PROBLEMATYKA: Chromatograficzne rozdzielanie składników

Zakład Chemii Analitycznej
PROBLEMATYKA:
Chromatograficzne rozdzielanie składników próbek
TEMAT ĆWICZENIA:
ROZDZIELENIE MIESZANINY LEKÓW PSYCHOTROPOWYCH
TECHNIKĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
METODA:
Wysokosprawna chromatografia cieczowa
WPROWADZENIE
Chromatografia jest fizykochemiczną metodą rozdzielania składników jednorodnych
mieszanin w wyniku ich różnego podziału między fazę ruchomą i nieruchomą układu
chromatograficznego.
Twórcą chromatografii jest rosyjski botanik M.S. Cwiet, który zajmował się badaniem
barwników liści i jako pierwszy je rozdzielił. W 1905 została opublikowana jego pierwsza
praca dotycząca chromatografii. Stopniowo zaczęły powstawać nowe rodzaje technik
chromatograficznych i zaczęto konstruować różnorodną aparaturę, co stwarzało nowe
możliwości i zwiększało zakres zastosowania chromatografii. Obecnie chromatografia jest
jedną z najbardziej rozpowszechnionych metod instrumentalnych w chemii analitycznej, a w
analizie związków organicznych zajmuje pozycję lidera. Zapewnia ona możliwość
identyfikacji substancji oraz ich ilościowej analizy, nawet w niskich stężeniach w obecności
innych związków.
Klasyfikację technik chromatograficznych można przeprowadzić według kilku
kryteriów. W zależności od użytej fazy ruchomej chromatografię dzielimy na: gazową (ang.
gas chromatography, GC), cieczową (liquid chromatography, LC), z fazą ruchomą w stanie
nadkrytycznym (supercritical fluid chromatography, SFC). W zależności od zastosowanej fazy
stacjonarnej dostajemy następujące układy chromatograficzne:
Faza ruchoma
Faza stacjonarna
gaz
-
ciecz
(ang. gas-liquid chromatography, GLC)
ciecz
-
ciecz
(ang. liquid-liquid chromatography, LLC)
gaz
-
ciało stałe
(ang. gas-solid chromatography, GSC)
ciecz
ciało stałe
(ang. liquid-solid chromatography, LSC)
Ze względu na naturę zjawiska stanowiącego podstawę procesu chromatograficznego
chromatografię dzielimy na:
• adsorpcyjną, w której rozdzielanie odbywa się w wyniku różnego powinowactwa
adsorpcyjnego składników mieszaniny do powierzchni fazy stacjonarnej, zwanej w tym
przypadku adsorbentem,
• podziałową, w której rozdzielanie odbywa się w wyniku różnych wartości
współczynników podziału składników mieszaniny pomiędzy dwie nie mieszające się fazy,
z których jedna jest fazą stacjonarną (ciecz osadzona na nośniku), a druga fazą ruchomą
(gaz, ciecz, płyn w stanie nadkrytycznym),
• jonowymienną, w której podstawą rozdzielania są różnice w sile oddziaływań
międzycząsteczkowych pomiędzy jonami próbki a jonami związanymi z fazą stacjonarną.
Faza stacjonarna zwana jest jonitem – nierozpuszczalna substancja wielkocząsteczkowa
o budowie jonowej zdolna do wymiany jonów zgodnie z równaniami reakcji:
1
Zakład Chemii Analitycznej
(MR- - Y+)j + (X+)r →
(MR- - X+)j + (Y+)r
(MR-+- Y-)j + (X-)r →
(MR+ - X-)j + (Y-)r
Indeks „j” oznacza fazę jonitu, indeks „r” fazę roztworu. Technika ta stosowana jest przede
wszystkim w analizach związków zjonizowanych lub ulegających jonizacji. Substancje
niejonowe można analizować po uprzednim przeprowadzeniu w kompleksy jonowe,
• sitową (żelową, sączenie molekularne), w której o rozdzieleniu składników mieszaniny
decydują rozmiary cząstek.
