Streszczenie Wstęp

Streszczenie
Celem niniejszej pracy badawczej było dokonanie analizy aktywności proteolitycznej
soków z Ananas comosus oraz Actinidia deliciosa cv. Hayward oraz wpływu temperatur na
aktywność enzymatyczną zawartych w nich proteaz, bromelainy owocowej i aktynidyny,
znajdujących się odpowiednio w soku z Ananas comosus oraz z Actinidia deliciosa cv.
Hayward, a także porównanie temperatur, w jakich zachodzi ich inaktywacja termiczna. Jako
materiału do trawienia enzymami, zawartymi w wymienionych sokach, wybrałem spożywczą
żelatynę wieprzową. Przeznaczone do badań owoce, dziewięć A. deliciosa i trzy A. comosus,
zostały kupione dzień przed rozpoczęciem badań.
Badania laboratoryjne przeprowadziłem w laboratorium Katedry Biologii
Molekularnej i Komórkowej na Międzyuczelnianym Wydziale Biotechnologii UG – GUMed
w Gdańsku.
Przeprowadzone przeze mnie badania wykazały, że:
1. Aktynidyna w soku z A. deliciosa, niepoddanym żadnej obróbce termicznej, a także
po inkubacji w temperaturze 40°C, trwającej odpowiednio 2,5 i 5 minut oraz w temperaturze
50°C, trwającej 2,5 minuty, wykazuje wyższe tempo trawienia żelatyny niż bromelaina
w soku z A. comosus.
2. Inaktywacja termiczna enzymów, zawartych w sokach z A. comosus i A. deliciosa, zależy
zarówno od temperatury inkubacji jak i czasu jej trwania.
3. Proteazy zawarte w soku A. comosus wykazują większą odporność na wysoką temperaturę
niż te zawarte w soku A. deliciosa – po pięciominutowej inkubacji traciły one aktywność
w przedziałach temperatur odpowiednio w próbce z A. comosus: 74 – 76°C
i z A. delciosa: 66 - 68 °C.
4. W przypadku inkubacji trwającej dwie i pół minuty temperatura inaktywacji zawartych
w nich enzymów wynosi dla obu soków powyżej 90 °C.
Wstęp
Proteazami, jakie znajdowały się w sokach, były bromelaina owocowa
(EC 3.4.22.33), obecna w A. comosus oraz aktynidyna (EC 3.4.22.14), która znajduje się
w A. deliciosa. Oba te enzymy należą do grupy proteaz cysteinowych, czyli zdolnych
do hydrolizy wiązania peptydowego w łańcuchu polipeptydowym za aminokwasem
cysteiną. Bromelaina owocowa pochodzi z owocostanu A. comosus i jest białkiem o masie
23 kDa. Oprócz niej w łodydze tej rośliny występują także inne protezy: ananaina
(EC 3.4.22.31), komosaina i bromelaina łodygowa (EC 3.4.22.32), która od badanej przeze
mnie bromelainy owocowej odróżnia się masą wynoszącą 23,8 kDa, obecnością łańcucha
cukrowego oraz wartością punktu izoelektrycznego (powyżej 10 w przypadku łodygowej
oraz 4,6 w przypadku owocowej). Bromelainą nazywamy także ekstrakt z niedojrzałych
owocostanów A. comosus, w którego skład wchodzą wymienione wcześniej enzymy.
Znalazł on zastosowanie w medycynie, w której używany jest do leczenia m. in. stanów
zapalnych i chorób związanych z krzepnięciem krwi. [2]
Aktynidyna natomiast jest proteazą pochodzącą z owoców A. deliciosa i A. chinensis
oraz ich mieszańców. To enzym o masie około 30kDa i punkcie izoelektrycznym leżącym
w przedziale 3,5 – 4. Jest ona jednym z białek, które wywołuje reakcję alergiczną na owoce
A. chinensis i A. deliciosa. [3, 4, 5]
Dzięki zdolnościom do trawienia włókien kolagenowych zarówno bromelaina jak
i aktynidyna używane są jako zmiękczacze do mięsa. Trawienie białek, będących
materiałem zapasowym w nasionach, aktywacja proenzymów i degradacja nieprawidłowych
białek to funkcje, jaką pełnią wymienione protezy, a także inne proteazy cysteinowe
pochodzenia roślinnego, jak na przykład papaina (EC 3.4.22.2) i ficyna (EC 3.4.22.3). [1, 4]
Moje badania, mające na celu porównanie aktywności proteaz w sokach z obu
owoców oraz temperatury ich inaktywacji termicznej wykazały, że różnią się one pod
względem aktywności proteolitycznej oraz temperatury, w jakiej zachodzi ich inaktywacja
termiczna.
