z ICP-MS dla tych samych rodzajów próbek celem
weryfikacji jakości oznaczeń – [P-4],
- przedstawienie korelacji międzypierwiastkowych z uwzględnieniem rodzaju matrycy
– [P-4],
11
- zbadania zależności pomiędzy wyborem rodzaju próbki (mocz, krew, osocze)
a wpływem zawartości wybranych metali na ryzyko wystąpienia otyłości – [P-4],
- zbadania stabilności próbek osocza i moczu przed oznaczaniem jodu za pomocą
IC-PAD – [P-5],
- oceny związku parametrów biochemicznych, antropometrycznych oraz objawów
nasilenia zaburzenia ze spektrum autyzmu z poziomem jodu w organizmie – [P-7].
3. Porównanie uzyskanych wyników z wynikami osób zdrowych celem zbadania związku
poziomu zawartości wybranych jonów z występowaniem zaburzeń bądź chorób
- [ P-1, P-2, P-3, P-4, P-5].
Do cyklu publikacji dołączyłam również pracę przeglądową [P-6], w której opisałam
nie tylko metody analityczne służące oznaczaniu pierwiastków śladowych w próbkach
klinicznych, ale również typy matryc i analitów oznaczanych najczęściej za pomocą metod
chromatograficznych i spektralnych. Opisałam również rolę chromatografii jonowej
w analizie próbek klinicznych, przykłady analizy specjacyjnej oraz technik łączonych z IC,
metody przygotowania próbek przed analizą IC oraz najczęstsze problemy związane
z brakiem materiałów referencyjnych, brakiem adekwatnych zakresów referencyjnych dla
określonych analitów i matryc w odniesieniu np. do wieku osób stanowiących grupę
kontrolną. Publikacja ta w całości dotyczy problematyki chromatografii jonowej.
Z uwagi na ogromne zainteresowanie problematyką jodu na świecie zostałam
poproszona o napisanie rozdziału do książki pt. „Macro to nano spectroscopy” pod
redakcją Jamala Uddina, w którym dokonałam przeglądu metod chromatograficznych
i spektrofotometrycznych oraz procedur przygotowania próbek podczas oznaczaniu jodu
w matrycach różnego typu, w tym próbek klinicznych – [P-8]. Skutkiem pojawienia się
tego rozdziału, cieszącego się sporą popularnością wśród czytelników (liczba odsłon
rozdziału przekracza kilka tysięcy rocznie), zostałam również zaproszona do grona
autorów książki „Iodine chemistry and applications” pod red. Tatsuo Kaiho. W książce tej,
w rozdziale zatytułowanym „Ion chromatography” szczegółowo opisałam zasady IC oraz
aparaturę stosowaną w oznaczaniu jodu, mocne i słabe strony stosowania IC
do oznaczania jonów jodu, specjację jodu w różnych matrycach biologicznych
i środowiskowych, problematykę związaną z wpływem czynników przedanalitycznych na
oznaczenia jodu za pomocą IC, rozkład próbek biologicznych, rodzaje certyfikowanych
materiałów referencyjnych, trendy i przyszłe kierunki w chromatografii jonowej – [P-9].
W swojej pracy dotyczącej zastosowania chromatografii jonowej z detekcją
spektrofotometryczną po derywatyzacji pokolumnowej do oznaczania jonów wybranych
metali w próbkach osocza krwi pacjentów z cukrzycą typu 2 [P-1] wraz z zespołem
pracowników Kliniki Chorób Wewnętrznych SPSK 1 w Lublinie zajęłam się chorobą, której
12
–
powikłania
wg
Światowej
Federacji
Diabetologicznej
(IDF)
(http://www.diabetesatlas.org/) są już częstszą przyczyną zgonów na świecie aniżeli
AIDS, gruźlica i malaria razem wzięte. Szacuje się, że do 2040 roku 1 dorosły na 10 (642
milionów osób) zachoruje na cukrzycę.
Literatura podaje, że chroniczna niekontrolowana hipoglikemia może znacząco
wpływać na poziom wielu pierwiastków w organizmie, a niektóre pierwiastki mogą
znacząco modyfikować metabolizm glukozy (np. miedź i chrom) (Geldmacher-von
Mallinckrodt i Meissner, 1994). Dlatego zasadne jest badanie zawartości pierwiastków
chemicznych w płynach fizjologicznych u pacjentów z cukrzycą. Należy zaznaczyć, że
dotychczas nie są to rutynowo zlecane badania.
Ponieważ wiele opublikowanych prac na temat zawartości pierwiastków w cukrzycy
podaje sprzeczne dane co do rodzaju pierwiastków posiadających związek z cukrzycą
i ich zawartości w organizmie (Kruse-Jarres i Rükgauer, 2000; Siddiqui i wsp., 2014),
dlatego postanowiłam zastosować szybką i czułą technikę IC poprzedzoną mineralizacją
z udziałem kwasu azotowego (V) w układzie zamkniętym ze wzbudzeniem mikrofalowym
do oznaczenia jonów metali w osoczu krwi diabetyków i osób zdrowych. Osocze stanowi
zbyt skomplikowaną matrycę (m.in. liczne białka, lipoproteiny), aby móc dozować próbkę
bezpośrednio na kolumnę chromatograficzną.
Badania wymagały zwalidowania metodyki oznaczania jonów w materiale
biologicznym, opracowania optymalnej procedury przygotowania osocza do analizy IC,
przeprowadzenia analiz u 96 pacjentów z cukrzycą (w tym 26 ze zdiagnozowanym
nadciśnieniem) oraz u 50 osób zdrowych dobranych pod względem wieku. Średni czas
jaki upłynął od zdiagnozowania cukrzycy wynosił 7 lat. Pacjenci i osoby zdrowe spełniały
kryteria wstępne (m.in. brak suplementacji witaminami i minerałami przez rok
poprzedzający badania, brak nałogów).
W
początkowym
etapie
pracy
przeprowadziłam
optymalizację
procedury
mineralizacji zamrożonych próbek osocza, która wymagała rozmrożenia w temp.
pokojowej każdorazowo małej ilości próbki, tj. 0,5 ml osocza, dodania niewielkiej ilości
(0,1 ml) 99,99% roztworu HNO3 i 9,4 ml wody dejonizowanej. Tak dobrane proporcje
składników ograniczają do minimum ilość próbki pobranej od pacjenta oraz użycie drogich
odczynników. Przeprowadziłam mineralizację w układzie zamkniętym z udziałem energii
mikrofal, aby ograniczyć straty analitu oraz przyspieszyć rozkład próbki.
Optymalizacja czasu mineralizacji wykazała, że czas niezbędny do całkowitego
przekształcenia matrycy próbki przy stałym wzroście ciśnienia i stałym wzroście mocy
generatora mikrofal powinien wynosić minimum 28 minut (łącznie z 10 min. chłodzeniem
układu),
gdyż
krótsze
mineralizacje
powodowały
13
zaburzenia
linii
bazowej
chromatogramów, uniemożliwiając ich prawidłową interpretację. Odzysk jaki uzyskałam
dla dodatków jonów w stęż. 0,25, 0,5 i 1,0 µg/ml w czasach całkowitych trwania procesu
mineralizacji 28 i 34 min. (niższe czasy powodowały problemy z detekcją jonów) wynosił
od 98% do 102% dla Fe3+, od 89,9 do 100% dla Cu2+, od 87,9 do 102% dla Zn2+ i od 89,6
do 102% dla Mn2+.
Aby ocenić zgodność metody IC ze stawianymi jej wymogami i określić jej
przydatność do zaplanowanych badań, określiłam granicę wykrywalności (LOD), granicę
oznaczalności (LOQ), współczynnik korelacji R2 (SD vs stęż.). Zastosowałam metodę
Hubaux-Vos’a do obliczeń wartości LOD, określiłam selektywność w oparciu o analizę
roztworów wzorcowych oraz w oparciu o wyniki uzyskane w trakcie analiz próbek
rzeczywistych. Wyznaczyłam precyzję, do której wykorzystałam względne odchylenie
standardowe serii pomiarów uzyskanych w laboratorium (6 powtórzeń dla czterech
różnych stężeń w czterech różnych odstępach czasowych). Ponieważ w chwili
wykonywania badań nie dysponowałam standardowym materiałem referencyjnym,
dlatego dokładność oszacowałam poprzez analizę roztworów osoczy po dodaniu do nich
znanych ilości poszczególnych jonów (na różnych poziomach zawartości).
Opracowana przeze mnie metodyka analityczna oznaczania jonów w osoczu krwi
za pomocą IC charakteryzowała się:
- liniowością w szerokim zakresie stężeń zawartości jonów (dla Fe3+, Cu2+, Zn2+ i Mn2+
w zakresie stężeń 0,001-10 µg/ml),
- niską wartością granicy wykrywalności (od 0,006 µg/ml dla Ni2+ do 0,056 µg/ml dla
Zn2+),
- wysoką powtarzalnością (RSD od 1,16 % dla Fe3+ do 5,2 % dla Cu2+),
- dużą dokładnością uzyskiwanych wyników (RSD od 5,16 % dla Fe3+ do 7,23% dla
Mn2+).
Porównując uzyskane wyniki dla grup chorych i zdrowych stwierdziłam, że
pacjenci chorzy na cukrzycę t2 mający nadciśnienie mają istotnie wyższe stężenie Cu
w osoczu w porównaniu z pacjentami z cukrzycą bez nadciśnienia i zdrowymi. Wynik ten
jest zgodny z literaturowymi doniesieniami (Walter i wsp., 1991) i potwierdza wpływ miedzi
na patogenezę cukrzycy. Badania nie wykazały zmniejszonej zawartości cynku w osoczu
diabetyków, choć zwykle te dwa rodzaje jonów wykazują antagonistyczne oddziaływania
w organizmie (Zheng 2008). Nie oznaczono stężenia Mn2+ tylko u diabetyków (poniżej
LOQ), nie wykryto Ni2+ w obu grupach. Jest to dość istotny wynik, ponieważ uważa się,
że diabetycy mają znacznie obniżoną funkcję nerek i są narażeni na ryzyko
nefrotoksyczności ze strony metali ciężkich. Zawartość żelaza w obu grupach była
porównywalna.
14
W pracy wykazałam, że chromatografia jonowa może stanowić narzędzie
analityczne przydatne do badania osocza krwi, a opracowana przeze mnie procedura
przygotowania osocza do badań IC jest szybka, wydajna i ekonomiczna.
Kontynuując współpracę z Kliniką Chorób Wewnętrznych SPSK 1 w Lublinie,
w kolejnych badaniach opisanych w [P-2] zbadałam próbki pacjentów z wolem guzkowym
tarczycy pod kątem zawartości w nich wybranych metali. Wole guzkowe jest najbardziej
powszechną patologią gruczołu tarczowego (Mortensen i wsp., 1995; Voltzke I wsp.,
2003). W etiologii wola guzkowego odgrywa rolę szereg czynników. Wiele zaburzeń
w syntezie i metabolizmie hormonów tarczycy ma również podłoże genetyczne (Knudsen
i wsp., 2002). Niedobory hormonów tarczycy mogą być spowodowane działaniem
związków wolotwórczych pochodzenia roślinnego (np. rodanki, 5-winylooksazolidyna)
(Jastrzębska, 1999), jak również leków z grupy tyreostatyków, chloranu (VII) potasu,
sulfonamidów, soli kobaltu i litu (związków blokujących jodowanie tyrozyny) (Kirov i wsp.,
2005). Jak donosi literatura - tarczyca może akumulować pierwiastki niezależnie od ich
dobroczynnego bądź negatywnego wpływu na ten gruczoł (Saltzman i wsp., 1990).
Istnieją również przesłanki, że metale toksyczne stanowią bezpośrednią przyczynę
raka tarczycy (Zaichick i wsp. 1995; Yaman, 2006).
Oznaczyłam jony kadmu, kobaltu, manganu i cynku w tkankach tarczyc pacjentów
z wolem guzkowym tarczycy. Do badan zakwalifikowano 65 pacjentów, którym
chirurgicznie usunięto guzy tarczycy. Histopatologicznie przebadane tkanki dostarczono
do laboratorium w pojemnikach plastikowych z formaliną. Tkanki, które były odnośnikiem
zdrowych tarczyc (przebadanych histopatologicznie) pochodziły od 50 ofiar wypadków
komunikacyjnych. Zarówno pacjenci szpitala jak i ofiary wypadków pochodziły z tego
samego regionu geograficznego (Lubelszczyzna).
Każdorazowo 0,5 g tkanki po wielokrotnym opłukaniu wodą dejonizowaną
i wysuszeniu było mineralizowane w układzie zamkniętym stosując mieszaninę 99.99%
HNO3 i wody dejonizowanej w stosunku obj. 1:4. Warunki pracy mineralizatora, tj. moc
generatora mikrofal, jak również masa próbki potrzebna do analizy i czas trwania całej
procedury zostały przeze mnie zoptymalizowane. Optymalny czas mineralizacji wyniósł 26
minut (łącznie z chłodzeniem), a masa 0,5 grama tkanki była odpowiednia. Podwójne
mycie naczyń teflonowych rozcieńczonym roztworem HNO3 zapobiegło tzw. efektom
pamięciowym związanym z adsorpcją analitu na ściankach naczynia. Po mineralizacji
konieczne było rozcieńczenie powstałych roztworów wodą dejonizowaną (1:10 v/v).
Analiza IC wymagała łącznie 1035 nastrzyków na kolumnę (łącznie 115 tkanek
podzielonych
na
3
jednakowe
części
dozowane
trzykrotnie),
celem
zbadania
powtarzalności. Do wstępnej weryfikacji dokładności kalibracji zastosowano standardowy
15
materiał referencyjny NIST Standard Reference Material oyster tissue (SRM 1566a).
Ponieważ zastosowałam inny niż poprzednio rodzaj próbki (tkanki), określiłam niezbędne
parametry walidacyjne IC. Dokładność sprawdziłam przy użyciu SRM, precyzję, której
strategię wyznaczania zastosowałam również w poprzedniej pracy (tj. 4 stężenia/6
powtórzeń/ 4 różne odstępy czasowe) - oszacowałam jako RSD (od 1,9 % dla Zn2+ do 5%
dla Cd2+). Odzyski dla każdego rodzaju jonu metalu były zadowalające (najniższy średni
odzysk 90,2% dla Mn2+, najwyższy 108% dla Fe3+).
Nowością w pracy jest zastosowanie po raz pierwszy IC do badań tkanek.
Dodatkową zaletą jest fakt, że były to tkanki ludzkie, ponieważ przedmiotem badań są
zwykle tkanki tarczyc zwierząt z uwagi na mozolne procedury pozyskania tkanek
z autopsji.
Wykazałam, że wyniki IC zawartości żelaza, cynku i miedzi są zgodne z danymi
uzyskanymi za pomocą neutronowej analizy aktywacyjnej (NAA) oraz spektrometrii mas
z plazmą wzbudzoną indukcyjnie (ICP-MS), pomimo, że autorzy stosowali inne procedury
przygotowania próbek tarczyc i inne techniki oznaczeń.
Dla kobaltu i dla manganu uzyskałam odmienne wartości od podawanych
w literaturze (zawartości Co w zdrowych tkankach były 3,1-4,7 raza wyższe niż podają
dane literaturowe, a Mn 1,9 razy niższe niż opublikowane dane). Nie oznaczyłam jonów
niklu w obydwu grupach. Oznacza to, że dla pewnych metali stosowanie IC jest
porównywalne z innymi technikami (droższymi i bardziej czasochłonnymi), a dla
niektórych metali występują pewne rozbieżności. Niestety literatura naukowa dotycząca
analizy tkanek tarczyc na zawartość pierwiastków jest bardzo uboga w opisy
przedanalitycznych czynności jakie należy podjąć przed ostateczną analizą. Może to mieć
zasadniczy wpływ na ewentualne rozbieżności wyników i trudności z ich porównaniem.
W pracy po raz pierwszy dowiodłam, że znacząco niższa zawartość Cu, Fe, Mn
i Zn dotyczy tkanek z wolem guzkowym w porównaniu ze zdrowymi tkankami
(dla Zn jest to ponad dwukrotne zmniejszenie zawartości). Redukcja stężeń była
obserwowana we wszystkich próbkach patologicznych tkanek. Zawartość kobaltu
w zdrowych i chorobowo zmienionych tkankach nie różniła się znacząco.
Współpraca z zespołem lekarzy z Kliniki Chorób Wewnętrznych SPSK 1 w Lublinie
zaowocowała możliwością poszerzenia zastosowania IC do badań jodu u pacjentów
z
wolem
guzkowym.
Opracowałam
nową
metodykę
badań
zawartości
jodu
w tkankach tarczyc pacjentów szpitala oraz zdrowych tkanek od ofiar wypadków ([P-3]).
Zastosowałam inny rodzaj kolumny i prekolumny niż poprzednio, a także inny rodzaj
detekcji jonów (detekcję pulsacyjnej amperometrii - PAD) po uprzednim opracowaniu
nowej procedury przygotowywania tkanek tarczyc z użyciem alkalicznej mineralizacji.
16
Jod stanowi dość trudny analit nie tylko dla chromatografistów. Jego właściwości
chemiczne oraz formy w jakich występuje w tkankach nastręczały od lat trudności
