otwórz w PDF

Zakład Chemii Analitycznej
PROBLEMATYKA:
Oznaczanie substancji czynnej w próbce z zastosowaniem spektroskopii
rozproszenia Ramana
TEMAT ĆWICZENIA:
OZNACZANIE GLUKOZY W PREPARATACH
FARMACEUTYCZNYCH I PŁYNACH USTROJOWYCH
METODA:
Spektroskopia rozproszenia Ramana
WPROWADZENIE
Spektroskopia optyczna jest nauką zajmującą się badaniem oddziaływania
promieniowania elektromagnetycznego z materią. Oddziaływanie to polega na absorpcji,
emisji, bądź rozpraszaniu promieniowania. Do tych ostatnich metod należy spektroskopia
rozproszenia Ramana, będąca metodą umożliwiającą badania przejść pomiędzy poziomami
rotacyjnymi i oscylacyjnymi cząsteczek zachodzącymi na skutek nieelastycznego rozproszenia
światła. Obserwowanym efektem owego nieelastycznego rozproszenia światła przez
cząsteczki jest widmo ramanowskie. Widmo ramanowskie umożliwia detekcję substancji
badanej i analizę jej struktury. W przypadku kalibracji metody - spektroskopia ramanowska
służyć może także do ilościowego oznaczania substancji w próbce.
Spektroskopia rozproszenia Ramana
Efekt nieelastycznego rozpraszania światła został opisany przez A. Smekala w 1923
roku i rozwinięty w postaci kwantowomechanicznej teorii rozpraszania przez Diraca w roku
1927. W roku 1928 hinduski fizyk C.V. Raman potwierdził doświadczalnie jego istnienie w
oparciu o wyniki badań benzenu. Za to odkrycie przyznano mu w 1930 roku Nagrodę Nobla w
dziedzinie fizyki.
U podstaw rozproszenia Ramana leży wzbudzenie rotacji lub oscylacji molekuły
poprzez oświetlenie próbki światłem (0) z zakresu ultrafioletowego, widzialnego lub bliskiej
podczerwieni. W wyniku oddziaływania „molekuła – fala elektromagnetyczna” obserwuje się
rozproszone światło o tej samej energii (rozproszenie Rayleigha) oraz dyskretne składowe o
innej, niż wzbudzające promieniowanie, liczbie falowej (rozproszenie Ramana) (Rys. 1).
A zatem w widmie oscylacyjnym obecne są położone symetrycznie względem pasma
Rayleigha nowe linie o częstości równej 0  vib (pasma ramanowskie), gdzie vib odpowiada
częstości przejść pomiędzy oscylacyjnymi poziomami danej molekuły. Należy podkreślić, iż
wielkość przesunięcia pasm ramanowskich względem rayleighowskiego nie zależy od
częstości promieniowania wzbudzającego, a wynika wyłącznie z właściwości cząsteczek
rozpraszających. Pasma ramanowskie o częstości mniejszej 0 - vib niż ta dla światła
wzbudzającego, nazywane są pasmami stokesowskimi, a te przy 0 + vib pasmami
antystokesowskimi. Intensywność rozpraszania Rayleigha jest ok. 103, a Ramana 106-107
razy mniejsza od intensywności promieniowania wzbudzającego. Dodatkowo, jak wynika z
rozkładu Boltzmana, pasma antystokesowskie są mniej intensywne w porównaniu z pasmami
stokesowskimi. Stąd, w większości metod spektroskopii rozproszenia Ramana, pomiar
dotyczy jedynie części stokesowskiej widma ramanowskiego przedstawionej w skali
1
Zakład Chemii Analitycznej
względnych wartości częstości (wyrażonych w cm–1, tzw. przesunięcie ramanowskie) w
zakresie od 4000 do 0 cm-1. Tak wyrażone widmo ramanowskie odpowiada skali częstości
widma absorpcyjnego w podczerwieni, co ułatwia z kolei porównanie tych komplementarnych
względem siebie metod spektroskopowych.
E
wzbudzony stan
elektronowy
stany
wirtualne
padający
foton
1
0
rozproszenie
Ramana
(stokesowskie )
rozproszenie
Rayleigha
h0 - hvib
h 0
rozproszenie
Ramana
(antystokesowskie)
h0 + h vib
h vib
podstawowy stan
elektronowy
Rys. 1. Diagram energetyczny przejść pomiędzy oscylacyjnymi poziomami dla rozproszenia Rayleigha
i Ramana.