Materiały i metody
W doświadczeniach wykorzystano dziewięć owoców A. deliciosa oraz trzy
owocostany A. comosus. Owoce A. deliciosa pochodziły z jednej dostawy od jednego
producenta - ZESPRI International Limited, dzięki czemu wszystkie były w bardzo
podobnym stopniu dojrzałe. Z kolei niemożliwym było kupno trzech owocostanów
A. comosus, z jednego źródła i mających podobny stopień dojrzałości, dlatego też zostały
kupione od trzech różnych producentów, lecz w podobnym stopniu dojrzałe. Gatunki te
zostały wybrane ze względu na ich dużą dostępność w sklepach w porównaniu z innymi
owocami, zawierającymi proteazy cysteinowe.
Sok z A. comosus uzyskiwany był po zmiksowaniu fragmentu owocostanu w kształcie
klina, wyciętego z całej jego długości o masie ok. 100g i przeciśniętego przez warstwę
ręcznika papierowego i warstwę gazy. Z kolei homogenat A. deliciosa o masie 95 do 100g
przeciśnięto przez warstwę papierowego ręcznika i trzy warstwy gazy. Soki były wyciskane
codziennie rano na trzy do czterech godzin przed
rozpoczęciem badań.
W laboratorium, aby pozbyć się znajdujących
się w soku resztek owoców, był on wirowany przez
10 minut w 5000rpm i w temperaturze 22°C,
co pozwoliło uzyskać klarowny supernatant,
pozbawiony dużych elementów komórkowych.
Następnie rozlewany był on w ilości 1,5 ml
do probówek Eppendorfa. Probówki były potem
inkubowane przez czas dwóch i pół lub pięciu minut
przy 300 rpm w temperaturach, które znajdują się
na wykresach w części „Wyniki”. Próbki kontrolne
nie były poddawane żadnej obróbce termicznej.
Galareta, którą przygotowano z użyciem
wody destylowanej do określenia tempa trawienia,
to 1% roztwór żelatyny spożywczej wieprzowej
firmy „Dr. Oetker”. Został on wylany do probówek
o d=12mm, po czym odstawiony na noc
do lodówki, gdzie przebywał w temperaturze 4°C.
Trawienie żelatyny enzymami, zawartymi
w sokach badanych owoców, odbywało się w
temperaturze 22°C. Aby określić szybkość Porównanie nieodwirowanego soku z
trawienia żelatyny przez enzymy proteolityczne na A. comosus (po prawej) z sokiem
powierzchnię stężałej galarety pipetą pasteurowską poddanym wirowaniu (po lewej). Fot.
wylewano po 1,5ml soku, po czym zaznaczano Autora
granicę sok/galareta na probówce. Po godzinie
sprawdzano linijką różnicę między pierwotnym a obecnym położeniem granicy sok/galareta.
W przypadku, gdy po godzinie niewidoczne były jakiekolwiek zmiany poziomu granicy
sok/galareta, odczekiwano dodatkową godzinę, po której ponownie sprawdzano jej
położenie. Po tym czasie brak jakichkolwiek zmian uznawany był za równoznaczny z
denaturacją enzymu.
Następnie, przy pomocy różnicy poziomu granicy
sok/galareta(wyrażonej w milimetrach), obliczano masę strawionej żelatyny. Do wszystkich
obliczeń przyjęto π=3,1415, obliczenia wykonywane były w programie MS Excel.