w laboratoriach badawczych. Opisywana w literaturze procedura spalania Schoenigera
(ang. Schoeniger combustion) wymaga użycia wysoce homogenicznych próbek,
co w przypadku tkanek może stanowić zasadniczy problem (Knapp i wps., 1998). Z kolei
Departament Zdrowia Stanów Zjednoczonych opisał metodę oznaczania jodu za pomocą
techniki neutronowej analizy aktywacyjnej z detekcją spektrometrii mas (NAA-MS)
po roztwarzaniu tarczyc za pomocą kwasu siarkowodorowego (U.S. Department of Health
and Human Services, 2004). Aby uniknąć straty analitu w formie wolnego jodu bądź
jodowodoru, co mogłoby się zdarzyć w przypadku użycia kwasów w swojej pracy
zastosowałam
wodny
roztwór
wodorotlenku
tertrametyloamoniowego
(TMAH).
Ważnym celem tych badań było również sprawdzenie czy sposób przechowywania
próbek tkanek ma wpływ na wynik końcowy oznaczania jodu. Ponieważ jak napisałam
powyżej literatura naukowa dotycząca analizy tkanek tarczyc na zawartość jodu jest
bardzo uboga w opisy przedanalitycznych czynności jakie należy podjąć przed ostateczną
analizą (m.in. przechowywanie tkanek w stanie zamrożonym, czy umieszczenie ich
w formalinie może mieć potencjalny wpływ na końcowy wynik oznaczania jodu), dlatego
poszerzyłam
badania
o
sprawdzenie
wpływu
sposobu
przechowywania
próbek
w laboratorium w odniesieniu do końcowych wyników uzyskanych za pomocą IC.
Ocena czy utrwalanie tkanek tarczycy w formalinie powoduje przechodzenie jodu
do roztworu formaliny jest bardzo pomocna w opracowywaniu metodyki przygotowania
próbek tkanek tarczyc. Jak wiadomo formalina jest rutynowo używanym odczynnikiem
do
utrwalania
tkanek.
Do
laboratorium
dostarczono
zarówno
tkanki
mrożone
jak i umieszczone w formalinie. Próbkę od każdego pacjenta podzielono na dwie części
i jedną część umieszczono w formalinie, a drugą zamrożono w -250C. Tkanki patologiczne
oraz zdrowe były traktowane w sposób identyczny.
Opracowałam nową procedurę mineralizacji z udziałem mikrofal z użyciem roztworu
TMAH
i
wody
dejonizowanej,
trwającą
jedynie
16
minut
(do
tej
pory
w literaturze czas roztwarzania próbek materiałów biologicznych wynosił min 6 godzin
(Gamallo-Lorenzo i wsp., 2005). Była to najszybsza procedura przygotowywania tkanek
jeśli chodzi o oznaczenia zawartości jodu. Taka procedura oszczędza czas, pieniądze
oraz środowisko, bo ilość zużytych odczynników jest niewielka. Przeprowadziłam
walidację
metody
IC-PAD
i
uzyskałam
współczynnik
liniowości
0,9998
w zakresie 25 ng/ml do 10 µg/ml, LOD = 0,5 ng/ml, RSD = 2,15 %, średni odzysk wyniósł
95,1% po metodzie dodatku analitu do matrycy próbki. Niezawodność metody
17
sprawdzono stosując SRM - NIST 1549-non-fat milk powder wyznaczając współczynnik
zmienności równy 0,59%.
W badaniach po raz pierwszy stwierdziłam:
-
ośmiokrotnie
niższe
średnie
stężenie
jodu
w
tkankach
pacjentów
w porównaniu z grupą kontrolną;
- dobry odzysk dla procedury mineralizacji alkalicznej w stosunkowo krótkim czasie (jest
to jak dotąd najszybsza procedura mineralizacji przed oznaczaniem jodu);
- wykazałam, że procedura przechowywania (mrożenie względnie umieszczanie
w formalinie) tkanek nie miała istotnego wpływu na wynik oznaczania jodu za pomocą ICPAD, co znaczenie ułatwia realizację uzyskiwania materiału badawczego z sekcji zwłok
oraz operacji chirurgicznych, w czasie których formalina jest rutynowo używana jako
środek utrwalający tkanki narządów.
Wykazałam, że IC-PAD – jest szybką (tr=3,15 min), dokładną, precyzyjną i czułą
metodą oznaczania jonów jodkowych w tkankach. Detekcja jest specyficzna, ponieważ
w oznaczeniu jonów jodkowych nie przeszkadza zawartość innych jonów obecnych
w próbce. Jest to prosta metoda i może być stosowana również dla innych matryc
biologicznych.
Kontynuując wyżej opisaną problematykę, w 2013 roku zainicjowałam współpracę
z Kliniką Endokrynologii i Diabetologii Dziecięcego Szpitala Klinicznego w Lublinie
(obecnie Uniwersytecki Szpital Dziecięcy w Lublinie) dotyczącą badań metali oraz jodu
u pacjentów z zaburzeniami metabolicznymi, ze szczególnym zwróceniem uwagi
na problem otyłości.
Otyłość może być także postrzegana jako konsekwencja zdrowotna cukrzycy t2
(ryzyko rozwoju cukrzycy typu 2 wzrasta wraz ze wzrostem BMI). Jest to problem
globalny. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) szacuje, że 2,3 mld osób dorosłych
do końca 2015 r. miało nadwagę, z czego 700 mln było otyłych. Według danych polskich
z Projektu „Olaf” 2007 – 2010 przeprowadzonych przez Instytut „Pomnik - Centrum
Zdrowia Dziecka”, wynika, że 18,6% przebadanych chłopców i 14,5% dziewczynek
w przedziale wiekowym 7-18 lat cierpiało na nadwagę lub otyłość, a odsetek polskich
dzieci mających problem z nadmierną masą ciała wyniósł 20% (http://www.gis.gov.pl).
W [P-4] zastosowałam chromatografię jonową z detekcją spektrofotometryczną
do oznaczenia jonów metali w próbkach krwi pełnej, osocza oraz moczu dzieci otyłych
oraz zdrowych. Przeanalizowałam 243 próbki, które uprzednio zmineralizowałam według
opracowanych wcześniej przeze mnie procedur. Celem sprawdzenia jakości otrzymanych
danych chromatograficznych szczególnie dla pierwiastków występujących w bardzo
małych stężeniach w płynach fizjologicznych (np. Cd czy Ni) te same próbki zostały
18
zanalizowane na Wydziale Chemii Politechniki Warszawskiej w Katedrze Chemii
Analitycznej za pomocą ICP-MS. Porównanie wyników z w/w dwóch odmiennych technik
analitycznych nie wykazało większych odstępstw i dowodzi, że IC może być
uzupełnieniem, bądź samodzielną techniką w analizie próbek płynów ustrojowych.
Badania wykazały statystycznie istotne korelacje pomiędzy Mn i Cd, Ni i Co
oraz Cu i Co w osoczu zdrowych dzieci oraz Cd-Mn, Ni-Cu, Ni i Zn w osoczu zdrowych
dzieci. We krwi wykazano korelacje dla Fe i Cu u zdrowych dzieci, natomiast w moczu
dzieci otyłych analiza statystyczna wykazała wzajemne istotne zależności pomiędzy Fe
i Cd, Co i Mn. Kolejna bardziej szczegółowa analiza otrzymanych danych wykazała
statystycznie istotne korelacje pomiędzy zawartością metali a typem płynu ustrojowego.
U otyłych pacjentów wykazano wprost proporcjonalne zależności między Ni we krwi i Co
w osoczu, Ni we krwi i Ni w osoczu, Cu we krwi i Cu w moczu, Co w osoczu i Cu
w moczu, Mn w osoczu i Co w moczu, Fe w osoczu i Zn w moczu, Mn w osoczu i Ni
w moczu. Natomiast odwrotnie proporcjonalne zależności dotyczyły Co we krwi i Fe
w osoczu, Ni we krwi i Zn w osoczu, Zn we krwi i Cd w moczu, Zn w osoczu i Mn w
moczu. W grupie dzieci zdrowych wykazano również zależności pomiędzy zawartością
metalu a rodzajem płynu ustrojowego.
Stwierdziłam, że płeć nie wpływa na wzajemne korelacje pomiędzy metalami dopóki
rodzaj płynu biologicznego nie jest brany pod uwagę. U otyłych dzieci zawartość
Zn w osoczu chłopców była wyższa niż u dziewczynek, a w grupie dzieci zdrowych
zawartość Co i Mn we krwi oraz Mn w osoczu była wyższa dla chłopców w porównaniu
ze zdrowymi dziewczynkami. Natomiast zawartość Zn w moczu i krwi była wyższa
u dziewczynek. Dlatego też w kolejnych testach brano pod uwagę zarówno podział
na chorych i zdrowych oraz charakter płynu ustrojowego. Aby zidentyfikować pary płynów
biologicznych ze statystycznie różną zawartością metalu u otyłych i zdrowych dzieci,
wykonano test porównań Kruskala-Wallis’a, który wykazał dla większości metali różnice
we krwi-osoczu, osoczu-moczu oraz krwi-moczu, z wyjątkiem Cu w osoczu oraz krwi,
a także z wyjątkiem Mn w moczu i osoczu u otyłych pacjentów. Szczególnie istotną
korelację wykazano dla Zn oraz Ni w trzech rodzajach płynów ustrojowych.
Z korelacji BMI z oznaczanymi metalami wynikają następujące wnioski – BMI oraz
Zn we krwi, Cu w osoczu i Fe w moczu wykazują statystycznie istotne wzajemne
negatywne korelacje tylko u zdrowych chłopców. BMI negatywnie koreluje z Co w osoczu
zdrowych dziewczynek. Interesujące jest, że Co w osoczu chłopców był jedynym wśród
badanych metali, który pozytywnie korelował z BMI u otyłych chłopców.
Nowością w pracy jest określenie po raz pierwszy zawartości wielu pierwiastków
w trzech matrycach (krew, osocze, mocz) w odniesieniu do otyłości, a także zastosowanie
19
IC i ICP-MS do analizy trzech różnych typów próbek u tych samych pacjentów. Ponadto
po raz pierwszy w literaturze pokazano korelacje pomiędzy rodzajem analitu i rodzajem
matrycy próbki z uwzględnieniem płci w odniesieniu do dzieci otyłych i zdrowych.
Określenie zawartości pierwiastków w otyłości może mieć istotne znaczenie
dla prewencji tej choroby i leczenia. Zn spełnia istotną rolę w metabolizmie hormonów
odgrywających rolę w otyłości (Zn bierze udział w stabilizacji hexamerów insuliny
i magazynowania hormonu w trzustce, jest także antyoksydantem, kofaktorem licznych
enzymów biorących udział w metabolizmie węglowodanów, białek i tłuszczów, pełni
katalityczną i strukturalną rolę w tworzeniu tkanek i aktywacji receptorów hormonów).
Badania innych autorów sugerują, że niski poziom Zn w osoczu może być wskaźnikiem
metabolicznych zaburzeń w otyłości (Konukoglu i wsp., 2004). Moje badania potwierdzają
obniżony poziom Zn we krwi, osoczu i moczu dzieci otyłych.
Rezultaty moich badań wykazują niższe stężenie Cu we krwi, a wyższe w osoczu
dzieci otyłych w porównaniu ze zdrowymi dziećmi. Są to dane zgodne z danymi
otrzymanymi na populacji Japończyków (Hatano i wsp., 1982). Wynik ten, zważywszy na
rolę Cu w oksydacji lipoprotein może wskazywać, że zmiany w stężeniu Cu mogą być
spowodowane procesami metabolicznymi mającymi ścisły związek z otyłością (Cu może
działać jak antyutleniacz). Niższe stężenie Fe u otyłych pacjentów jest opisywane również
przez innych autorów (Pinhas-Hamiel i wsp., 2003), chociaż moje badania są pierwszymi,
które wykazują niedobory Fe w trzech rodzajach próbek pochodzących od otyłych dzieci.
Wykazałam także niższy poziom kobaltu u otyłych, którego niedobory mogą mieć wpływ
na metabolizm glukozy. Jeśli chodzi o Ni w świetle jego wykazanych przeze mnie korelacji
z cynkiem, wydaje się istotne określenie jego zawartości u otyłych pacjentów. Badania na
zwierzętach wykazały, że Ni wpływa na wydzielenie insuliny (Gupta i wsp., 2000) niestety
brakuje danych odnośnie otyłych ludzi, a jedyna praca autorstwa Tascilar i wsp. (2011)
dotyczy wyłącznie próbek osoczy.
Moja praca na temat zawartości wielu pierwiastków w wielu matrycach
u otyłych pacjentów i zdrowych dzieci jest nie tylko pierwszą w Polsce, ale również
stanowiła w 2013 roku unikalną pozycję literaturową na świecie w dziedzinie otyłości.
Ponadto
była
to
pierwsza
na
świecie
praca
ukazująca
korelacje
pomiędzy
BMI a Cd, Co, Ni i Mn u dzieci.
W równolegle prowadzonych badaniach opisanych w [P-5] wykorzystałam próbki
osoczy i moczu dzieci otyłych i zdrowych celem wyznaczenia w nich zawartości jodu
wcześniej stosowaną metodą IC-PAD. Dodatkowo sprawdziłam czy i jakie straty analitu
występują na etapach przechowywania i przygotowywania próbek tego rodzaju. Jod jak
wcześniej wykazałam jest trudnym analitem, którego zawartość w moczu wskazuje
20
na spożycie tego pierwiastka, a niedobory jodu w diecie skutkują patologią tarczycy.
U pacjentów z rakiem żołądka poziom jodu w tych płynach wskazywać może
na postępowanie choroby (Gulaboglu i wsp., 2006).
W pracy zajęłam się optymalizacją przygotowania próbek osocza i moczu. Oficjalne
Stowarzyszenie Chemików Analityków w USA (the Association of Official Analytical
Chemist (AOAC)) rekomenduje technikę ICP-MS z dwoma metodami roztwarzania
próbek. Pierwsza metoda (AOAC Official Method 2012.14) wymaga użycia kwasu
azotowego (V) w systemie zamkniętym z udziałem mikrofal. Aby zapobiec stratom analitu
zaleca
się
użycie
wodnego
roztworu
amoniaku
jako
dodatek
do
roztworu
pomineralizacyjnego. Maksymalny czas jaki powinien upłynąć do momentu oznaczenia
jodu nie powinien przekraczać wg tej procedury 8 godzin. Druga rekomendowana metoda
(AOAC Official Method 2012.15) wymaga użycia roztworu KOH w mieszaninie reakcyjnej
podczas mineralizacji w układzie otwartym. Konieczne jest wówczas jak najszybsze
zanalizowanie próbki, a czas jakiego zaleca się przestrzegać mieści się pomiędzy 4 a 8
godzin (Pacquette i wsp. 2013). Są to więc długotrwałe procedury.
Dokonałam
optymalizacji
parametrów mineralizacji
w układzie
zamkniętym
z użyciem energii mikrofal w odniesieniu do próbek osocza i moczu. Określiłam optymalny
czas, objętość i rodzaj odczynników (kwasowe i alkaliczne reagenty) używanych do
mineralizacji próbek.
Dodatkowo przy walidacji metody IC-PAD oszacowałam stabilność analitu
(stabilność długoterminowa i stabilność związana z rozmrażaniem i zamrażaniem próbek).
Parametry stabilności zostały oznaczone po raz pierwszy w literaturze odnośnie próbek
osoczy i moczu w kontekście zawartości w nich jodu. Ponadto nikt wcześniej nie
analizował próbek moczu i osocza pod kątem zawartości w nich jodu u dzieci otyłych.
Jak wiadomo z praktycznego i etycznego punktu widzenia, ilość próbki (np. osocze
krwi) potrzebna do przeprowadzenia analiz powinna być jak najmniejsza. Do procedury
przygotowawczej używałam każdorazowo tylko 0,1 ml osocza i moczu.
Jeśli chodzi o objętość kwasu azotowego (V) używanego do rozłożenia próbki,
to wykazałam, że najlepszy odzysk analitu otrzymuje się przy użyciu 0,5 ml 65% roztworu
HNO3 względnie 1 ml 25% wodnego roztworu TMAH, przy czym odzysk jest lepszy przy
użyciu warunków alkalicznych. Optymalny czas mineralizacji wyniósł 7 min. przy użyciu
0,5 ml 65 % roztworu HNO3 i 6 min przy użyciu 1 ml 25% wodnego roztworu TMAH.
Opracowałam następujące optymalne warunki przygotowania próbek osoczy przed
analizą IC-PAD, tzn. 0,1 ml osocza + 1ml 25% roztworu TMAH + 2 ml wody
dejonizowanej z czasem procedury nie przekraczającym 6 minut (98.8% odzysk).
21
Jeśli chodzi o mocz, to nie jest to tak obciążona matryca jak osocze, ale również
mając na uwadze trwałość detektora (przede wszystkim trwałość stosowanej elektrody
srebrowej i chlorosrebrowej) oraz kolumny chromatograficznej, należy przygotować
próbkę w sposób umożliwiający jej poprawną analizę. Do tego celu posłużyła metoda
z użyciem kolumienek RP, którą porównano z alkaliczną procedurą wcześniej