Metodą rozproszenia Ramana można badać związki we wszystkich stanach skupienia, a
więc gazy, ciecze, roztwory (w tym wodne), pasty, ciała stałe jako proszki mikrokrystaliczne,
czy też monokryształy w szerokim przedziale temperatur i ciśnień. Pomiar widm
ramanowskich nie wymaga zastosowania skomplikowanych procedur przygotowania próbek,
jak również nie wymagane są również specjalnego rodzaju naczyńka pomiarowe. W
technikach, gdy nie używa się mikroskopu, badane substancje mogą być umieszczane w ilości
około miligrama w kapilarach (najczęściej szklanych) przeźroczystych dla promieniowania
wzbudzającego lub bezpośrednio eksponowane na działanie promieniowania w dowolnie
zaprojektowanym naczyńku. Niewątpliwą zaletą spektroskopii ramanowskiej jest możliwość
jej zastosowania dla próbek w roztworach wodnych (szczególnie przydatne dla próbek
biologicznych).
Metody spektroskopowe pozwalają na identyfikację związków w oparciu o ich
charakterystyczne pasma widoczne w widmach ramanowskich i w widmach absorpcji w
podczerwieni. W przypadku próbek biologicznych, czy mieszanin identyfikację substancji
można przeprowadzać przez porównanie otrzymanego widma z widmem standardu.
Spektroskopia Ramana jako metoda ilościowa
W dwuwiązkowych spektrometrach FT-IR i UV/vis intensywność pasm w widmie jest
zdefiniowana prawem Beera-Lamberta-Bouguera, z którego wynika, iż intensywność pasma,
określona przez całkę jego powierzchni, jest wprost proporcjonalna do stężenia i grubości
badanej próbki. Wynika z tego, iż intensywności pasm dla próbek o założonej grubości i
danym stężeniu, analizowanych na różnych spektrometrach FT-IR lub UV/vis, są takie same
(zakładając tą samą rozdzielczość, anodyzację i inne podstawowe parametry pomiaru).
Oznacza to, iż intensywność pasma jest w spektroskopii IR lub UV/vis funkcją próbki
niezależną od innych parametrów pomiarowych, a na osi rzędnych znajduje się
absorbancja/transmitancja, opisana w jednostkach bezwzględnych. W spektroskopii
2
Zakład Chemii Analitycznej
ramanowskiej detekcji podlega ilość rozproszonych fotonów, zależna od licznych czynników,
co sprawia, iż intensywność rozpraszania musi być wyrażona w jednostkach bezwzględnych.
Intensywność rozproszenia zależy np. od mocy lasera, jej fluktuacji, długości fali
wzbudzającej, orientacji próbki i nie jest prostą funkcją stężenia i grubości próbki. W
ramanowskiej spektroskopii dyspersyjnej intensywność pasma zależy także od czasu
skanowania próbki. W tym sensie zastosowanie spektroskopii Ramana do pomiarów
ilościowych jest utrudnione i wymaga każdorazowej kalibracji metody na instrumencie,
używanym do pomiaru próbki badanej oraz zachowania tych samych parametrów
pomiarowych (mocy lasera, zogniskowania lasera na próbce, rozdzielczości widmowej,
orientacji próbki, długości drogi optycznej) i wówczas intensywność rozpraszania staje się
liniową funkcją stężenia próbki. Znacznie prostsze jest także przeprowadzenie analiz
ilościowych dla próbek homogenicznych, np. w postaci roztworów, gdyż eliminowane są
wówczas efekty związane z wielkością i kształtem ziaren w ciele stałym. Wzmiankowaną już
ogromną zaletą spektroskopii ramanowskiej jest możliwość pomiaru próbek w postaci
roztworów wodnych ze względu na fakt, iż woda słabo rozprasza promieniowanie na sposób
ramanowski. Umożliwia to oznaczanie związków w płynach ustrojowych np. leków oraz ich
metabolitów.
Fourierowski spektrometr ramanowski
Zasadniczymi elementami Fourierowskiego spektrometru ramanowskiego są: laser,
komora pomiarowa, interferometr oraz detektor.