Dodatkowo, jako błąd pomiaru przyjęto 0,5 mm, który, po przeliczeniu na masę żelatyny,
został uwzględniony, w formie słupków błędu, na wykresach w części „Wyniki”.
Wyniki
Wykres 1
Wykres 2
Jak wynika z powyższych wykresów wraz ze wzrostem temperatury inkubacji soków z obu
owoców spada prędkość, z jaką zawarte w nich proteazy trawią żelatynę. Po inkubacji,
trwającej 5 minut, jako temperaturę inaktywacji proteaz zawartych w sokach można
wyznaczyć przedział 70 – 80°C dla A. comosus i 60 – 70°C dla A. deliciosa. W przypadku
inkubacji, trwającej 2,5 minuty, temperatura ta dla obu owoców wynosi ponad 90°C.
Warto zauważyć, że w temperaturach 22 – 40°C i 22 – 50°C - odpowiednio dla wykresu
1 i 2 - prędkość trawienia prawie się nie zmienia. Na uwagę zasługuje fakt, że choć sok
z A. deliciosa początkowo wykazuje większą aktywność enzymatyczną w porównaniu
z sokiem z A. comosus, to w wyższych temperaturach spada ona gwałtowniej.
Następne dwa wykresy obrazują szczegółowiej zależność spadku aktywności
enzymatycznej od temperatury, której przedziały wyznaczone zostały na podstawie
doświadczenia zilustrowanego wykresem 1.
Wykres 3
Wykres 4
Powyższe wykresy obrazują przybliżoną temperaturę inaktywacji proteaz zawartych
w użytych sokach. Jak z nich wynika, są to, przy inkubacji trwającej 5 minut, przedziały
temperatur 74 – 76°C dla A. comosus i 66 – 68°C dla A. deliciosa, przy czym w przypadku
tego drugiego temperatura może być nieznacznie niższa (mniej niż 1°C).
Dyskusja
Uzyskane przeze mnie wyniki pokazują, że stopień inaktywacji termicznej badanych
enzymów proteolitycznych zależy zarówno od temperatury jaki i czasu inkubacji. Wraz ze
wzrostem temperatury rośnie także stopień inaktywacji enzymów, zawartych w sokach
z A. comosus i A. deliciosa. Na wykresach, znajdujących się w części „Wyniki”,
odzwierciedlone jest to poprzez mniejszą prędkość trawienia żelatyny w odpowiednich
temperaturach. Taki sam wpływ na aktywność badanych enzymów ma długość inkubacji.
Wraz z jej wzrostem spada aktywność proteaz,
zawartych w sokach, a będących przedmiotami moich
badań.
W przypadku soków niepoddanych żadnej
obróbce termicznej, a także tych inkubowanych
w niższych temperaturach (patrz: wykresy 1 i 2),
aktywność proteolityczna soku z A. deliciosa jest
większa niż soku z A. comosus. Następnie,
w przypadku soku z A. deliciosa, gwałtownie spada
i utrzymuje się na poziomie niższym niż w przypadku
Struktura aktynidyny (źródło:
soku z A. comosus ( co ilustrują wykresy 1 i 2).