zoptymalizowaną dla osoczy.
Dokonałam porównania obu metod przygotowania próbek moczu i osocza
do oznaczenia jonów jodu za pomocą IC. Współczynnik korelacji obu metod
przygotowania moczu (R² = 0,989) był wyższy niż w przypadku metod użytych dla osoczy
(R² = 0,956).
Opracowana metoda oznaczania cechuje się bardzo dobrą liniowością (0,9998)
w zakresie 25 µg/l -10 µg/ml, niską wartością LOD= 0,5 µg/l, dobrą precyzją 2,15 % RSD,
średnim odzyskiem na poziomie 98,8% dla próbek osocza i 96,8% dla próbek moczu
(z użyciem certyfikowanych materiałów referencyjnych).
Badania stabilności analitu w tak niestabilnych matrycach jak osocze czy mocz są
wyzwaniem dla analityka. Moja publikacja opisywana powyżej jest pierwszą na temat
stabilności jodu w próbkach moczu i osocza przed analizą z użyciem IC. Wyznaczyłam
średni odzysk podczas trzykrotnego cyklu zamrażania i rozmrażania próbek obu
rodzajów, który wyniósł odpowiednio 98,0% dla próbek osocza i 96,5% dla próbek moczu.
Oszacowałam również długoterminową stabilność w przeciągu 24 tygodni (czas od
momentu otrzymania zamrożonych próbek do chwili przeprowadzenia ich ostatniej analizy
wyniósł 20 tygodni). Zaobserwowałam spadek stężenia jodu o 3,8% po ok. 18 tygodniach
od momentu rozpoczęcia badań z próbkami osocza (po 24 tygodniach spadek wynosił
10,9%). Próbki moczu traciły szybciej i więcej jodu – średnio pomiędzy 14 a 15 tyg.
(spadek
ok.
5%).
Po 24
tyg. strata
analitu wyniosła 14,7%
w porównaniu
z próbkami wzorcowymi.
Porównując IC z innymi metodami służącymi do oznaczania jodu w próbkach
biologicznych opisywanych w literaturze stwierdziłam, że dzięki IC otrzymuje się lepszy
odzysk (98,8%) w porównaniu z metodą SEC (Size Exclusion Chromatography)
(75%) (Michalke i wsp., 1996) i podobny jak w spektroskopii emisji optycznej
ze wzbudzeniem w plazmie indukcyjnie sprzężonej (ICP-OES) (91,3-99,7%) (Braselton
i wsp., 1997). Zastosowana przeze mnie metoda wykazuje się większym zakresem
liniowości niż ICP-MS próbek moczu (Haldimann i wsp., 1998).
Ponadto badania wykazały, że osocze podobnie jak mocz może być użyte
do monitorowania spożycia jodu u otyłych dzieci, którego poziom w otyłości jest znacząco
obniżony (zarówno w osoczu jak i w moczu).
22
Podsumowując - w swojej pracy ([P-5]):
- oznaczyłam zawartość jodu w moczu i osoczu dzieci zdrowych i otyłych
za pomocą zoptymalizowanej i zwalidowanej metody IC-PAD;
- przeprowadziłam optymalizację przygotowania próbek moczu i osocza do analizy
IC-PAD;
- określiłam długoterminową stabilność analitu w moczu i osoczu oraz stabilność podczas
powtarzanych cykli mrożenia i rozmrażania obu rodzajów próbek;
- wykazałam przydatność badań osocza i moczu na zawartość jodu w problemie otyłości
dzieci.
Zakres zastosowań chromatografii jonowej z detekcją PAD poszerzyłam o próbki
moczu dzieci z autyzmem podczas realizacji projektu badawczego, który zainicjowałam,
i którym kieruję od 2014 r. Projekt zatytułowany "Zastosowanie technik IC oraz ICP-MS do
badania korelacji pomiędzy poziomem pierwiastków u dzieci a stopniem nasilenia
i objawami autyzmu” był realizowany we współpracy z Kliniką Psychiatrii, Psychoterapii
i Wczesnej Interwencji SPSK 1 w Lublinie.
Opublikowane niedawno wyniki są pierwszymi dotyczącymi zawartości jodu
u dzieci autystycznych w Polsce [P-7]. Jest to również jeden z nielicznych na świecie
projektów zajmujących się problematyką jodu w autyzmie oraz pokazującym związek
zawartości jodu w organizmie dzieci a stopniem nasilenia objawów autyzmu.
Autyzm to zaburzenie rozwojowe, zaczynające się we wczesnym dzieciństwie
i trwające całe życie. Zaburzenia ze spektrum autyzmu (Autism Spectrum Disorders,
ASD) to obecnie najczęściej występujące całościowe zaburzenia neurorozwojowe.
Według danych z USA 1 dziecko na 68 cierpi na to zaburzenie (Baio, 2014).
Skala występowania zaburzeń ze spektrum autyzmu w Polsce jest trudna
do oszacowania. W naszym kraju aż do roku 2010 osoby dotknięte autyzmem
otrzymywały w orzecznictwie o niepełnosprawności kod choroby wspólny z innymi
zaburzeniami neurologicznymi lub psychicznymi. W Polsce jak dotąd nie przeprowadzono
szerokich badań epidemiologicznych dotyczących występowania ASD, dane ze źródeł
Fundacji
SYNAPSIS,
zajmującej
się
problematyką
autyzmu
w
Polsce
(http://synapsis.org.pl) sugerują, że w Polsce na autyzm może cierpieć około
30 000 – 50 000 osób.
Etiologia autyzmu nie jest wystarczająco poznana. Specjaliści kładą obecnie nacisk
na wieloczynnikowe przyczyny w oparciu o badania zaburzonego funkcjonowania mózgu,
na które mają wpływ zarówno predyspozycje genetyczne jak i szeroki wachlarz czynników
środowiskowych. Diagnoza tego zaburzenia opiera się wyłącznie na obserwacji
zachowania dziecka, gdyż jak dotąd nie istnieją żadne wiarygodne biomarkery autyzmu.
23
Często zaburzenie pozostaje niezdiagnozowane przez długi okres, ponieważ zaburzenia
współwystępujące z autyzmem niekiedy mogą przysłaniać skomplikowany obraz
spektrum autyzmu.
Pomysł badania zawartości jodu w odniesieniu do autyzmu jest uzasadniony,
ponieważ wiadomo jest, że niedobory hormonów tarczycy w okresie niemowlęcym
prowadzą do nieodwracalnych zmian w mózgu. Ponadto badania na zwierzętach
wykazały, że deficyty hormonów tarczycy u matek mogą spowodować obniżenie hormonu
trójjodotyroniny (T3) u płodu. Jeśli wystąpią chociażby krótkotrwałe wahania hormonalne
u matek w 8-12 tyg. ciąży, a więc w czasie migracji komórek nerwowych, może to
spowodować zmiany w korze mózgowej potomstwa, a w konsekwencji doprowadzić do
autyzmu (Román, 2007).
Chociaż obecnie Polska jest krajem z prawidłową podażą jodu na poziomie
populacyjnym (Szybiński, 2007, 2009), to fakt ten nie wyklucza istotnych wahań jego
poziomu u jednostek, w szczególności cierpiących na nie do końca poznane zaburzenie
jakim jest autyzm.
Badania jakie zainicjowałam na uczelni są pierwszymi w Polsce badaniami poziomu
jodu u dzieci z autyzmem.
Dodatkowo poszukiwałam związku pomiędzy poziomami hormonów tarczycy
i poziomem jodu w moczu a nasileniem objawów autyzmu wyrażonym wynikami skali
CARS (Childhood Autism Rating Scale - E. Schoplera, R. Reichlera, B. Renner (Schopler
i wsp., 1988)) używanej przez klinicystów jako narzędzie pomocne w diagnostyce
zaburzenia.
Z uwagi na różny stopień nasilenia objawów i bardzo złożony charakter tego
zaburzenia do badań na zawartość jodu w moczu zakwalifikowano wyselekcjonowaną
40-osobową grupę chłopców z autyzmem o ciężkim przebiegu. Kryteria przyjęcia do
badań wymagały między innymi zamieszkiwania w tym samym regionie co dzieci zdrowe
(środowisko zewnętrzne silnie wpływa na poziom jodu w organizmie), dieta bez
ograniczeń (bezglutenowa oraz bezkazeinowa, wegetarianizm był podstawą odrzucenia
z testów), dzieci nie mające stanów zapalnych, chorób tarczycy, innych neurologicznych
i psychiatrycznych zaburzeń, bez stosowania farmakologii, suplementów diety, witamin
i preparatów zawierających jod.
Do określenia stopnia autyzmu wykorzystano skalę CARS opartą na 15 obszarach
oceniających funkcjonowanie dziecka na podstawie interakcji i obserwacji. W zależności
od nasilenia objawów każdy obszar jest oceniany przez lekarza w skali od 1 do 4
(4 – to zachowanie najbardziej odbiegające od neurotypowego). Całkowity wynik testów
24
mieści się w przedziale od 15-60 punktów (37-60 określa tzw. głęboki autyzm). Wszystkie
dzieci z grupy jaką przebadano w pracy miały głęboki autyzm.
Próbki zebranego od dzieci moczu zostały zamrożone, a następnie poddane
alkalicznej mineralizacji z udziałem mikrofal wykorzystując uprzednio zoptymalizowaną
procedurę przygotowania próbek moczu oraz walidowaną metodę IC-PAD.
Wykazałam
po
raz
pierwszy,
że
pomimo,
iż
parametry
biochemiczne
funkcjonowania tarczycy (hormony: TSH, fT3, fT4) mieściły się w odpowiednich
do wieku pacjentów normach, to poziom jodu u dzieci autystycznych był istotnie
zmniejszony, a poziom jodu w moczu korelował z niektórymi obszarami ze skali CARS dla
konkretnych grup wiekowych dzieci.
Badania wykazały, że u chłopców dojrzewających (grupa wiekowa 11-17 lat) poziom
jodu w moczu negatywnie korelował z tzw. ogólnym końcowym wrażeniem klinicysty,
opisanym jako CARS 15. Wynik ten może sugerować, że równowaga metaboliczna jodu
w organizmie jest u takich pacjentów zaburzona, co objawia się w charakterze zaburzeń
autystycznych.
Z analizy krzywej ROC (Receiver Operating Characteristic) wynika, że wśród
parametrów mierzonych w badaniu, tj. poziomu jodurii wraz z hormonami tarczycy,
to właśnie poziom jodu w moczu jest parametrem najbardziej czułym i specyficznym
(AUC=0,94).
Dokonałam również podziału grupy pacjentów według kryteriów epidemiologicznych
Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) wyróżniających poziomy jodu, które świadczą
o ciężkim niedoborze jodu (stężenie jodu w moczu poniżej 20 µg/l ), średnim niedoborze
(stężenie jodu pomiędzy 20 a 49 µg/l), łagodnym niedoborze (stężenie jodu pomiędzy 50
a 99 µg/l) oraz optymalnym poziomie jodu (gdy stężenie jodu wynosi między 100 a 199
µg/l). Wśród badanej grupy dzieci z autyzmem 19 na 40 chłopców spełniało kryteria
łagodnego do średniego niedoboru, pozostali mieli wystarczający poziom jodu według
kryteriów przyjętych przez WHO. Poziomy hormonów tarczycy (fT3 i fT4) u tych dzieci
pozytywnie korelowały z adaptacją do zmian w środowisku. Trudności w przyjmowaniu
zmian w ustalonej rutynie i schematach zwiększały się ze wzrostem poziomów tychże
hormonów (CARS 6) i oceną sposobu patrzenia dziecka na ludzi i przedmioty (CARS 7).
Zastosowana w pracy metoda regresji krokowej ujawniła statystycznie istotne
rezultaty dla sześciu kryteriów autyzmu ze skali CARS (wartość poprawionego
współczynnika determinacji R2=0,36). Istotne pozytywne korelacje zawartości jodu
w moczu wykazane zostały dla przystosowania do zmian, poziomu aktywności ruchowej
oraz poziomu i harmonijności rozwoju intelektualnego. Natomiast istotne negatywne
korelacje wykazano dla trudności w zmianie nastroju, uleganiu wielu różnym emocjom
25
w krótkim czasie, sposobem posługiwania się zmysłami smaku, węchu i dotyku oraz
komunikacją werbalną a poziomem jodu w moczu.
Poziom intelektualny dzieci jest silnie związany z poziomem jodu, a jego niedobory
objawiają się u dzieci autystycznych szczególnymi problemami w funkcjonowaniu.
Interesujący jest fakt, że dzieci z autyzmem uczestniczące w badaniu nie miały
zdiagnozowanych chorób tarczycy, a poziom jodu w całej grupie był istotnie niższy
niż u zdrowych rówieśników pacjentów. Może to sugerować zaburzenia fizjologiczne
u dzieci autystycznych, które nie są wykazywane w poziomach hormonów tarczycy.
Jak wiadomo - nie wszystkie ścieżki metabolizmu jodu są dokładnie poznane, a jod
uczestniczy nie tylko w produkcji hormonów tarczycy. Około 50 do 80% jodu w ludzkim
ciele jest gromadzone na zewnątrz tarczycy, a rezerwuarem tego pierwiastka są jelito
oraz mózg (Venturi i Begin, 2010). Niestety tzw. „niehormonalna” rola jodu jest mniej
znana. Ten wątek badawczy będzie przeze mnie kontynuowany we współpracy
z Neurocentrum Uniwersytetu w Ulm (Niemcy).
Od lat wielu naukowców bada zaburzenia we wchłanianiu składników pokarmowych
u dzieci autystycznych (Horvath i wsp., 1999; Molloy i wsp., 2003; Krajmalnik-Brown
i wsp.,2015). Badania z ostatnich lat
sugerują istotne problemy z wchłanianiem
minerałów (Adams i wsp., 2011; Yasuda i Tsutsui, 2013). Zakładając interakcje jodu
z innymi pierwiastkami, można spekulować, że problem być może dotyczy wchłaniania
składników z pożywienia, choć na chwilę obecną brakuje dostatecznych dowodów na
poparcie tej tezy.
Projekt, który opracowałam dotyczący badania poziomu pierwiastków (w tym jodu)
w autyzmie za pomocą chromatografii jonowej, uzyskał zgodę Komisji Bioetycznej.
Badania niehormonalnej roli jodu oraz jego integracje z innymi pierwiastkami zasługują
na kontynuowanie. Opracowany przez mnie projekt współpracy z Neurocentrum
Uniwersytetu w Ulm
(Niemcy), pomoże wyjaśnić mechanizmy prowadzące do
dyshomeostazy pierwiastkowej i potwierdzić behawioralne konsekwencje niedoboru
pierwiastków u pacjentów z autyzmem. Dodatkowo prowadzone badania na zwierzętach
pozwolą na szczegółowe przebadanie wpływu suplementacji oraz diety na zmiany
w zachowaniu charakterystyczne dla omawianego zaburzenia.
Podsumowując w w/w pracy po raz pierwszy:
- zastosowałam IC do badań poziomu jodu w moczu w kontekście zaburzenia
ze spektrum autyzmu;
- wykazałam istotne korelacje pomiędzy zawartością jodu w moczu oraz poziomem
hormonów tarczycy a nasileniem objawów ze skali oceny autyzmu CARS;
26
- wykazałam istotnie zmniejszony poziom jodu w moczu u dzieci z autyzmem
w stosunku do dzieci zdrowych (pierwsze tego typu badanie z udziałem polskich dzieci);
- wskazałam na niehormonalną rolę jodu w organizmie jako potencjalną przyczynę
obniżonego poziomu jodu w moczu (choć fakt ten musi być jeszcze potwierdzony
w kolejnych etapach podjętych badań).
Przedstawione
powyżej
wyniki
badań,
opisanych
w pracach
zgłoszonych
do postępowania habilitacyjnego świadczą o możliwościach stosowania chromatografii
jonowej do badań próbek klinicznych. Większość zastosowań IC opisywanych
w literaturze dotyczy próbek środowiskowych, jednakże ostatnio coraz więcej doniesień
pojawia się odnośnie zastosowaniach tej techniki do analizy innych typów próbek.
IC z uwagi na liczne zalety stanowi technikę, która może być uzupełnieniem innych
technik analitycznych w oznaczaniu jonów, a w wielu przypadkach, które opisuję
w pracach jest narzędziem wystarczającym do oszacowania zawartości jonów w próbkach
płynów ustrojowych i tkanek. Moje badania wypełniają lukę istniejącą w dziedzinie analizy
próbek klinicznych pod kątem zawartości pierwiastków w aspekcie chorób i zaburzeń
o złożonej etiologii.
Rezultaty badań będą w przyszłości stanowiły podstawę
do szczegółowej analizy czy i w jakim stopniu dieta oraz suplementacja pierwiastkami,
których niedobór wykazano wpłynie na zmniejszenie objawów chorobowych.
d) podsumowanie głównych osiągnięć prac włączonych do cyklu habilitacyjnego, noszące
znamiona nowości naukowej
W pracy [P-1]:

wykazałam jakie optymalne warunki są niezbędne do całkowitego przekształcenia
matrycy próbek osocza w celu oznaczenia zawartości jonów metali za pomocą IC

wykazałam, że metoda IC cechuje się dobrą liniowością, niską granicą wykrywalności,
wysoką powtarzalnością i dokładnością oraz uzyskiwaniem wysokich odzysków

metoda IC pozwoliła na potwierdzenie wyższego stężenia miedzi u pacjentów
z cukrzycą; dodatkowo wykazałam, że diabetycy z nadciśnieniem mają wyższe
stężenie miedzi w osoczu w porównaniu ze zdrowymi oraz diabetykami bez
nadciśnienia
W pracy [P-2]:

wykazałam, że jakie optymalne warunki pracy mineralizatora pozwalają na
przekształcenie tkanek tarczyc w matrycę, która może być dozowana na kolumnę
chromatograficzną celem oznaczania w tkankach zawartości jonów metali
27

po raz pierwszy zastosowałam IC do badań tkanek tarczyc (ponadto były to próbki
pochodzące od ludzi, a nie zwierząt)

wykazałam, że wyniki zawartości żelaza, cynku i miedzi w tkankach zdrowych tarczyc
są zgodne z literaturowymi wynikami uzyskanymi za pomocą innych technik
analitycznych (NAA, ICP-MS)

wykazałam, że niższa zawartość miedzi, żelaza, manganu i cynku dotyczy próbek
pochodzących od pacjentów z wolem guzkowym tarczycy w porównaniu ze zdrowymi
tkankami
W pracy [P-3]:

opracowałam po raz pierwszy metodykę badań zawartości jodu w tkankach ludzkich
tarczyc, tj. opracowałam najszybszą ówcześnie procedurę mineralizacji alkalicznej
z udziałem energii mikrofal oraz przeprowadziłam walidację IC-PAD dla tkanek tarczyc

wykazałam, że przechowywanie tkanek tarczyc w formalinie, bądź ich mrożenie nie
ma istotnego wpływu na wynik oznaczenia jodu metodą IC-PAD

wykazałam ośmiokrotnie niższą zawartość jodu w tkankach zmienionych patologicznie
w porównaniu z tkankami zdrowymi
W pracy [P-4]:

wykazałam, że rezultaty jakie otrzymałam stosując IC-UV/Vis do analizy płynów
ustrojowych pod kątem zawartości w nich wybranych metali nie odbiegają od wyników
uzyskanych z użyciem ICP-MS (po raz pierwszy te dwie techniki użyto równocześnie
do analizy próbek pacjentów z otyłością)

wykonałam pierwsze w Polsce badania związku otyłości dzieci z zawartością wielu
pierwiastków w kilku matrycach pochodzących od tych samych pacjentów

wykazałam statystycznie istotne wzajemne korelacje pomiędzy badanymi metalami
w trzech rodzajach matryc (mocz, krew, osocze)- po raz pierwszy w problemie otyłości

wykazałam korelacje zawartości poszczególnych metali odnośnie płci otyłych
i zdrowych dzieci

po raz pierwszy wykazałam korelacje pomiędzy BMI a kadmem, kobaltem, niklem
i manganem u otyłych i zdrowych dzieci
W pracy [P-5]:

dokonałam optymalizacji parametrów mineralizacji dla próbek osocza oraz moczu pod
kątem metodyki oznaczania jodu IC-PAD (przeprowadziłam dwa typy mineralizacji dla
każdego rodzaju próbek: kwasową i alkaliczną, a z ich porównania określiłam
optymalną metodę mineralizacji.

zwalidowałam
metodykę
IC-PAD
z
referencyjnych
28
użyciem
certyfikowanych
materiałów

po raz pierwszy zbadałam stabilność długoterminową dla próbek moczu i osocza oraz
stabilność podczas trzykrotnych cykli mrożenia i rozmrażania analizowanych płynów
ustrojowych przed oznaczeniem jodu z użyciem IC-PAD

wykazałam lepszy odzysk i większy zakres liniowości IC w porównaniu z niektórymi
innymi technikami analizującymi próbki moczu pod kątem zawartości jodu

wykazałam obniżony poziom jodu w osoczu i moczu u otyłych dzieci
W pracy [P-6]:

zwróciłam uwagę na problemy dotyczące analizy próbek klinicznych z udziałem IC,
problemy związane z przygotowaniem próbek, dokonałam przeglądu metod
analitycznych stosowanych do analizy próbek klinicznych oraz przedstawiłam IC
w świetle innych technik oznaczania pierwiastków i jonów, zwróciłam uwagę na
problematykę specjacji jonów oraz na czynniki wpływające na końcowy wynik
oznaczania oraz na interpretację uzyskanych wyników

praca zawiera nieopublikowane wyniki dotyczące badań własnych nad wpływem
różnych sposobów przygotowywania próbek osoczy krwi na wynik końcowy analizy
W pracy [P-7]:

przeprowadziłam pierwsze w Polsce badania zawartości jodu u pacjentów
z autyzmem

wykorzystałam po raz pierwszy technikę IC-PAD oraz zoptymalizowane metody
przygotowania próbek do oznaczenia jodu w moczu u dzieci autystycznych oraz ich
zdrowych rówieśników

wykazałam istotne korelacje pomiędzy poziomem hormonów tarczycy, poziomem jodu
w moczu u dzieci z autyzmem oraz zdrowych

wykazałam statystycznie istotnie niższą zawartość jodu w moczu pacjentów z ciężkim
autyzmem

zwróciłam po raz pierwszy uwagę na potencjalną „niehormonalną” rolę jodu
w opisywanym zaburzeniu

wskazałam na behawioralne konsekwencje niedoboru jodu u dzieci z autyzmem,
szczególnie wyraźne dla grupy dzieci w okresie dojrzewania
W pracy [R-1]:

dokonałam przeglądu metod spektrofotometrycznych i chromatograficznych oraz
procedur przygotowania próbek o różnych matrycach stosowanych w oznaczaniu jodu
ze szczególnym zwróceniem uwagi na problemy analizy próbek klinicznych
29
W pracy [R-2]:

szczegółowo opisałam zasady oznaczania jodu za pomocą chromatografii jonowej
z różnymi wariantami detekcji, nowoczesne fazy stacjonarne wraz z parametrami
chromatograficznymi, zastosowanie IC dla różnego typu próbek

zwróciłam uwagę na nowoczesne rozwiązania aparaturowe i analityczne w analizie
specjacyjnej organicznych i nieorganicznych form jodu