Wyraz „laser“ jest skrótem pełnej angielskiej nazwy mechanizmu jego działania: Light
Amplification by Stimulated Emission of Radiation - wzmocnienie światła przez wymuszoną
emisję promieniowania. Ośrodkiem czynnym lasera może być kryształ (np. rubin),
półprzewodnik (arsenek galu), czy gaz (np. krypton). Ośrodek czynny lasera jest aktywowany
(„pompowany”) przez zewnętrzne źródło promieniowania. W ośrodku czynnym lasera
wytwarzany jest w ten sposób stan inwersji obsadzeń i następuje emisja spontaniczna (we
wszystkich kierunkach). Fotony o pewnym kierunku biegu są wzmacniane w efekcie
wielokrotnego odbicia przez układ dwóch zwierciadeł, z których jedno jest nieprzepuszczalne
(współczynnik odbicia R  100%), drugie – częściowo przepuszczalne (R  95 %).
Wzmocnione promieniowanie jest wyprowadzane na zewnątrz przez częściowo
przepuszczalne zwierciadło. Takie promieniowanie cechuje się dużą monochromatycznością,
dużą gęstością promieniowania i jest spolaryzowane, tzn. składowa elektrycznej fali
elektromagnetycznej jest falą płaską.
W spektrometrach fourierowskich stosuje się najczęściej laser Nd:YAG (granat
itrowo-glinowy z domieszką jonów neodymu Nd3+; Y3Al5O12+Nd2O3) chłodzony powietrzem
lub wodą, o mocy rzędu jednego wata, pracujący w sposób ciągły w zakresie bliskiej
podczerwieni, =1064 nm.
Badana próbka może mieć dowolny stan skupienia, zazwyczaj umieszczana jest w
szklanej lub kwarcowej kapilarze. Monokryształ można umieścić bezpośrednio na drodze
wiązki promieniowania wzbudzającego. Minimalna ilość próbki jest rzędu mg. W typowych
rozwiązaniach 50% promieniowania jest odbijane przez płytkę, a 50% przechodzi przez nią.
Interferometr Michelsona (Rys. 2) jest urządzeniem, które dzieli wiązkę
promieniowania na dwie wiązki o prawie równej mocy, a następnie rekombinuje je w taki
sposób, że zmiany intensywności wiązki kombinowanej mogą być mierzone jako funkcja
różnicy dróg optycznych obu wiązek. Wiązka promieniowania rozproszonego (P) pada na
tzw. płytkę dzieląca (BS, ang. beam splitter), która transmituje w przybliżeniu połowę
promieniowania, odbijając pozostałą cześć pod katem 90°. Powstałe w ten sposób
„bliźniacze” wiązki są odbijane od luster, w których jedno jest nieruchome (LN), a drugie
3
Zakład Chemii Analitycznej
ruchome (LR). Wiązki spotykają się znów na płytce dzielącej, która kieruje promieniowanie
na próbkę i detektor (D). Poziomy ruch ruchomego zwierciadła umożliwia zarejestrowanie
interferogramu, a rejestrowane natężenie promieniowania zależy od różnicy dróg optycznych
wiązek (maksymalne jest gdy zwierciadła znajdują się w takiej samej odległości od płytki
dzielącej).
L
N
L
R
B
S
P
R
D
Rys. 2. Schemat budowy interferometru Michelsona.
W spektrometrach fourierowskich stosuje sie detektory InGaAs pracujące w
temperaturze pokojowej lub bardzo czułe detektory germanowe działające w temperaturze
ciekłego azotu.
Intensywność rozpraszania ramanowskiego zależy od czwartej potęgi częstości
promieniowania padającego 0. Oznacza to, że najsilniejsze rozpraszanie ramanowskie
uzyskujemy stosując do wzbudzeń lasery z zakresu UV (krótkie fale = wysokie częstości), zaś
najsłabsze dla zakresu IR (długie fale = niskie częstości).