Chromatografię można podzielić także pod względem techniki eksperymentalnej –
chromatografia kolumnowa i planarna (możliwa tylko w układzie, w którym fazą ruchomą jest
ciecz). Schemat podziału chromatografii przedstawiono na rysunku 1:
Rys.1. Klasyfikacja technik chromatograficznych (Witkiewicz Z., Podstawy Chromatografii, WNT,
Warszawa, 2002)
Możliwość rozdzielania chromatograficznego substancji wynika z faktu,
że poszczególne składniki próbki w niejednakowym stopniu ulegają podziałowi między dwie
nie mieszające się fazy, przy czym jedna z tych faz jest ruchoma (tzw. eluent), a druga stanowi
nieruchome wypełnienie kolumny chromatograficznej (faza stacjonarna). Różnica we
współczynnikach podziału (K) składników mieszaniny pomiędzy fazę ruchomą i fazę
stacjonarną warunkuje rozdzielenie tych substancji. Jeżeli Cs i Cm oznaczają stężenia składnika
odpowiednio w fazie stacjonarnej i ruchomej to współczynnik podziału jest równy ich
ilorazowi (1).
K=Cs/Cm
(1)
K jest wielkością charakteryzującą daną substancję i zależy od fazy stacjonarnej. Między
liczbą cząsteczek związków chromatografowanych, obecnych w fazie ruchomej i nieruchomej,
ustala się równowaga dynamiczna. Naturalne przemieszczanie się substancji rozdzielanych
w kolumnie następuje tylko w fazie ruchomej, tj. za pośrednictwem gazu nośnego
(chromatografia gazowa) lub eluenta (chromatografia cieczowa). Zatem większe wartości K
oznaczają dłuższy czas przebywania w fazie stacjonarnej (większe powinowactwo do fazy
stacjonarnej) i stąd późniejsze opuszczenie kolumny, natomiast te które mają większe
powinowactwo do fazy ruchomej szybciej opuszczają kolumnę i mają niższą wartość
współczynnika podziału.
2
Zakład Chemii Analitycznej
Wielkości retencyjne
Efekt rozdzielenia chromatograficznego wykreślony jest w postaci krzywej elucji
(chromatogramu), przedstawiającego zależność sygnału analitycznego od czasu retencji lub
objętości retencji. Czas retencji oznacza czas przebywania substancji chromatografowanej
w kolumnie.
Całkowity czas retencji, tR, substancji chromatografowanej jest to czas od momentu
zadozowania jej do kolumny do momentu zarejestrowania maksimum piku odpowiadającego
tej substancji. Czas ten jest sumą czasu, w którym substancja oddziałuje na fazą stacjonarną
i czasu, który jest jej potrzebny do przejścia od momentu zadozowania do detektora gdyby
takiego oddziaływania nie było. Dlatego też, substancja, która zupełnie nie oddziałuje
z wypełnieniem fazy stacjonarnej wymaga skończonego czasu na przejście przez kolumnę
od momentu wstrzyknięcia do pojawienia się sygnału na rejestratorze w postaci piku. Czas ten
definiowany jest jako zerowy czas retencji, t0, dawniej zwany też martwym czasem retencji,
tM. Natomiast czas oddziaływania substancji na fazę stacjonarną nazywany jest
zredukowanym czasem retencji, tR', i jest równy różnicy całkowitego czasu retencji
i zerowego czasu retencji (2). Wielkości retencyjne przedstawiono na rysunku 2.
t R' = t R – t 0
(2)
tR2 - tR1
w2
w1
Rys.2. Wielkości retencyjne chromatografowanych substancji 1i 2, tR – całkowity czas retencji, tM –
zerowy czas retencji, w – szerokość piku przy podstawie.(W. Szczepaniak, Metody
instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, 2002)
Czas elucji jest funkcją prędkości fazy ruchomej i objętości eluenta potrzebnej do
wymycia składnika z kolumny, tzw. objętości retencji,VR, (3)
VR=F*tR
(3)
przy czym F jest objętościową prędkością przepływu fazy ruchomej. Iloczyn czasu zerowego
przez prędkość przepływu eluenta daje analogicznie zerową wartość objętość retencji V0 (4).