podkreśliłam ważność tzw. czynników przed-analitycznych (przechowywanie próbek,
problemy stabilności analitu, rodzaje procedur przygotowania próbek) w końcowej
interpretacji wyników

opisałam obecne trendy i kierunki rozwoju chromatografii jonowej w oznaczaniu jodu
Piśmiennictwo
1. Adams JB, Audhya T, McDonough-Means S, et al. Effect of a vitamin/mineral supplement on children
and adults with autism. BMC Pediatrics. 2011;11:111. doi:10.1186/1471-2431-11-111.
2. Ashby SL, King LJ, Parke DVW. Effect of acute administration of cadmium on the disposition of copper,
zinc, and iron in the rat. Environ. Res.1980; 21, 177- 185.
3. Baio J. Surveillance Summaries MMWR/March 28, 2014/Vol. 63/No. 2 , 2014 Prevalence of Autism
Spectrum Disorder Among Children Aged 8 Years — Autism and Developmental Disabilities Monitoring
Network, 11 Sites, United States, 2010.
4. Błażewicz A, Selected problems on ion chromatography determinations of trace elements in clinical
samples. Curr. Chromatogr. 2014; 1; 2-14.
5. Błażewicz A, Use of ion chromatography in clinicalanalysis W: Postępy chromatografii jonowej:
praca zbiorowa. Pod red. Rajmunda Michalskiego. Zabrze 2014, Instytut Podstaw Inżynierii Środowiska
PAN, s. 256-264, bibliogr. poz. 37, 978-83-60877-01-2.
6. Braselton WE, Stuart KJ, Kruger JM.
Measurement of serum iohexol by determination of iodine
with inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy. Clin. Chem. 43 (1997) 1429-35.
7. Bremner I, Campbell JK. Effect of copper and zinc status on susceptibility to cadmium intoxication.
EnvironHealthPerspect. 1978; 25, 125–128.
8. Centeno, J. A., Todorov, T. I., van der Voet, G. B. and Mullick, F. G. (2012) Metal Toxicology in Clinical,
Forensic, and Chemical Pathology, in Analytical Techniques for Clinical Chemistry: Methods and
Applications (eds S. Caroli and G. Záray), John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA.
doi: 10.1002/9781118271858.ch6
9. Chmielnicka J, Halatek T, Jedlinska U. Correlation of cadmium-induced nephropathy and the metabolism
of endogenous copper and zinc in rats. Ecotoxicol. Environ. Sat, 1989; 18, 268-276.
10. Epidemiologia
nadwagi
i
http://www.forumfarmaceutyczne.
otyłości
wśród
dzieci
i
młodzieży
w
Polsce,
2012,
pl/index.php/component/content/article/39-news/1344-epidemiologia-
nadwagi-iotyoci-wrod-dzieci-i-modziey-w-polsce.
11. Fox MRS, Tao SH, Stone ChL, Fry BEF. Effects of zinc, iron and copperdeficiencies on cadmium in
tissues of Japanesequail. Env. Health Persp.,1984; 54, 57–65.
30
12. Gamallo-Lorenzo D, Barciela-Alonso MC, Moreda-Pineiro A, Bermejo-Barrera A, Bermejo-Barrera P.
Microwave-assisted alkaline digestion combined with microwave-assisted distillation for the determination
of iodide and total iodine in edible seaweed by catalytic spectrophotometry.
Analitica Chimica Acta 2005; 542: 287-295.
13. Geldmacher-von Mallinckrodt M, Meissner D. General aspects of the role of metals in clinical chemistry.
In: Seiler HG, Sigel H, editors. Handbook on metals in clinical and analytical chemistry. New York: MarcelDekker Inc.; 1994. p. 14–27 ,Chapter 2.
14. Goyer RA. Toxic end essential metal-metal interactions. Ann. Rev. Nutriton 1997; 17, 37-50.
15. Guidotti TL, McNamara J, Moses MS. Interpretation of the trace element analysis profile in body fluids.
Indian J. Med. Res. 2008;128, 524-532.
16. Gulaboglu M, Yildiz L, Gul M, Celebi F, Peker K. Blood and urine iodine levels in patients with gastric
cancer. Biol. Trace Elem. Res. 113 (2006) 261-71.
17. Gupta S, Ahmad N, HusainMM, Srivastava RC. Involvement of nitric oxide in nickel-induced
hyperglycemia in rats. Nitric Oxide 2000; 4:129–138.
18. Haddad PR, Jackson PE. Ion Chromatography, First Edition: Principles and Applications. (Journal of
Chromatography Library), ELSEVIER, 1990.
19. Haldimann M, Zimmerli B, Als C, Gerber H. Direct determination of urinary iodine by inductively coupled
plasma mass spectrometry using isotope dilution with iodine-129. Clin. Chem. 1998; 44 817- 824.
20. Hatano S, Nishi Y, Usui T. Copper levels in plasma and erythrocytes in healthy Japanese children and
adults. Am J Clin Nutr 1982; 35(1):120–126.
21. Horvath K, Papadimitriou JC, Rabsztyn A, Drachenberg C, Tildon JT.Gastrointestinal abnormalities in
children with autistic disorder. J Pediatr. 1999 Nov;135(5):559-63.
22. Iyengar GV, Kollmer WE, Bowen HJM. The Elemental Composition of Human Tissues and Body Fluids;
Verlag Chemie: Weinheim, FRG, 1978.
23. Jastrzębska H. Wole obojętne. Nowa Klinika 1999, 823-825.
24. Khalid Siddiqui, Nahla Bawazeer, and Salini Scaria Joy, “Variation in Macro and Trace Elements
in Progression of Type 2 Diabetes,” The Scientific World Journal, vol. 2014, Article ID 461591, 9 pages,
2014.
25. Kirov G, Tredget J, John R, et al. A cross-sectional and a prospective study of thyroid disorders
in lithium-treated patients. J Affect Dis 2005; 87: 313-317.
26. Knapp G, Maichin B, Fecher P, Hasse S, Schramel P. Iodine determination in biological
samples. Fresenius J Anal Chem, 1998; 362: 508-513.
27. Knudsen N, Laurberg P, Perrild H, Bulow I, Ovesen L & Jørgensen T. Risk factors for goiter and thyroid
nodules' Thyroid 2002; 12: 10: 879-888.
28. Konukoglu D, Turhan MS, Ercan M, Serin O. Relationship between plasma leptin and zinc levels and the
effect of insulin and oxidative stress on leptin levels in obese diabetic patients.
J Nutr Biochem 2004; 15 (12): 757–760.
29. Krajmalnik-Brown R, Lozupone C, Kang D-W, Adams JB. Gut bacteria in children with autism spectrum
disorders: challenges and promise of studying how a complex community influences a complex disease
Microbial Ecology in Health & Disease 2015, 26: 26914.
30. Kruse-Jarres JD, Rükgauer M.Trace elements in diabetes mellitus. Peculiarities and clinical validity
of determinations in blood cells. J Trace Elem Med Biol. 2000; 14(1): 21-7.
31
31. Lopez Alonso M, Montaña FP, Miranda M, Castillo C, Hern´andez J, Benedito JL. Interactions between
toxic (As, Cd, Hg and Pb) and nutritional essential (Ca, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Zn) elements in
the tissues of cattle from NW Spain. BioMetals, 2004; 17: 389–397.
32. Molloy CA, Manning-Courtney P. Prevalence of chronic gastrointestinal symptoms in children with autism
and autistic spectrum disorders. Autism. 2003 Jun;7(2):165-71.
33. Mayer DA, Kosmus W, Pogglitsch H, Mayer D, Beyer W. Essential trace elements in humans.
Biol. Trace Elem. Res., 1993; 37, 27-38.
34. Michalke B, Schramel P, Hasse S. Determination Of Free Iodide In Human Serum - Separation From
Other I-Species And Quantification In Serum Pools And Individual-Samples, Mikrochim acta, 1996; 122:
67-76.
35. Michalski R. Chromatografia jonowa. Podstawy i zastosowania. SWSZ Katowice, 2011, str.1-220, ISBN
978-83-88789-42-7, str.1-198.
36. Michalski R. Ion Chromatography Determination of Bromate - State of the Art, Trends in Chromatography,
5, 2009, 27-46.
37. Mortensen JD, Woolner LB, Bennett WA. Gross and microscopic findings in clinically normal thyroid
glands. J Clin Endocrinol Metab. 1995; 15: 1270–1280.
38. Nielsen FH. New essential trace elements for the life sciences. Biol. Trace Elem. Res., 1990; 26-27, 599611.
39. Pacquette LH, Levenson AM, Thompson JJ. Total iodine in infant formula and nutritional products
by inductively coupled plasma/mass spectrometry: First Action 2012.14. J. AOAC Int. 2013;96:798 -801.
40. Pinhas-Hamiel O, Newfield RS, Koren I, Agmon A, Lilos P, Phillip M. Greater prevalence of iron deficiency
in overweight and obese children and adolescents. Int J Obes (Lond) 2003; 27(3): 416–418.
41. Román GC. Autism: Transient in utero hypothyroxinemia related to maternal flavonoid ingestion during
pregnancy and to other environmental antithyroid agents, J Neurological Sciences 2007; 262:15-26.
42. Saltzman BE, Gross SB, Yeager DW, Meiners BG, Gartside PS. Total body burdens and tissue
concentrations of lead, cadmium, copper, zinc, and ash in 55 human cadavers. Env. Res. 1990; 52: 12645.
43. Schopler E, Reichler RJ, & Rochen Renner B. (1988). The childhood autism rating scale (CARS).
Los Angeles, CA: Western Psychological Services.
44. Szybiński Z, Jarosz M, Hubalewska-Dydejczyk A et al. Iodine-deficiency prophylaxis and the restriction of
salt consumption — a 21st century challenge. Pol J Endocrinol 2010; 61: 135–140.
45. Szybiński Z, Sytuacja profilaktyki jodowej w Polsce w świetle ostatnich rekomendacji WHO dotyczących
ograniczenia spożycia soli. Pediatric Endocrinology, Diabetology and Metabolism 2009, 15, 2, 103-107.
46. Tascilar ME, Ozgen IT, Abaci A, Serdar M, Aykut O. Trace elements in obese Turkish children.
Biol Trace Elem Res 2011; 143: 188–195.
47. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, Agency of Toxic Substances
and Disease Registry, Toxicological Profile for Iodine, Chapter 7 (2004) p. 284.
48. Venturi S, Bégin ME. Thyroid Hormone, Iodine and Human Brain Evolution. In: Cunnane S, Stewart K,
Eds. Human Brain Evolution, The Influence of Freshwater and Marine Food Resources. Wiley- Blackwell,
NJ, 2010, 105-19.
49. Volzke H, Ludemann J, Robinson DM, Spieker KW, Schwahn C, Kramer A, John U & Meng W. The
prevalence of undiagnosed thyroid disorders in a previously iodine-deficient area. Thyroid 2003 13 803–
810.
32
50. Walter RM, Uriu-Hare JH, Olin KL, Oster MH, Anawalt BD, Critchfield JW, et al. Copper, zinc, manganese,
and magnesium status and complications of diabetes mellitus. Diabetes Care 1991; 14: 1050–6.
51. Weiss J. Handbook of Ion Chromatography, 2 vols., Wiley, 2004.
52. Wingate M et al. Prevalence of autism spectrum disorders--Autism and Developmental Disabilities
Monitoring Network, 14 sites, United States, 2008.; Centers for Disease Control and Prevention. MMWR
Surveill Summ. 2012; 61(3): 1-19.
53. Yaman M. Comprehensive comparison of trace metal concentrations in cancerous and non-cancerous
human tissues. Curr. Med. Chem. 13 (2006) 2513-25.
54. Yasuda H, Tsutsui T. Assessment of infantile mineral imbalances in autism spectrum disorders (ASDs). Int
J Environ Res Public Health. 2013 Nov 11;10(11):6027-43.
55. Yoo YC, Lee SK, Yang JY, Kim KW, Lee SY, Oh SM, Chung KH. Interrelationship between the
concentration of toxic and essential elements in Korean tissues, J. HealthSci., 2002; 48, 195-200.
56. Zaichick VYe, Tsyb AF, Vtyurin BM. Trace elements and thyroid cancer. Analyst. 1995 Mar; 120(3): 81721.
57. Zheng Y, Li X-K, Wang Y, Cai L. The role of zinc, copper and iron in the pathogenesis of diabetes and
diabetic complications: therapeutic effects by chelators. Hemoglobin 2008; 32(1–2): 135–45.
5. OMÓWIENIE POZOSTAŁYCH OSIĄGNIĘĆ NAUKOWO-BADAWCZYCH
a) pozostałe osiągnięcia naukowo-badawcze przed uzyskaniem stopnia doktora
Przed uzyskaniem stopnia doktora nauk farmaceutycznych opublikowałam 8 prac,
w tym 4 prace oryginalne (łączny IF= 4,924), 3 rozdziały w podręczniku dla studentów
oraz 1 pracę popularno-naukową. Liczba punktów MNiSW/KBN wyniosła 45. Podczas
zjazdów polskich i międzynarodowych zaprezentowałam 11 doniesień.
Początki mojej pracy naukowej były związane z zespołem prof. dr hab. Władysława
Gołkiewicza, pod którego nadzorem wykonywałam badania dotyczące rozdzielań
z użyciem chromatografii cienkowarstwowej (TLC) oraz wysokosprawnej chromatografii
cieczowej (HPLC) w normalnym i odwróconym układzie faz. Prace dotyczące rozdzielania
alkaloidów z korzenia Chelidonium majus L. (glistnik jaskółcze ziele) z użyciem
mikropreparatywnej
chromatografii
w
czasopiśmie
z
na
międzynarodowym
IF=0,555
(MNiSW/KBN=8)
sympozjum.
zaowocowały
cienkowarstwowej
Badania
-
[P-II
ekstraktów
A5]
publikacją
oraz
roślinnych
posterem
zaowocowały
w późniejszym czasie (2006 r.) uzyskaniem patentu P. 341991 na wynalazek pt. „Sposób
otrzymywania homochelidoniny z korzenia glistnika”.
Równocześnie
wykonywałam
badania
związków
chiralnych
rozdzielając
enancjomery różnych związków na fazach stacjonarnych typu Pirkle’a. Badania dotyczyły
optymalizacji rozdzielania chromatograficznego w układzie RP-HPLC.
33
Wyniki doświadczeń ze związkami chiralnymi były prezentowane na dwóch
międzynarodowych konferencjach i zostały opublikowane w czasopiśmie z IF=1,927
(MNiSW/KBN=10) – [P-II A1].
Wiedza
i
doświadczenie
jakie
zdobyłam
w
zespole
prof.
Gołkiewicza
zaprocentowały w momencie kiedy do Katedry Chemii Nieorganicznej i Analitycznej, gdzie
pracowałam, zakupiono chromatograf jonowy i mojego przejścia do zespołu prof. dr hab.
Ryszarda Kocjana. Technika rozdzielania jonów była dla mnie ciekawa również dlatego,
że stanowiła poszerzenie moich wcześniejszych zainteresowań naukowych, które
zapoczątkowałam podczas studiów na Wydziale Chemii UMCS w Lublinie pod kierunkiem
prof. dr hab. Zbigniewa Hubickiego.
Tematyka zespołu naukowego prof. Ryszarda Kocjana obejmowała wówczas
syntezę sorbentów używanych do rozdzielania jonów metali. Moim zadaniem było
otrzymanie chalatujących sorbentów, które mogłyby zostać użyte do rozdzielania jonów
metali w warunkach kolumnowej chromatografii jonowej. Otrzymałam 4 nowe sorbenty
chelatujące, z których 3 zawierały kalces i 1 kalkon. Nośnikiem we wszystkich
przypadkach był modyfikowany żel krzemionkowy z grupami -NH2. Otrzymane sorbenty
zastosowałam z powodzeniem do rozdzielania mieszanin jonów różnych metali metodą
kolumnowej chromatografii ekstrakcyjnej, dodatkowego oczyszczania soli sodu i potasu
od jonów metali ciężkich, zatężania śladowych ilości jonów różnych metali ciężkich z
roztworów wodnych metodą ekstrakcji do fazy stałej (SPE). Stosując nośnik LiChroprepNH2 o średnicy ziaren 10 µm oraz kalces otrzymałam sorbent, który zastosowałam
następnie jako fazę stacjonarną w chromatografii jonowej jonów metali ciężkich. Wyniki
tych badań zostały opublikowane w czasopismach z IF= 1,591 (MNiSW/KBN=10) - [P-II
A4] oraz z IF=0,851 (MNiSW/KBN=8) - [P-II A2].
W roku 2003 otrzymałam Nagrodę Zespołową Ministra Zdrowia za cykl prac
na temat selektywnych sorbentów chelatujących nowego typu w analizie śladowej jonów
metali. Uzyskane wyniki badań były podstawą rozprawy doktorskiej pt. „Modyfikacja
LiChroprepu-NH2
wybranymi
sulfonowanymi
odczynnikami
chelatującymi
i zastosowanie otrzymanych sorbentów w analizie śladowej jonów metali”
obronionej w 2004 roku - [P-II A2]. Przed doktoratem napisałam również 3 rozdziały
w podręczniku dla studentów pt. „Chemia Analityczna”, pod red. Ryszarda Kocjana – [P- II
A 6, 7, 8].
34
b) pozostałe osiągnięcia naukowo-badawcze po uzyskaniu stopnia doktora nauk
farmaceutycznych
Po uzyskaniu stopnia doktora nauk farmaceutycznych, w latach 2004-2015,
opublikowałam poza pracami wchodzącymi w zakres postepowania habilitacyjnego, 20
prac, w tym 13 prac oryginalnych, 1 pracę poglądową oraz 6 rozdziałów w podręcznikach
krajowych. Łączny IF za prace nie wchodzące do postępowania habilitacyjnego
wyniósł
15,521
(MNiSW/KBN=216),
w
tym
po
doktoracie
IF=
10,597
(MNiSW/KBN=145).
Podczas zjazdów polskich i międzynarodowych zaprezentowałam łącznie 46
doniesień (po doktoracie 37). W 2007 r. Komitet Naukowy XVI Poznańskiego
Konwersatorium Analitycznego: „Nowoczesne metody przygotowania próbek i oznaczania
śladowych ilości pierwiastków” przyznał I nagrodę za najlepszy poster mojego autorstwa
we współpracy z Katedrą Farmakognozji UM w Lublinie zatytułowany „Oznaczanie metali
ciężkich
w
wybranych
roślinach
leczniczych
metodą
chromatografii
jonowej
z zastosowaniem liniowego i nieliniowego modelu regresji ważonej” – Autorzy: Anna
Błażewicz, Tomasz Baj, Sunny Patel, Ryan Romanko, Ryszard Kocjan, Kazimierz
Głowniak.
Kontynuując badania rozpoczęte przed doktoratem zajęłam się badaniem retencji