Zastosowanie w spektrometrach fourierowskich laserów Nd:YAG pracujących w
zakresie podczerwieni powoduje „ucieczkę” od fluorescencji (w tym zakresie promieniowania
nie obserwuje się przejść elektronowych), ale intensywność światła rozproszonego jest
zredukowana poprzez wspomniany czynnik 04. Zastosowanie interferometru powoduje
jednak częściową kompensację tego zjawiska, gdyż brak szczeliny daje wzmocnienie sygnału
o około 2 rzędy wielkości w porównaniu do spektrometrów dyspersyjnych. Stosowanie lasera
Nd:YAG w spektrometrach fourierowskich implikuje też możliwości detekcji
promieniowania rozproszonego. Dla tego zakresu widmowego nie mogą być stosowane
wielokanałowe, czułe detektory CCD (używane często w spektrometrach dyspersyjnych),
wykorzystuje się natomiast detektory Ge lub InGaAs, które niestety charakteryzują się
wyższym szumem i niższą czułością.
Glukoza
Glukoza jest monosacharydem (cukrem prostym), zawierającym sześć atomów węgla
w cząsteczce (heksoza) i ugrupowanie aldehydowe (aldoza). Wzór strukturalny D-glukozy
przedstawiony jest na rys. 3.
4
Zakład Chemii Analitycznej
1
2
3
4
5
6
H
H
HO
H
H
O
OH
H
OH
OH
CH 2OH
a
CH 2OH
OH
H
H
OH
H
HO
OH
H
OH
CH 2OH
O OH
H
H
OH
H
HO
H
H
OH
b
c
Rys. 3. Wzory strukturalne D-glukozy: forma łańcuchowa otwarta (a) oraz formy pierścieniowe: -Dglukopiranoza (b) oraz  -D-glukopiranoza (c).
W roztworze, także wodnym, glukoza występuje głównie w postaci hemiacetalu, tj.
struktury pierścieniowej (Rys. 3b, c). Hemiacetal powstaje w wyniku reakcji grupy
aldehydowej atomu węgla C1 z grupą hydroksylową atomu węgla C5. W przypadku D-glukozy
w wyniku takiej reakcji powstają dwa produkty: - i -D-glukopiranoza, które w roztworze
wodnym występują w równowadze z formą otwartą.
Cukrzyca (diabetes mellitus) jest schorzeniem, charakteryzującym się zwiększonym
wydzielaniem glukozy przez wątrobę i jej zmniejszonym pobieraniem przez inne organy.
Rozróżnia się dwa podstawowe typy tej choroby: typ I, oraz typ II. W przypadku cukrzycy
typu I, w rezultacie uszkodzenia komórek beta wysepek Langerhansa trzuski, następuje defekt
produkcji insuliny. Cukrzyca typu II, o niejasnej etiologii, jest związana z nabywaniem
odporności na insulinę (insulinoodporność). W pierwszej fazie choroby następuje wzrost
wydzielania insuliny, a następnie jej wydzielanie maleje na skutek zniszczenia nadmiernie
obciążonych komórek beta wysepek Langerhansa. W obu przypadkach charakterystycznym
objawem jest hiperglikemia, a podstawowym sposobem leczenia jest insulinoterapia,
polegająca na podawaniu chorym preparatów insuliny. Niewłaściwe dawki tego leku, lub
innych środków powodujących wydzielanie insuliny, a także inne przyczyny np. spożycie
alkoholu lub znaczny wysiłek mogą prowadzić do hipoglikemii, czyli stanu w którym ilość
glukozy we krwi (poza żyłą wrotną) spada poniżej 55 mg dL-1 (3,0 mmol L-1). W przypadku
lekkiej hipoglikemii stan ten można znieść przez podanie choremu słodkiego napoju (np. sok,
naturalnie słodzony napój) lub glukozy/sacharozy w formie krystalicznej (5-20 g). W
przypadkach ciężkiej hipoglikemii (w stanach utraty przytomności) podaje się 20% roztwór
glukozy dożylnie, a następnie wlewnie 10% roztwór glukozy. Ponadto glukoza jest związkiem
wspomagającym w wielu preparatach, np. Gastrolit, Litorsal, Orgalit, Glucardiamid.
ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA
1.
Omów rozpraszanie światła na sposób Rayleigha.
2.
Omów rozpraszanie światła na sposób Ramana.
3.
Omów krótko sposób oznaczenia glukozy w kroplówce.
4.
Omów różnicę między cukrzycą typu I i II.