V0=F*t0
(4)
Zerowa objętość retencji (V0) nie przyczynia się w sposób bezpośredni do rozdziału
i zależy od wymiarów kolumny i wypełnienia. Pewien udział w objętości fazy ruchomej mają
też dozowniki, detektory i łączniki. Stąd poszczególne udziały można określić jako tzw.
udziały kolumnowe i efekty pozakolumnowe. W chromatografii gazowej efekty
pozakolumnowe można często zaniedbać, natomiast w chromatografii cieczowej nie można ich
zlekceważyć. Z tego powodu szczególną uwagę należy zwrócić na konstrukcję detektorów
i dozowników, aby miały jak najmniejszą objętość martwą.
Wykorzystując zmierzone wielkości retencyjne, można wyznaczyć kolejne wielkości
charakteryzujące rozdzielenie chromatograficzne. Jedną z nich jest współczynnik retencji k
(5) (dawniej określany jako współczynnik pojemnościowy). Jest to stosunek czasu, w którym
3
Zakład Chemii Analitycznej
substancja chromatografowana oddziałuje z wypełnieniem fazy stacjonarnej do czasu,
w którym przebywa ona w fazie ruchomej. Współczynnik k określa ile razy dłużej substancja
oddziałująca na fazę stacjonarną, przechodzi przez kolumnę niż gdyby takiego oddziaływania
nie było (substancja przebywałaby tylko w fazie ruchomej).
t −t
t'
k= R 0 = R
(5)
t0
t0
Ogólne zasady rozdzielania
Zrozumienie pojęcia „rozdzielanie” w chromatografii wymaga przede wszystkim
ilościowego określenia stopnia rozdzielenia za pomocą zdolności rozdzielczej RS. Tak jak
powiedziano wcześniej rozdzielenie substancji na kolumnie następuje na skutek ich
zróżnicowanych prędkości migracji. To czy dana faza stacjonarna (lub rozpuszczalnik) może
spowodować rozdzielenie substancji, zależy od termodynamicznych własności układu.
Sprawność rozpuszczalnika można wyrazić ilościowo, posługując się retencją względną α (6)
zwaną też współczynnikiem selektywności lub współczynnikiem rozdzielania.
'
K 2 t R2 t R2 − t 0 k 2
α=
=
=
=
K 1 t R' 1 t R1 − t 0 k1
(6)
Sprawność fazy stacjonarnej określa współczynnik retencji, natomiast sprawność
kolumny chromatograficznej mierzy się dla danej substancji liczbą pólek teoretycznych, N,
w kolumnie. Pod pojęciem półki teoretycznej należy rozumieć najmniejszą objętość kolumny,
w której zostaje osiągnięty stan równowagi pomiędzy stężeniem analitu w fazie ruchomej
i stacjonarnej. Półki teoretyczne są pojęciem umownym, ponieważ kolumna nie zawiera
niczego, co mogłoby przypominać fizyczne półki destylacyjne czy inne podobne elementy.
Zależność (7) podaje jeden ze sposobów wyznaczenia liczby półek teoretycznych, przy
założeniu że pik pochodzący od substancji ma kształt krzywej Gaussa.
⎛t ⎞
N = 16 ∗ ⎜ R ⎟
⎝w⎠
2
(7)
Często podawana jest efektywna liczba pólek teoretycznych (8), gdzie udział efektów
pozakolumnowych na jej wartość został zminimalizowany.
N ef
⎛t −t ⎞
= 16 ∗ ⎜ R 0 ⎟
⎝ w ⎠
2
(8)
Wysokość równoważna półce teoretycznej, HETP (ang. height equivalent to a theoretical
plate), jest zdefiniowana za pomocą równania 9. Pod pojęciem HETP należy rozumieć
najmniejszą wysokość kolumny, w której zostaje osiągnięty stan równowagi pomiędzy
stężeniem substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i stacjonarnej.