jonów metali ciężkich na chelatujących fazach stacjonarnych. Badania mechanizmu
retencji jonów Cu2+, Pb2+, Cd2+, Mn2+, Co2+, Zn2+ oraz Ni2+ opublikowałam w 2006 r.
w czasopiśmie Chemia Analityczna (IF= 0,56, MNiSW/KBN=10) – [P-II B 19].
Konsekwencją badań nad mechanizmem retencji było poszukiwanie nowych zastosowań
otrzymanej fazy stacjonarnej do analizy próbek o skomplikowanej matrycy (próbki
biologiczne).
W 2006 r. rozpoczęłam współpracę z Katedrą i Zakładem Technologii Leków
i Biotechnologii Farmaceutycznej na Wydziale Farmaceutycznym Warszawskiego
Uniwersytetu Medycznego, dotyczącą badania akumulacji metali ciężkich oraz selenu
przez kultury mycelialne L. edodes (Rerk.) Pegl. (Shitake). Prowadziłam wówczas
równoległe badania nad oznaczaniem jonów metali w grzybni Lentinula edodes (Rerk.)
Pegl. w dwóch układach chromatografii jonowej, pierwszy z udziałem konwencjonalnej
kolumny jonowymiennej IonPac CS5A (Dionex, Co., Sunnyvaley, USA), drugi z udziałem
otrzymanej fazy stacjonarnej na bazie LiChroprepu-NH2.
Z uwagi na złożoną matrycę próbek grzybni badania dodatkowo wymagały
przeprowadzenia procesu mineralizacji. Stosując własną kolumnę z chelatującą fazą
stacjonarną dokonałam pełnego rozdzielenia i oznaczenia jonów Cu2+, Cd2+, Mn2+, Co2+
oraz Zn2+ w próbkach hodowlanej grzybni z użyciem detekcji UV/Vis poprzedzonej
35
derywatyzacją pokolumnową z użyciem 4-(2-pirydylazo)-rezorcynolu i fazy ruchomej
zawierającej
kwas
szczawiowy
z
wodorotlenkiem
tetrametyloamoniowym
i wodorotlenkiem potasu.
Dokonałam optymalizacji stężenia odczynnika derywatyzującego ze zbadaniem
wpływu stężenia 4-(2-pirydylazo)-rezorcynolu oraz szybkości przepływu derywatyzatu
na pole powierzchni pików dla pięciu analitów. Wyniki tych badań zostały opublikowane
w czasopiśmie z IF=0,716 (MNiSW/KBN=13) - [P-IIB 7]. Przy zastosowaniu firmowej
jonowymiennej kolumny IonPac CS5A (Dionex, Co., Sunnyvaley, USA) uzyskiwałam
rozdzielenia w krótszym czasie z większą sprawnością. Długie czasy retencji, słabsza
sprawność oraz brak pompy gradientowej spowodował, że do badań nad oznaczaniem
jonów cynku i kobaltu w grzybniach zastosowałam komercyjną fazę stacjonarną.
Badania we współpracy z WUM dowiodły, że kumulacja niektórych metali ciężkich
(w tym większości biopierwiastków) jest zależna od stężenia selenianu (III) sodu
(prekursora selenu) w podłożu hodowlanym. Wyniki badań pozwoliły sformułować teorię
dotyczącą mechanizmu transportu do komórki grzyba kationów metali w kompleksach
z selenianami (III) – [P-II B 8] (IF= 0,531, MNiSW/KBN=10).
W kolejnym etapie zespół z Katedry i Zakładu Technologii Leków i Biotechnologii
WUM przeprowadzał optymalizację procesu biosyntezy witaminy B12 przez kultury
mycelialne L. edodes. Optymalizacja ta doprowadziła do określenia optymalnego stężenia
kobaltu
(oznaczanego
przeze
mnie
za
pomocą
chromatografii
jonowej
w zmineralizowanych próbkach grzybni), stosowanego jako prekursor kobalaminy,
w podłożu dla uzyskania maksymalnej wydajności procesu biosyntezy. Wyniki wspólnych
badań zostały opublikowane w czasopiśmie z (IF= 2,375, MNiSW/KBN=20) - [P-IIB 12].
Za współautorstwo publikacji dotyczących optymalizacji biosyntezy mycelialnej
grzybów leczniczych w otrzymywaniu witaminy B12 i frakcji polisacharydowych
biologicznie czynnych, JM Rektor Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego przyznał mi
w 2009 roku dyplom (badania zostały uhonorowane zespołową nagrodą naukową).
W 2010 roku otrzymałam dyplom również JM Rektora WUM za cykl publikacji,
uhonorowany nagrodą naukową, dotyczących izolacji metabolitów z grzybów gatunków
Lentinula edodes i Hericium erinaceum o spodziewanej aktywności przeciwnowotworowej.
W 2006 roku Klinika Patologii i Kardiologii Noworodków i Niemowląt Dziecięcego
Szpitala Klinicznego w Lublinie zwróciła się do mnie z prośbą o oznaczenie jonów metali
w osoczu krwi dzieci niedożywionych oraz grupy dzieci zdrowych w wieku 1-24 miesięcy.
Dzięki zastosowaniu chromatografii jonowej wykazałam, że zawartość miedzi i magnezu
była istotnie wyższa u dzieci z niedożywieniem w porównaniu ze zdrowymi dziećmi.
W doświadczeniach wykorzystałam zalety chromatografii jonowej, która umożliwia
36
jednoczesne oznaczenie wielu rodzajów jonów oraz pozwala na przeprowadzenie
oznaczeń w bardzo małej objętości próbki (objętość osocza jaką otrzymałam ze szpitala
wynosiła jedynie 0,2 – 0,5 ml).
Zastosowałam dwa odmienne chromatograficzne moduły, tj. dotychczas używany
chromatograf DX-500 firmy Dionex, Co., USA z detekcją UV/ViS oraz wypożyczony
chromatograf firmy Metrohm (761 Compact IC Chromatograph, Mtrohm, Herisau,
Szwajcaria), dzięki któremu mogłam oznaczyć jony metali z pierwszej i drugiej grupy
układu okresowego z użyciem detekcji konduktometrycznej i kolumny Metrosep C2
(Metrohm). Obydwa układy chromatograficzne umożliwiają oznaczanie jonów metali na
poziomie µg/l. Wyniki badań opublikowano w czasopiśmie z (IF=0,353, MNiSW/KBN=10)
- [P-IIB 20].
Współpraca z Kliniką Patologii i Kardiologii Noworodków i Niemowląt została
poszerzona na grupę dzieci w przedziale wieku 2 miesiące – 18 lat z arytmią, dla której
wykonałam procedurę mineralizacji oraz oznaczenie jonów żelaza (III), miedzi (II), cynku
(II), niklu (II), manganu (II), kobaltu (II), kadmu (II), ołowiu (II), sodu, potasu, wapnia
i magnezu. Stwierdziłam, że zawartość żelaza i cynku jest wyższa u dzieci z arytmią,
u których wykluczono stan infekcji. Wyniki badań opublikowano w czasopiśmie
z IF=0,353, MNiSW/KBN=10 - [P-IIB 21].
Brałam również udział w badaniach pacjentów tej samej kliniki przedwcześnie
urodzonych z dysplazją oskrzelowo-płucną, u których zastosowana przeze mnie metoda
pozwoliła stwierdzić znacząco niższe stężenie potasu i wapnia oraz wyższą zawartość
żelaza u wcześniaków w porównaniu z grupą kontrolną dzieci urodzonych w terminie.
Badania opisano w czasopiśmie z IF=0,963, MNiSW/KBN=10 - [P-IIB 13]. Wyniki tych
badań były również prezentowane na konferencjach specjalistycznych z dziedziny
pediatrii.
W pracy naukowo-badawczej interesowały mnie również próbki roślinne, które są
na ogół łatwo dostępne w ilości dużo większej niż próbki pochodzące od pacjentów.
Cechuje je również złożoność matrycy, w której metale zawarte są w bardzo szerokim
zakresie stężeń. Współpraca z Katedrą i Zakładem Farmakognozji z Pracownią Roślin
Leczniczych Uniwersytetu Medycznego w Lublinie umożliwiła opracowanie szczegółowej
metodyki badań jonów metali za pomocą IC-UV/Vis w częściach nadziemnych Hyssopus
officinalis L., której wyniki opublikowano - [P-IIB 15] (IF= 0,627, MNiSW/KBN=10).
Badania wymagały przygotowania materiału roślinnego do analizy, co uzyskano
poprzez przeprowadzenie mineralizacji wspomaganej energią mikrofalową. Zastosowałam
uprzednio zoptymalizowaną procedurę przygotowania materiału roślinnego do oznaczeń
jonów metali z użyciem chromatografii jonowej z detekcją spektrofotometryczną
37
poprzedzoną
derywatyzacją
pokolumnową.
Roztwory
do
wyznaczania
krzywych
wzorcowych sporządziłam metodą rozcieńczenia. Stwierdziłam, że dane dotyczące
poszczególnych serii roztworów mają charakter heteroscedastyczny (uzyskano wysokie
wartości współczynnika korelacji R2 odchylenia standardowego względem stężenia dla
wszystkich kationów z wyjątkiem Cd2+), dlatego zastosowano w pracy metody regresji
ważonej.
Dla wszystkich rodzajów kationów testowano (w oparciu o statystykę F) cztery
równania korelacyjne - dwa liniowe i dwa nieliniowe, wybierając te, które dawało
najwyższą wartość statystyki F. Wartości granicy wykrywalności (LOD) zostały
wyznaczone metodą Hubaux-Vos’a (w zakresie 0,006 – 0,056 µg/ml). Odchylania
standardowe zawartości poszczególnych jonów metali w próbkach hyzopu nie różniły się
statystycznie
od
odchyleń
wynikających
dla
odpowiednich
stężeń
z
krzywych
kalibracyjnych, co oznacza, że badany materiał był dobrze uśredniony, a wielkość próbki
użytej do mineralizacji była wystarczająca.
Metodę opisaną w
w/w publikacji zastosowano dla wielu innych roślin,
a w badaniach uczestniczyli amerykańscy studenci z koła naukowego, którym kieruję
w macierzystej katedrze. Z powodu szczególnego zainteresowania znaczeniem ziół
w medycynie i farmacji przeprowadziłam również badania IC zawartości jonów żelaza,
manganu, cynku, miedzi, kadmu i ołowiu w herbatkach ziołowych – [P-IIB 18].
Z pozostałych prac, których nie zawarłam w cyklu habilitacyjnym pragnę wymienić
szczególnie dwie publikacje, których wykonanie było możliwe dzięki użyciu nie tylko
chromatografii jonowej, ale również atomowej spektrometrii absorpcyjnej. W pracy
wspólnej
z
Kliniką
Endokrynologii
i
Diabetologii
Dziecięcej
z
Pracownią
Endokrynologiczno-Metaboliczną Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego w Lublinie
zastosowałam technikę IC w problematyce niskorosłości dzieci, u których stwierdzono
istotnie różne zawartości wybranych metali w płynach biologicznych sugerujące wpływ
terapii
hormonami
wzrostu
na
poziom
pierwiastków
-
[P-IIB
2]
(IF=1,748,
MNiSW/KBN=15).
Absorpcyjna spektrometria atomowa z użyciem wysokorozdzielczego spektrometru
absorpcji atomowej z ciągłym źródłem promieniowania (HR-CS AAS), umożliwiła
natomiast oznaczenie selenu w próbkach osocza oraz moczu u pacjentów otyłych – [P-IIB
1] (IF=2,371, MNiSW/KBN=20). Były to badania jakie prowadziłam we współpracy
z w/w Kliniką, Katedrą i Zakładem Mikrobiologii Farmaceutycznej z Pracownią Diagnostyki
Mikrobiologicznej oraz z Zakładem Chemii Środowiskowej, Instytutu Biologii i Ochrony
Środowiska, Akademii Pomorskiej w Słupsku.
38
Problem otyłości interesował mnie szczególnie pod kątem zawartości pierwiastków
śladowych u dzieci, czego dowodem są prowadzone przeze mnie badania krwi, moczu
i osocza tych pacjentów opublikowane wcześniej ([P-4] w postepowaniu habilitacyjnym).
Ponadto jak donosi literatura, interakcje między metalami zarówno niezbędnymi
jak i wykazującymi toksyczność, a selenem są bardzo istotne w odniesieniu do wielu
zaburzeń (Goyer, 1997). W związku z tym podjęłam się badań zawartości selenu
w moczu i osoczu dzieci otyłych i zdrowych. Wokół roli tego pierwiastka w powstawaniu
chorób istnieje wiele kontrowersji, które częściowo wynikają z niedostatecznych
i niepotwierdzonych badań selenu w tkankach i płynach biologicznych ludzi.
Wiadomo, że u osób otyłych dochodzi do zaburzenia równowagi prooksydacyjnoantyoksydacyjnej określanej mianem stresu oksydacyjnego (Vincent i Taylor, 2006;
Ozgen i wsp., 2012; Kornhauser i wsp., 2008). W pracy wykazałam, że dla dzieci otyłych
istnieje ryzyko niedoboru selenu, które może mieć groźne następstwa zdrowotne,
a zaburzenia metaboliczne towarzyszące otyłości związane są szczególnie z ryzykiem
chorób sercowo- naczyniowych, cukrzycą i nieprawidłowym funkcjonowaniem tarczycy.
Zbadałam
wpływ
metabolicznych
czynników
(ciśnienie
krwi,
poziom
glukozy,
trójglicerydów, całkowitego cholesterolu i jego frakcji HDL i LDL) na ryzyko związane
z występowaniem otyłości, a także przeprowadziłam zależności poziomu selenu
w płynach ustrojowych w odniesieniu do płci, wieku oraz indeksu masy ciała (BMI) dzieci
chorych i zdrowych.
Na podstawie analizy statystycznej
otrzymanych danych stwierdziłam,
że
niezależnie od płci poziom selenu zarówno w moczu jak i w osoczu jest dużo niższy
u otyłych dzieci. Analiza wieloczynnikowa wykazała, że poziom selenu w osoczu
(p=0,001, OR 0,74, 95%CI 0,62–0,88) oraz poziom całkowitego cholesterolu (p=0,001,
OR 1,19, 95%CI 1,08–1,31) są niezależnymi czynnikami zwiększającymi ryzyko otyłości
u dzieci.
Kiedy wzięłam pod uwagę poziom selenu w moczu zostały ustanowione
następujące dwa modele: dla poziomu selenu w moczu (p<0,0001, OR 0,70, 95%CI 0,580,84) i poziomu glukozy w osoczu (p<0,0001, OR 1,22, 95%CI 1,10-1,35) jak również dla
zawartości selenu w moczu (p=0,002, OR 0,60 95%CI 0,43-0,83) i poziomu całkowitego
cholesterolu we krwi (p=0,003, OR 1,16, 95%CI 1,05-1,28). Moja praca jest pierwszą
w Polsce, która opisuje wpływ czynników biochemicznych i poziomu selenu w organizmie
związany z ryzykiem otyłości u polskich pacjentów i pierwszą na świecie, w której
zbadano selen w dwóch rodzajach próbek u tych samych pacjentów z otyłością w wieku
dziecięcym.
Po doktoracie zajmowałam się również pisaniem rozdziałów do prac zbiorowych
pod redakcją dr hab. Rajmunda Michalskiego, który jako jeden z nielicznych badaczy
39
w Polsce rozwinął szczególnie zastosowania środowiskowe chromatografii jonowej.
Jestem samodzielną autorką następujących 7 rozdziałów na temat chromatografii jonowej
(nie ujętych do postępowania habilitacyjnego): [P-II B 3, 6, 10, 11, 14, 16, 17]. Łączna
wartość punktacji rozdziałów w tych monografiach wynosi 29 punktów MNiSW/KBN.
Jestem
również
samodzielnym
autorem
pracy
przeglądowej
zatytułowanej
„Najnowsze osiągnięcia w śladowej analizie metali z zastosowaniem chromatografii
jonowej z chelatującymi fazami stacjonarnymi” [P-II B 6]. W/w rozdziały w monografiach
oraz praca przeglądowa były związane z moimi wykładami jakie wygłosiłam podczas
konferencji naukowych (tematy wystąpień wymieniłam na str. 42).
Jestem również współautorem pracy, która była ściśle związana z badaniami jakie
prowadziłam dla uczestników kursów chromatograficznych organizowanych przez wiele
lat w macierzystej katedrze. Badania dotyczyły chromatograficznej analizy kwasów
fenolowych w hyzopie lekarskim z użyciem kolumny monolitycznej HPLC z detektorem
z matrycą diodową (RP-HPLC-DAD). Przeprowadziłam szybką analizę 7 kwasów
fenolowych w czasie 6 minut, była wspomagana oprogramowaniem ChromSword (Merck
KGaA, Darmstadt, Niemcy), która bardzo nowoczesnym w owym czasie narzędziem do
wspomagania chromatografistów – [P-II B5] (MNiSW/KBN=9). Praca powstała we
współpracy z Katedrą i Zakładem Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych
Uniwersytetu Medycznego w Lublinie.
Piśmiennictwo
1. Goyer RA. Toxic and essential metal interactions.
Annual Review of Nutrition 1997;17: 37-50 DOI: 10.1146/annurev.nutr.17.1.37.
2. Vincent HK, Taylor AG. Biomarkers and potential mechanisms of obesity induced oxidant stress
in humans. Int J Obes 2006; 30: 400–18.
3. Ozgen IT, Tascilar ME, Bilir P, Boyraz M, Guncikan MN, Akay C, et al. Oxidative stress
in obese children and its relation with insulin resistance.
J Pediatr Endocrinol Metab 2012; 25: 261–6.
4. Kornhauser C, Garcia-Ramirez JR, Wrobel K, Perez-Luque E-L, Garay-Sevilla ME, Wrobel K.
Serum selenium and glutathione peroxidase concentrations in type 2 diabetes mellitus patients.
Primary Care Diab 2008; 2: 81–5.
c) kierowanie międzynarodowymi i krajowymi projektami badawczymi
Jestem pomysłodawcą i kieruję czterema interdyscyplinarnymi międzynarodowymi
projektami międzyuczelnianymi (tzw. inne niekomercyjne projekty badawcze):
 Z Ulm University (Niemcy): „Behavioral impairment and altered levels of selected
elements in humans and animals in the context of autism"
40
 Z Homu Clinic (Tajwan): „Evaluation of Traditional Chinese Medicinal Products on
the content of trace elements in the hair of patients diagnosed with depression and
sleep disorders”.
 Z IPIŚ w Zabrzu: "Zastosowanie technik IC oraz ICP-MS do badania korelacji
pomiędzy poziomem pierwiastków śladowych u dzieci a stopniem nasilenia
i objawami autyzmu” oraz „Badanie wpływu czynników środowiskowych i diety
na występowanie i charakter zaburzeń ze spektrum autyzmu”.
 Jestem także wykonawcą projektu wspólnego z Katedrą i Zakładem Technologii
Leków i Biotechnologii Farmaceutycznej WUM („Badanie akumulacji selenu przez
kultury mycelialne L. edodes”).
d) współpraca z jednostkami naukowymi w kraju i za granicą