5.
Naszkicuj i wyjaśnij diagram energetyczny przejść między oscylacyjnymi poziomami
energetycznymi dla elastycznego i nieelastycznego rozproszenia światła.
6.
Określ, jakie wielkości znajdują się na osi odciętych i rzędnych w widmie
ramanowskim. W jakich najczęściej podaje się je jednostkach?
7.
Wymień i krótko
ramanowskiego.
omów
części
5
składowe
fourierowskiego
spektrometru
Zakład Chemii Analitycznej
8.
Omów zasadę identyfikacji glukozy w widmie ramanowskim mieszaniny glukozy z
wodą. Wymień po dwa charakterystyczne pasma mogące służyć do identyfikacji wody
i glukozy.
9.
Omów trzy istotne różnice między ramanowskim spektrometrem dyspersyjnym, a
spektrometrem fourierowskim.
10.
W wyniku kalibracji oznaczenia glukozy otrzymano następujące dane:
-1
Stężenie (mol L )
Intensywność integralna (j.wzg.)
0.0
0.0
0.2
12
0.4
23
0.6
35
0.8
43
1.0
51
W wyniku oznaczenia otrzymano intensywność integralną pasma glukozy równą 28
jednostek względnych. Używając jedynie kalkulatora prostego, oblicz stężenie glukozy
w badanym roztworze. Podaj kolejne kroki obliczeń.
11.
Wymień dwie najważniejsze zalety i dwie wady spektroskopii ramanowskiej jako
metody ilościowej.
12.
Wyobraź sobie, ze badasz roztwór glukozy w wodzie z użyciem spektroskopii
ramanowskiej. Wymień cztery czynniki zewnętrzne od których istotnie zależy
intensywność pasm w otrzymanym widmie ramanowskim.
LITERATURA
1.
2.
3.
Z. Kęcki: Podstawy spektroskopii molekularnej, PWN, Wa-wa, 1992, rozdz. 3.4, 92107.
A. Cygański: Metody spektroskopowe w chemii analitycznej, WNT, W-wa 2009,
rozdz. 3.7, 264-266.
F.J. Holler, A.D. Skoog, S.R. Crouch: Principles of experimental analysis,
Brooks/Cole Cengage Learning, Belmont, USA, 2007, rozdz. 18, 481-493.
6
Zakład Chemii Analitycznej
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest detekcja i oznaczenie glukozy w farmaceutykach lub płynach
ustrojowych, a także utrwalenie wiedzy o spektroskopii Ramana i możliwości stosowania tej
techniki jako metody ilościowej.
PRZYRZĄDY, NACZYNIA I ODCZYNNIKI
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
kolbki miarowe
tryskawki
pipety automatyczne
kuweta pomiarowa
waga analityczna
spektrometr FT-ramanowski, np. Bruker MultiRAM oraz odpowiednie
oprogramowanie, np. OPUS Bruker
glukoza cz. d. a
tabletki/kroplówki zawierające glukozę np. Gastrolit, Litorsal, Orgalit, Glucardiamid lub
płyny ustrojowe.
SPOSÓB WYKONANIA
1. Przygotowanie roztworów i wykonanie pomiarów
Ćwiczenie polega na pomiarze widm ramanowskich roztworów wodnych glukozy o
znanych stężeniach, a następnie pomiarze widma badanego płynu ustrojowego bądź roztworu
wodnego badanego leku. Widma zostaną zarejestrowane przy pomocy spektrometru Bruker
MultiRAM. Spektrometr jest wyposażony w laser Nd:YAG emitujący promieniowanie o
długości 1064 nm oraz detektor germanowy chłodzony ciekłym azotem.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Włączyć komputer i odpowiednie oprogramowanie (Opus).
Uruchomić laser.
W naczyńku pomiarowym umieścić glukozę.
Ustawić (dobrać) parametry pomiarowe: moc lasera, rozdzielczość oraz liczbę
skanów.
Zogniskować laser na próbce wzorca, zaobserwować interferogram dla glukozy.
Wykonać pomiar widma ramanowskiego glukozy.
Na wadze analitycznej odważyć około 1,2 grama glukozy.
Przenieść ilościowo odważkę do zlewki i rozpuścić w 4 ml wody destylowanej.