HETP =
L
N
(9)
Zdolność rozdzielczą pików, RS, wyznaczamy w oparciu o równanie (10). Zazwyczaj
podaje się zdolność rozdzielczą dla dwóch składników, które są najmniej dobrze rozdzielone.
Zdolność rozdzielcza dla pozostałych par składników jest tak samo dobra o ile nie lepsza jak ta
podana.
4
Zakład Chemii Analitycznej
⎛ t R 2 − t R1
RS = 2 ∗ ⎜⎜
⎝ w1 + w2
⎞
⎟
⎟
⎠
(10)
Rozdzielczość, RS, można wyrazić za pomocą współczynnika retencji (k), współczynnika
selektywności (α) i liczby pólek teoretycznych (N). Zależność tą opisuje równanie (11), przy
czym indeks 2 dotyczy składnika dłużej zatrzymywanego na kolumnie.
RS =
1 ⎛ α −1⎞ ⎛ k2
∗⎜
⎟∗⎜
4 ⎝ α ⎠ ⎜⎝ 1 + k 2
⎞
⎟⎟ * N 2
⎠
(11)
APARATURA
Do wykonania analiz techniką chromatografii cieczowej kolumnowej służy
chromatograf cieczowy. Schemat blokowy chromatografu cieczowego przedstawiono
na rysunku 3.
Rys.3. Schemat blokowy chromatografu cieczowego (1- zbiornik fazy ruchomej, 2-filtr, 3-pompa,
4-manometr, 5-dozownik, 6-kolumna, 7-termostat, 8-detektor, 9-wzmacniacz, 10-komputer,
11-automatyczny podajnik próbek, 12-kolektor frakcji) (W. Szczepaniak, Metody
instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, 2002)
Ze zbiornika lub zbiorników pompą tłoczy się do kolumny, wypełnionej faza
stacjonarną, fazę ruchomą. Kolumna zazwyczaj jest umieszczona w termostacie w celu
utrzymania stałej temperatury w procesu separacji. Między pompą a kolumną znajduje się
dozownik, który umożliwia wprowadzenie próbki do układu. Na kolumnie składniki próbki są
rozdzielane i na wyjściu z niej są wykrywane przez detektor. Sygnał elektryczny z detektora
jest rejestrowany za pomocą komputera lub już coraz rzadziej - integratora w postaci piku
chromatograficznego.
Pompy
Pompa w chromatografie cieczowym zapewnia przepływ fazy ruchomej przez
wypełnienie kolumny, które stawia duży opór. Parametry, które ważne są przy konstruowaniu
pomp to: zakres objętościowego wydatku, maksymalne ciśnienie robocze, odtwarzalność
wydatku objętościowego, zakres pulsacji wydatku. Obecnie używane są pompy
stałociśnieniowe i stałoprzepływowe. Pompy stałoprzepływowe używane są znacznie częściej
ze względu na utrzymanie stałej prędkości przepływu niezależnie od składu fazy ruchomej. Ich
5
Zakład Chemii Analitycznej
główną wadą jest możliwość pulsacji co skutkuje zmianami w linii podstawowej
chramatogramu i możliwość spadku czułości detektora. Ciśnienie, które jest wytwarzane przez
pompę tłokową (rodzaj pompy stałoprzepływowej) może wynosić nawet 50 MPa.
Dozownik
Dozownik pozwala na wprowadzenie próbki pod ciśnieniem atmosferycznym do
kolumny gdzie ciśnienie może sięgać kilkudziesięciu MPa. W chromatografii
niskociśnieniowej podobnie jak w chromatografii gazowej używane są dozowniki
membranowe. W wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej w celu wprowadzenia próbki
do kolumny skonstruowano zawory dozujące z pętlami dozującymi o różnej objętości. Próbka
do pętli dozującej jest wprowadzana za pomocą strzykawki. Możliwe jest automatyczne
podawanie próbek do kolumny za pomocą automatycznego podajnika próbek.