Neurozentrum der Universität Ulm, AG Moleculare Analyse von Synaptopathien,
Niemcy

Homu Clinic, Tainan City, Tajwan (R.O.C.)

Instytut Podstaw Inżynierii Środowiska Polskiej Akademii Nauk w Zabrzu.

Katedra
I
Zakład
Technologii
Leków
I
Biotechnologii
Farmaceutycznej,
Warszawski Uniwersytet Medyczny, Wydział Farmaceutyczny.

Zakład Chemii Środowiskowej, Instytut Biologii i Ochrony Środowiska, Akademia
Pomorska w Słupsku.
Współpraca w ramach jednostek UM w Lublinie

I Klinika Psychiatrii, Psychoterapii i Wczesnej Interwencji SPSK 1.

Klinika Endokrynologii i Diabetologii Dziecięcej z Pracownią Endokrynologiczno-
Metaboliczną Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego (USzD).

Klinika Patologii Noworodków i Niemowląt USzD.

Klinika Kardiologii Dziecięcej USzD.

Klinika Chorób Wewnętrznych SPSK 1.

Katedra i Zakład Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych.

Katedra i Zakład Syntezy i Technologii Chemicznej Środków Leczniczych.

Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej.

Katedra i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej z Pracownią Diagnostyki
Mikrobiologicznej.

Zakład Chemii Fizycznej.

Klinika Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej SPSK 4.