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Actin
Głównym
wynikiem
moich
badań
idain_1AEC.png ; grafika
są temperatury, w jakich protezy, zawarte w sokach
zamieszczona na zasadach domeny
z A. deliciosa i A. comosus, ulegają, na skutek publicznej)
denaturacji, inaktywacji termicznej. Pierwsza seria
doświadczeń (ilustrowana przez wykres 1) umożliwiła określenie przybliżonego zakresu
temperatur, w jakich zachodzi denaturacja badanych enzymów przy inkubacji trwającej
5 minut. Dla soku z A. comosus przedział ten przyjął wartości od 70 do 80°C, a dla soku
z A. deliciosa - 60 do 70°C. Kolejna seria doświadczeń posłużyła do wyznaczenia
dokładniejszych zakresów temperatur, w jakich dochodzi do inaktywacji termicznej proteaz,
zawartych w badanych sokach (ilustrują to wykresy 3 i 4). Odniosłem się do wyników z serii
ilustrowanej przez wykres 1. Jak pokazały doświadczenia, temperatura, w której, przy
pięciominutowej inkubacji, zachodzi całkowita inaktywacja termiczna proteaz zawartych
w soku z A. comosus, leży w przedziale od 74 do 76°C. Z kolei przy takim samym czasie
trwania inkubacji proteazy w soku z A. deliciosa uległy denaturacji w temperaturach
mieszczących się w przedziale od 66 do 68°C. Temperatura ta może jednak być nieznacznie
niższa. Przypuszczenie to oparte jest na wykresie 4, na którym, przy temperaturze 66°C,
pasek błędu dotyka osi x wykresu, co może oznaczać, że inaktywacja enzymów w badanym
soku zaszła w niższej, lecz nie więcej niż o 2°C temperaturze. Przypuszczenie to oparte jest
na przyjętym przeze mnie błędzie pomiaru (patrz: „Materiały i metody”), a nie na wynikach
moich badań.
Wykres 2 przedstawia ostatnią serię doświadczeń. Zestawienie z wynikami wykresu 1
umożliwiło określenie wpływu czasu inkubacji na stopień inaktywacji proteaz zawartych
w sokach badanych owoców. Z tych doświadczeń wynika, że w przypadku inkubacji
trwającej 2,5 minuty temperatura inaktywacji dla obu enzymów wynosi powyżej 90°C.
Znajomość temperatury, w jakiej zachodzi inaktywacja termiczna enzymów, ma
bardzo duże znaczenie, szczególnie w przypadku badanej przeze mnie bromelainy.
Spowodowane jest to tym, że lecznicze właściwości A. comosus są związane głównie
z aktywnością proteolityczną tego enzymu [6]. Jak pokazują wyniki moich badań, nawet
krótkie przebywanie w wysokiej temperaturze jest w stanie doprowadzić do częściowej
lub całkowitej utraty aktywności przez enzym. Skutkiem tego jest kompletny brak aktywności
proteolitycznej we wszystkich przetworzonych produktach zawierających A. comosus.
Przez co tracą one, w dużej części, właściwości lecznicze w porównaniu z nieprzetworzonymi
owocostanami.
Z drugiej strony, znając temperaturę, jaka potrzebna jest, by enzym uległ inaktywacji,
możliwym jest wykorzystanie tego w przemyśle spożywczym do produkcji nowych potraw.
Znajomość tych temperatur umożliwia takie przetworzenie owoców i soków, aby zawarte
w nich proteazy utraciły aktywność, lecz tak, by nie miało to wpływu na ich walory smakowe.
Może to pozwolić na łączenie składników w sposób, który wcześniej był niemożliwy.
Pozwoli to na przykład na wytworzenie galaretki o smaku A. comosus czy A. deliciosa bez
potrzeby stosowania sztucznych aromatów i substancji smakowych.
Nie mam niestety możliwości porównania wyników swoich doświadczeń z innymi
pracami badawczymi. W przypadku proteaz w A. comosus jest to spowodowane używaniem
przez innych naukowców różnych metod [6], a w przypadku A. deliciosa brakiem
ogólnodostępnych prac badawczych, dotyczących inaktywacji termicznej zawartej w nim
proteazy.
Piśmiennictwo
1. Dubey V. K. et. al. (2007) Papain-like proteases: Applications of their inhibitors
2. Maurer H.R. (2001) Bromelain: biochemistry, pharmacology and medical use
3. Miraghaee S. S. et. al. (2011) Investigation of Protein Pattern in Kiwifruit (Actinidia
deliciosa)
4. Pastorello E. A. et. al. (1998) Identification of actinidin as the major allergen of kiwi fruit
5. Podivinsky E. (1991) Molecular Studies on Actinidin, A Cysteine Protease from Kiwifruit
6. Rungtip J., Charoenrein S. (2010) Effect of Temperature on the Stability of Fruit
Bromelain from Smooth Cayenne Pineapple
7. Wiederanders B. (2003) Structure-function relationships in class CA1 cysteine peptidase
propeptides