Kolumny i ich wypełnienie
Kolumna jest to rurka, wykonana ze stali nierdzewnej, rzadziej ze szkła czy polimerów,
zakończona filtrami i zaopatrzoną w końcówki umożliwiające podłączenie do detektora
i dozownika. Wewnątrz rurki znajduje się faza stacjonarna, dzięki której możliwy jest proces
rozdzielania. Długość kolumny nie przekracza 25 cm, obecnie coraz częściej stosowane są
kolumny krótsze – 10 cm, 15 cm. Średnica kolumny zazwyczaj wynosi 4,6 mm ale używane są
też o innych średnicach np. 1 mm czy 3,5 mm. Wybór parametrów kolumny decyduje
o parametrach rozdzielenia np. liczbie pólek teoretycznych. Jednak dużo ważniejszy jest
odpowiednie dobranie wypełnienia kolumny, które warunkuje rozdzielenie składników próbki.
Jako fazy stacjonarne w chromatografii adsorpcyjnej stosowane są sorbenty powierzchniowoporowate, jak również zapewniające wyższą sprawność i pojemność sorpcyjna sorbenty
objętościowo-porowate. Wypełnienia mogą mieć różny stopień polarności. Jeżeli faza
stacjonarna jest polarna to wtedy faza ruchoma powinna być od niej mniej polarna.
Faza ruchoma (eluent)
Wybór odpowiedniej fazy ruchomej decyduje o powodzeniu procesu rozdzielania. Fazę
ruchomą może stanowić pojedynczy rozpuszczalnik albo mieszanina dwóch lub trzech
rozpuszczalników. Rozpuszczalniki stosowane w wysokosprawnej chromatografii cieczowej
muszą spełniać szereg wymagań. Powinny charakteryzować się wysoką czystością, powinny
być trwałe w warunkach procesu chromatograficznego, nie mogą wchodzić w reakcje ze
składnikami próbki jak i z fazą stacjonarną, muszą umożliwiać detekcje składników próbki.
Skład eluentu podczas procesu chromatograficznego może być stały – mówimy wtedy o elucji
izokratycznej albo może następować skokowa lub stała zmiana składu eluentu w czasie trwania
analizy. Taki sposób prowadzenia procesu chromatograficznego nosi nazwę elucji
gradientowej i pozwala na modyfikacje siły elucyjnej eluentu w trakcie analizy co może
prowadzić do poprawy jakości rozdzielenia składników próbki.
Detektory
Za pomocą detektora wykrywane są substancje opuszczające kolumnę. W chromatografii
cieczowej stosuję się różne detektory umożliwiające wykrycie badanych związków np.
detektor fluorescencyjny, detektor z matrycą diod, detektory elektrochemiczne. Detektory
powinny charakteryzować się dużą czułością tzn. sygnał pochodzący od wykrywalnego
składnika powinien być jak największy. Ilościowo czułość detektora opisuje stosunek
przyrostu sygnału do przyrostu stężenia. Detektor charakteryzuje także granica wykrywalności,
która stanowi najniższe stężenie składnika jakie detektor jest w stanie wykryć. Detektor
powinien charakteryzować się dużą stabilnością linii podstawowej na chromatogramie oraz
sygnał z detektora musi być odtwarzalny dla takich samych ilości oznaczanych substancji.
Kolejną cecha charakteryzującą detektor jest zakres jego liniowości, który powinien być
szeroki.
6
Zakład Chemii Analitycznej
LITERATURA OBOWIĄZUJĄCA
1. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, 2004, str.255269, 301-320
2. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, WNT, 2002, str. 124-142, 153-224
ZAGADNIENIA DO KOLOKWIUM
1-4. Wyjaśnij pojęcia (każdy student będzie musiał zdefiniować na kolokwium dwa z pośród
wymienionych pojęć):
a. chromatografia
b. całkowity czas retencji
c. zerowy czas retencji
d. zredukowany czas retencji
e. objętość retencji
f. współczynnik retencji
g. współczynnik selektywności
h. wysokość równoważna półce teoretycznej
i. szereg eluotropowy
j. eluent
k. faza stacjonarna
l. moc elucji
m. chromatogram
n. chromatografia w normalnym układzie faz
o. chromatografia w odwróconym układzie faz
5. Jakie wymagania muszą spełniać rozpuszczalniki używane jako fazy ruchome
w chromatografii cieczowej?