Katedra i Zakład Chemii Leków.
41
e) wykłady na sympozjach i konferencjach
Do roku 2016 wygłosiłam łącznie 7 wykładów na 6 międzynarodowych
i 1 ogólnopolskiej konferencji naukowej, w tym 6 na imienne zaproszenie (nr 1-6):
1. Na 16th International Symposium of SIS, Chiba, Japan (IX 2013 r.) wygłosiłam
wykład plenarny pt. “The Significance of Ion Chromatography Among Other Methods for
the Determination of Iodine in Sample with Complex Matrices”.
2. Na II Międzynarodowej Konferencji Naukowo-Szkoleniowej „Plant – the source
of research material”: “A Look On The Traditional Far East Medicinal Products Through
Research Into The Inorganic Trace Analysis”. Lublin, 18 - 20. 10. 2012 r.
3. Na II konferencji „Chromatografia jonowa - nowoczesna metoda oznaczania
anionów i kationów w wodach i ściekach” w Instytucie Podstaw Inżynierii Środowiska
PAN: „Obecne trendy w rozwoju faz stacjonarnych stosowanych w analizie jonów
w próbkach o złożonej matrycy”. (Zabrze 27 kwiecień 2006 r.).
4. Na III konferencji „Chromatografia jonowa - nowoczesna metoda oznaczania
anionów i kationów w wodach i ściekach” w Instytucie Podstaw Inżynierii Środowiska
PAN: „Wybrane zagadnienia z zastosowań chromatografii jonowej w analizie klinicznej”.
(Zabrze 26 - 27 kwietnia 2007 r.).
5. Na V konferencji „Chromatografia jonowa - nowoczesna metoda oznaczania
anionów i kationów w wodach i ściekach” w Śląskiej Wyższej Szkole Zarządzania
im. Gen. J. Ziętka w Katowicach: Przegląd najnowszych trendów w chromatografii
jonowej”. (Katowice 21-22 kwietnia 2009 r.).
6. Na II Ogólnopolskim Sympozjum "Nauka i przemysł - metody spektroskopowe w
praktyce, nowe wyzwania i możliwości", na Wydziale Chemii UMCS w Lublinie:
„Najnowsze osiągnięcia w śladowej analizie metali z zastosowaniem chromatografii
jonowej z chelatującymi fazami stacjonarnymi”. (Lublin 08.06.09-10.06.09 ).
7. Na Konferencji pt. „Analityka substancji o charakterze jonowym” organizowanym
przez UMK w Toruniu: „Praktyczne zastosowania metody HPCIC w oznaczaniu jonów
metali w próbkach biologicznych”. (Toruń 23.04.09- 24.04.09).
f) patenty
Badania jakie prowadziłam na początku swojej kariery zawodowej pod kierunkiem
prof. dr hab. Władysława Gołkiewicza dotyczyły optymalizacji rozdzielania alkaloidów
z ekstraktów roślinnych i zaowocowały w 2006 r. uzyskaniem patentu Nr. P. 341991
na wynalazek pt. „Sposób otrzymywania homochelidoniny z korzenia glistnika”.
42
g) działalność popularyzująca naukę
Wielokrotnie przygotowywałam projekty i pokazy w ramach Lubelskiego Festiwalu
Nauki, a w roku 2009 za mój projekt pt. „Włosy - w jakim stopniu stanowią źródło
informacji o stanie zdrowia człowieka?” otrzymałam wyróżnienie w kategorii „najlepszy
pokaz” na VI Lubelskim Festiwalu Nauki oraz nagrodę finansową Prorektora ds. Nauki UM
w Lublinie, przeznaczoną na potrzeby Zakładu Chemii Analitycznej UM w Lublinie.
h) recenzowanie publikacji w czasopismach międzynarodowych i krajowych
Rocznie
recenzuję
kilkanaście
publikacji
do
czasopism
zagranicznych
posiadających i nieposiadających współczynnika oddziaływania IF. Do chwili obecnej
wykonałam łącznie 54 recenzje:
European Journal of Nutrition (z IF) – 1; Advances in Medical Sciences (z IF) – 3;
Environmental Science and Pollution Research (z IF) – 4; Journal of Trace Elem in Med
and Biol (z IF) – 28; Biol Trace Elem Res (z IF) – 8; Acta Chromatogr (z IF) – 4; Austin
Chromatography – 1; Current Chromatography – 4; Medicine – 1.
i) członkostwo w radach naukowych czasopism i konferencji oraz towarzystwach
naukowych
Od roku 2014 jestem członkiem komitetu naukowego Międzynarodowej Konferencji
Chromatografii jonowej odbywającego się przemiennie na UMK w Toruniu oraz Instytucie
Podstaw Inżynierii Środowiska w Zabrzu.
Jestem członkiem 8 komitetów redakcyjnych międzynarodowych czasopism:
Current Chromatography, Open Journal of Chromatography, Austin Chromatography,
International Journal of Diabetes in Developing Countries, Preventive Nutrition and Food
Science, International Journal of Pediatric Research, Journal of Biochemistry and
Molecular Biology Res., Journal of Autism & Epilepsy.
Jestem członkiem specjalnym Society of Iodine Science (Chiba University, Japonia)
oraz członkiem Polskiego Towarzystwa Chemicznego.
j) działalność dydaktyczna i organizacyjna
W roku 1997 rozpoczęłam pracę w Katedrze i Zakładzie Chemii Nieorganicznej
i Analitycznej Akademii Medycznej w Lublinie, kierowanymi przez prof. dr hab. Edwarda
Soczewińskiego. Do roku 2004 prowadziłam zajęcia z przedmiotu chemia fizyczna oraz
analiza instrumentalna dla studentów II roku Wydziału Farmaceutycznego. Prowadziłam
43
zarówno ćwiczenia laboratoryjne jak i zajęcia obliczeniowe. Od roku 2004 do chwili
obecnej prowadzę zajęcia z przedmiotu chemia analityczna oraz analiza instrumentalna
dla studentów farmacji i analityki medycznej. Kieruję pracownią analizy instrumentalnej.
Przez kilka lat prowadziłam także seminaria z walidacji metod analitycznych,
do których ułożyłam program nauczania.
Od 2004 roku (po doktoracie) zostałam koordynatorką przedmiotu chemia ogólna
dla zagranicznych studentów I roku medycyny II Wydziału Lekarskiego z Oddziałem
Anglojęzycznym. Przez pierwsze lata samodzielnie prowadziłam przedmiot (tj. wykłady
i ćwiczenia), a następnie zaangażowałam kolegów z Zakładów należących do Katedry
Chemii do prowadzenia ćwiczeń dla studentów programu amerykańskiego, azjatyckiego
i arabskiego. Do chwili obecnej kontynuuję prowadzenie wykładów i ćwiczeń dla
studentów
anglojęzycznych,
a
także
przygotowuję
i
przeprowadzam
egzamin
przedmiotowy.
W latach 2002 - 2003 byłam członkiem wydziałowej komisji rekrutacyjnej
na macierzystej uczelni. Jestem członkiem rady pedagogicznej II roku farmacji (semestr
IV).
Od 2006 r. jestem opiekunem kół naukowych w macierzystym zakładzie.
Od 1998 r. do 2009 r. prowadziłam zajęcia dla uczestników specjalistycznych
kursów chromatograficznych (HPLC, TLC, IC) odbywających się w macierzystej katedrze.
Jestem członkiem Towarzystwa Absolwentów i Przyjaciół UM w Lublinie.
k) promotorstwo i opieka naukowa nad studentami
Do chwili obecnej byłam opiekunem następujących prac magisterskich:
1. Ashraf Saleh (2005): „Badanie zawartości jonów metali ciężkich w różnych grzybniach
twardziaka japońskiego (Lentinus Edodes, Shiitake)”.
2. Paweł Stępień (2006): „Badanie zawartości niektórych metali w tkankach ludzkich”.
3. Magdalena Kargul (2007): „Zastosowanie wysokosprawnej chromatografii jonowej
w badaniach osocza pacjentów z chorobami metabolicznymi”.
4. Janusz Drelicharz (2008): „Oznaczanie jonów metali ciężkich w roślinach z rodzaju
Peucedanum metodą chromatografii jonowej”.
5. Agnieszka Zaśko (2009): „Oznaczanie metali ciężkich u pacjentów ze
zdiagnozowanym rakiem krtani metodą chromatografii jonowej”.
6. Kamila Szczygieł (2010): „Badanie wpływu przygotowania próbek klinicznych na wynik
analizy chromatograficznej”.
7. Anna Opala (2010): „Badanie roli biopierwiastków w schorzeniach kardiologicznych
przy zastosowaniu chromatografii jonowej”.
44
8. Bartłomiej Ochyra (2015): „Analiza śladowa jako narzędzie do poszukiwania związku
pomiędzy czynnikami środowiskowymi a diagnozą zespołu Aspergera”.
Jestem promotorem następujących prac magisterskich:
1. Agata Lalak (2014):” Zaburzenia snu, a zawartość żelaza we włosach u pacjentów
z chorobami spektrum autystycznego”
2. Malwina Kurek (2014):” Badanie zawartości wybranych pierwiastków u pacjentów
z zaburzeniami neurorozwojowymi”
3. Przemysław Niziński (2015): „Badanie korelacji pomiędzy zawartością wybranych
pierwiastków a parametrami biochemicznymi u osób ze spektrum autyzmu”
Na rok 2016 zaplanowałam promotorstwo dwóch prac magisterskich mającymi
związek z tematyką badawczą dotyczącą zastosowania IC w problematyce autyzmu.
l) nagrody i wyróżnienia
 2003 – Nagroda Zespołowa Ministra Zdrowia za cykl prac na temat selektywnych
sorbentów chelatujących nowego typu w analizie śladowej jonów metali.
 2006 - Nagroda Zespołowa Ministra Zdrowia za cykl publikacji dotyczących
syntezy, analizy struktury i właściwości oraz zastosowania chiralnych i achiralnych
pochodnych imidazoliny jako substancji wyjściowych do otrzymywania substancji
aktywnych farmakologicznie w OUN szczególnie o działaniu antynocyceptywnym.
Nagrody indywidualne za lata:
 2000/2001 - Nagroda Dydaktyczno-Organizacyjna Rektora UM w Lublinie.
 2004/2005 - Nagroda Dydaktyczno-Organizacyjna Rektora UM w Lublinie.
 2006 - Nagroda Dydaktyczna III stopnia Rektora UM w Lublinie.
 2007 - Nagroda Dydaktyczna II stopnia Rektora UM w Lublinie.
 2008 - Nagroda Naukowa III stopnia Rektora UM w Lublinie.
 2009 - Nagroda Dydaktyczna III stopnia Rektora UM w Lublinie.
 2010 - Nagroda Naukowa III stopnia Rektora UM w Lublinie.
 2012 - Nagroda Organizacyjna III stopnia Rektora UM w Lublinie.
 2013 - Nagroda Organizacyjna III stopnia Rektora UM w Lublinie.
 2014 - Nagroda Organizacyjna I stopnia Rektora UM w Lublinie.
 2007 - I nagroda w konkursie na najlepszy poster - Komitet Naukowy XVI
Poznańskiego Konwersatorium Analitycznego: Nowoczesne metody przygotowania
próbek i oznaczania śladowych ilości pierwiastków Poznań, 12-13 kwietnia 2007.
45
„Oznaczanie
metali
ciężkich
w
wybranych
roślinach
leczniczych
metodą
chromatografii jonowej z zastosowaniem liniowego i nieliniowego modelu regresji
ważonej” - Anna Błażewicz, Tomasz Baj, Sunny Patel, Ryan Romanko, Ryszard
Kocjan, Kazimierz Głowniak.
 2009
-
Dyplom
Rektora
Warszawskiego
Uniwersytetu
Medycznego
za współautorstwo publikacji dotyczących optymalizacji biosyntezy mycelialnej
grzybów leczniczych w otrzymywaniu witaminy B12 i frakcji polisacharydowych
biologicznie czynnych, które zostały uchonorowane zespołową nagrodą naukową III
stopnia.
 2010 - Dyplom Rektora WUM za cykl publikacji dotyczących izolacji metabolitów
z grzybów gatunków Lentinula edodes i Hericium erinaceum o spodziewanej
aktywności przeciwnowotworowej - uhonorowany nagrodą naukową II stopnia.
 1st Prize in the English Session podczas 50th Medical Students’ Research
Associations’Congress – dla koła naukowego, którego jestem opiekunem.
 2nd Prize in the English Session podczas 48th Medical Students’ Research
Associations’Congress – dla mojego koła naukowego, którego jestem opiekunem.
 Nagroda w kategorii „najlepszy pokaz” na VI Lubelskim Festiwalu Nauki w 2009 r.
ł) nagrody i działalność kierowanych przeze mnie studenckich kół naukowych
Od 2006 r. jestem opiekunem kół naukowych w macierzystym zakładzie. Studenci,
których pracami kierowałam wielokrotnie prezentowali wyniki naszych wspólnych badań
podczas konferencji międzynarodowych, a za swoje ustne wystąpienia zdobywali nagrody
podczas sympozjów studenckich kół naukowych:
- nagroda za I miejsce w sesji anglojęzycznej dla Wojciecha Dollivera i Rajindera
Randhawy
za
pracę
pt.
„Searching
for
the
best
chromatographic
conditions
for determination of sildenafil citrate” podczas 50 Sympozjum Studenckich Kół Naukowych
Uczelni Medycznych w 2011 roku (opiekun dr Anna Błażewicz).
- nagroda za II miejsce w sesji anglojęzycznej dla Suceil Sivsammye, Apekshy Deol,
Wojciecha Dollivera, Rajindera Randhawy podczas 48 Sympozjum Studenckich Kół
Naukowych Uczelni Medycznych w 2009 roku (opiekun dr Anna Błażewicz).
Studenci mojego koła naukowego prezentowali również swoje prace podczas
47 Sympozjum Studenckich Kół Naukowych Uczelni Medycznych w 2008 roku:
- „Investigation of trace elements and biologically active compounds from selected
Mongolian Plants” – Sunny Patel i Ryan Romanko.
46
- “Application of Ion Chromatography to the analysis of human blood serum” – Nishita
Parikh i Harmanjot Kaur.
Studenci mojego koła - Sunny Patel i Ryan Romanko byli współautorami
nagrodzonego posteru w 2007 r. na XVI Poznańskim Konwersatorium Analitycznym,
o czym wcześniej napisałam. Studenci Suceil Sivsammye, Apeksha Deol, Wojciech
Dolliver i Rajinder Randhawa są również współautorami publikacji ujętej w postępowaniu
habilitacyjnym [P-2]. Wielu studentów mojego koła jest także współautorami posterów
prezentowanych na międzynarodowych sympozjach naukowych:
- The investigation of trace elements from selected Mongolian plants, with emphasis
on homeopathic properties, using ion chromatography. [AUT.] Anna Błażewicz, Tomasz
Baj, Sunny Patel, Ryan Romanko, Ryszard Kocjan, Kazimierz Głowniak. Drugs Future
2007 vol. 32 suppl. A s. 141, Abstr. from the 6th AFMC International Medicinal Chemistry
Symposium. Istambul, July 8-11, 2007.
- Trace elements composition of Lycium Chinese samples from polish and taiwan market.
[AUT.] Anna Błażewicz, Cheng-Bin Xu, Ryszard Kocjan. W: 2nd International Conference
and Workshop : Plant - the source of research material. (Roślina - źródłem materiału
badawczego.) Lublin, 18-20.10.2012. Abstr. s. 117.
- From the traditional Chinese cuisine to the analytical chemistry lab bench - selenium and
other trace elements in the jelly ear and shiitake mushrooms. [AUT.] Anna Błażewicz,
Tzu-Yi Chan, Jadwiga Turło, Piotr Suchocki, Ryszard Kocjan, Piotr Wroczyński. W: 2nd
International Conference and Workshop: Plant - the source of research material. (Roślina
- źródłem materiału badawczego.) Lublin, 18-20.10.2012
Kilkakrotnie uczestniczyłam w pracach komisji konkursowej podczas sympozjów
naukowych studentów uczelni medycznych odbywających się w Lublinie.
47
6. AUTORSTWO LUB WSPÓŁAUTORSTWO PRAC NAUKOWYCH LUB INNYCH
PRAC TWÓRCZYCH
Jestem autorką 38 prac naukowych, w tym:
17 oryginalnych pełnotekstowych prac w czasopismach z Impact Factor;
3 oryginalnych publikacji pełnotekstowych w suplementach czasopism z IF;
4 oryginalnych pełnotekstowych prac w czasopismach bez Impact Factor;
1 pracy poglądowej bez IF;
11
rozdziałów
w
podręcznikach
międzynarodowych,
w
tym
2
rozdziały
w podręcznikach międzynarodowych i 9 w krajowych;
2 prac popularnonaukowych;
oraz 46 streszczeń z konferencji, w tym 24 z konferencji międzynarodowych i 22
krajowych
7.
BIBLIOMETRYCZNE WSKAŹNIKI DOKONAŃ NAUKOWYCH
Sumaryczny impact factor IF=30,264, co stanowi 375 punktów KBN/MNiSW.
(po uzyskaniu stopnia doktora ponad 6 – krotnie zwiększył się współczynnik
oddziaływania moich prac)
Liczba cytowań publikacji (bez autocytowań) według bazy Web of Science wynosi 73
(stan na dzień 27.01.2016).
Liczba cytowań publikacji (bez autocytowań) według bazy Scopus wynosi 73.
Indeks Hirscha publikacji według bazy Web of Science wynosi 6.
Indeks Hirscha publikacji według bazy Scopus wynosi 6.
Szczegółowa analiza bibliometryczna publikacji w postępowaniu o nadanie stopnia
naukowego doktora habilitowanego, sporządzona przez Bibliotekę Główną UM
w Lublinie stanowi ZAŁĄCZNIK 5
48

dr Agnieszka Ludwiczuk – załącznik 2

Transkrypt

Podobne dokumenty

PUNKT PRZYJMOWANIA PRÓBEK KAŁU-3

WOJEWÓDZKI INSPEKTORAT OCHRONY ROŚLIN I

zlecenie urzędowych badań serologicznych

Stary DomDwa lata temu kupili my

Optyczna kontrola wymiarów próbek

ZAGROŻENIE RADIACYJNE

MCZ SA