Pobrać 2 ml tak przygotowanego roztworu, przenieść ilościowo do czystej kolby i
rozcieńczyć wodą destylowaną w stosunku 2:1
Czynność opisaną w punkcie 9 powtórzyć czterokrotnie, aby otrzymać ostatecznie pięć
roztworów glukozy w wodzie destylowanej.
Zmienić przystawkę pomiarową na przystawkę służącą do pomiaru cieczy.
Dwukrotnie przemyć kuwetę pomiarową niewielką ilością roztworu glukozy.
Przenieść 500 µl roztworu do kuwety pomiarowej.
Umieścić kuwetę pomiarową w spektrometrze.
7
Zakład Chemii Analitycznej
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Dobrać odpowiednie parametry pomiarowe: moc lasera, rozdzielczość widmową,
liczbę skanów oraz zogniskować laser na próbce.
Wykonać widmo Ramana roztworu glukozy.
Punkty 12-16 powtórzyć dla wszystkich roztworów.
W przypadku farmaceutyku w postaci ciała stałego należy rozpuścić go w niewielkiej,
ale ściśle określonej ilości wody destylowanej.
Przemyć trzykrotnie kuwetę pomiarową wodą destylowaną, a następnie trzykrotnie
niewielką ilością badanego roztworu (farmaceutyku w postaci roztworu,
rozpuszczonego w wodzie farmaceutyku lub płynu ustrojowego).
Powtórzyć punkty 13-16.
2. Obróbka otrzymanych danych
W drugiej części ćwiczenia zostanie przeprowadzona analiza otrzymanych wyników. W
czasie pomiaru otrzymano zestaw widm ramanowskich roztworów kalibracyjnych oraz widm
roztworów badanych. Wartość intensywności integralnej wybranego pasma w roztworach
kalibracyjnych zostanie wykreślona w funkcji stężenia roztworów, i tak wykonana krzywa
kalibracyjna posłuży następnie do obliczenia stężenia glukozy w roztworze (roztworach)
badanych.
1.
2.
3.
4.
Znaleźć odpowiednie pasmo markerowe dla glukozy i przeprowadzić całkowanie jego
powierzchni we wszystkich otrzymanych widmach, stosując we wszystkich
przypadkach tę samą metodę i te same granice całkowania.
Wykreślić zależność Iint(c) i obliczyć parametry prostej Iint= ac+b stosując metodę
regresji liniowej.
Obliczyć błędy oszacowania parametrów a i b oraz współczynnik korelacji prostej.
Na podstawie otrzymanego równania obliczyć stężenie glukozy w badanym roztworze
(roztworach).
OPRACOWANIE WYNIKÓW
1.
2.
3.
Na podstawie otrzymanych widm odczytać położenia pasm charakterystycznych dla
glukozy.
W oparciu o dane literaturowe, szczególnie tabele charakterystycznych częstości,
dokonać przypisania głównych pasm w widmie glukozy (należy podać odnośniki do
źródeł literaturowych z jakich korzystano).
Przedstawić otrzymane dane w postaci tabeli:
Tabela 1. Przypisanie drgań harmonicznych do pasm ramanowskich glukozy.
-1
Przesunięcie ramanowskie (cm )
4.
Przypisanie
Zamieścić obliczenia konieczne do określenia stężenia glukozy w badanej
próbce/próbkach (patrz ANALIZA OTRZYMANYCH DANYCH):
a. przedstawić dane pomiarowe w postaci tabeli:
8
Zakład Chemii Analitycznej
Tabela 2. Zależność intensywności integralnej pasma markerowego glukozy od stężenia roztworu.
-1
Stężenie (mol L )
Intensywność integralna (j. wzg.)
b. zamieścić wykres Iint(c)
c. podać parametry wykresu a i b, błędy ich oszacowania oraz współczynnik korelacji
prostej
d. zanotować obliczoną wartość stężenia badanego roztworu (roztworów).
5.
Porównać stężenie glukozy z wartością odniesienia, podaną przez asystenta.
6.
Obliczyć błąd względny pomiaru.
7.
Na podstawie otrzymanych wyników przedyskutować użyteczność metody do
oznaczania substancji czynnej w próbce rozważając zarówno wady, jak i zalety
zastosowanej metody.
9