6. Wymień detektory stosowane w chromatografii cieczowej i wyjaśnij zasadę działania
dwóch wybranych.
7. Wymień kolejno elementy chromatografu cieczowego i wyjaśnij jakie zadanie
spełniają. .
8. Dokonaj podziału metod chromatograficznych ze względu na stosowane układy faz.
Jakie zjawisko stanowi podstawę procesu chromatograficznego w danym układzie faz.
9-12. Techniką HPLC rozdzielano substancję A, B, C na kolumnie o długości 20 cm.
Przepływ fazy ruchomej wynosił 0,5 ml*min-1. Czasy retencji pików tR i szerokości pików w
wynoszą:
Substancja
A
B
C
t0
tR [min]
5,4
13,4
16,2
2,0
Oblicz:
a) liczbę półek teoretycznych, N
b) współczynnik retencji, k (dla składnika B)
c) zdolność rozdzielczą dla pików A i B
d) współczynnik selektywności, α
7
w [min]
0,4
0,8
1
Zakład Chemii Analitycznej
CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest rozdzielenie mieszaniny leków psychotropowych (amitryptylina,
nortryptylina, imipramina, dezypramina) oraz ich analiza ilościowa.
PRZYRZĄDY, NACZYNIA, ODCZYNNIKI
• wysokosprawny chromatograf cieczowy, LaChrom, Merck, USA
• kolumna RP SelectB o długości 12,5 cm, średnicy 4,6 mm, średnica ziarna 5 µm
• acetonitryl
• bufor fosforanowy pH=7,1 (10mM K2HPO4)
• metanolowe roztwory poszczególnych leków (stężenie 1mg/ml)
• metanolowy roztwór lorazepamu o stężeniu 10mg/ml (wzorzec wewnętrzny)
SPOSÓB WYKONANIA
• Przygotować roztwór lorazepamu o stężeniu 0,5 mg/ml w mieszaninie acetonitrylu i buforu
fosforowego pH=7,1 (1:1 v/v)
• Przygotować próbkę zawierającą wzorce badanych leków w stężeniu 5µg/ml.
(Pobrać do fiolki 5µl każdego roztworu leku psychotropowego o stężeniu 1mg/ml, odparować
do sucha, rozpuścić w 1ml przygotowanego roztworu lorazepamu).
• Przygotować próbki wzorców leków o stężeniach 2,5 µg/ml oraz 1,25 µg/ml poprzez
kolejne rozcieńczenia roztworu wyjściowego o stężeniu 5µg/ml.
• Przeprowadzić analizę chromatograficzną wzorców stosując program elucji gradientowej,
prędkość przepływu fazy ruchomej 2ml/min, objętość próbki wprowadzonej do kolumny
10µl.
Czas[min.] Faza wodna (%) Acetonitryl (%)
0
45
55
8
45
55
15
35
65
18
35
65
20
45
55
25
45
55
•
•
•
Przeprowadzić analizę chromatograficzną próbki otrzymanej od asystenta stosując te same
warunki chromatograficzne co przy analizie wzorców.
Zidentyfikować rozdzielane związki w próbkach wzorców leków poprzez porównanie
widm adsorpcyjnych w zakresie UV substancji wzorcowych oraz sporządzić wykres
krzywej kalibracyjnej.
Zidentyfikować substancje w próbce oraz podać ich stężenie.
OPRACOWANIE RAPORTU
•
•
Na podstawie zarejestrowanych chromatogramów wyznaczyć parametry opisujące układ
chromatograficzny: selektywność (α), zdolność rozdzielczą Rs, sprawność kolumny
(HETP, N).
Dokonać identyfikacji substancji w analizowanej próbce i ich analizy ilościowej (wykreślić
krzywe kalibracyjne dla poszczególnych leków).
8