IDEIA Herpes Simplex Virus [PL]

i metodyki do testów immunoenzymatycznych, i wykazuje on
znakomitą czułość (93.6%) i swoistość (97.8%) w porównaniu z
referencyjnymi metodami hodowli komórkowej.
Key Code TSMX7845
www.oxoid.com/ifu
Europe +800 135 79 135
CA 1 855 805 8539
US 1 855 2360 190
ROW +31 20 794 7071
IDEIA Herpes Simplex
Virus
PL
K605711-2
96
Wzmocniony test immunoenzymatyczny do bezpośredniego
wykrywania Wirusa Herpes Simplex w ludzkich próbkach
klinicznych.
1.
PRZEZNACZENIE
Test IDEIA™ Herpes Simplex Virus (HSV) jest wzmocnionym,
jakościowym testem immunoenzymatycznym do bezpośredniego
wykrywania wirusa Herpes Simplex Virus (HSV) w ludzkich
próbkach klinicznych, pochodzących od objawowych chorych.
3.
ZASADA TESTU
Test IDEIA HSV jest oparty na swoistych mysich przeciwciałach
monoklonalnych przeciwko HSV i systemie wzmocnienia sygnału
enzymatycznego3. Antygen HSV (wspólny dla typów 1 i 2), obecny
w próbce klinicznej, jest wiązany przez mysie przeciwciało
monoklonalne zaadsorbowane na ścianach studzienek
mikropłytki. Sprzężone z enzymem drugie mysie przeciwciało
monoklonalne wiąże się z antygenem uchwyconym przez
pierwsze przeciwciało, a enzym przekształca substrat w produkt
reakcji. Produkt ten uczestniczy w drugiej reakcji enzymatycznej,
która powoduje zmianę barwy. Proces narastania zabarwienia
jest hamowany przez dodanie kwasu. Natężenie barwy wyraźnie
powyżej poziomu tła wskazuje na obecność antygenów HSV In
próbce klinicznej (patrz Sekcja 9).
Podziękowania
Przeciwciała monoklonalne pochodzą z Wydziału Patologii
Uniwersytetu w Cambridge, United Kingdom4.
4.
DEFINICJE
Poniższe symbole zostały użyte w informacji o produkcie.
Kod produktu i numer katalogowy
Proszę sprawdzić instrukcję użycia
2.
STRESZCZENIE
HSV to zaopatrzony w otoczkę wirus DNA, morfologicznie
podobny do innych wirusów rodzaju Herpesviridae. Rozróżnia się
dwa antygenowo różne typy, określane jako typ 1 i 2.
HSV typu 1 i 2 są często przyczyną powierzchownych zakażeń jamy
ustnej, skóry, oczu I narządów rodnych1,2. Zakażenia centralnego
układu nerwowego (meningoencephalitis) i poważne uogólnione
zakażenia u noworodków i osób z obniżoną odpornością
także występują, chociaż rzadziej. Po pierwotnym zakażeniu,
które ustąpiło, wirus może przetrwać w formie latentnej w
tkance nerwowej, skąd może znowu się pojawić w określonych
warunkach, powodując nawrót objawów.
Obecnie istnieją dwie zasadnicze metody diagnostyczne,
stosowane do wykrywania HSV w próbkach klinicznych. Pierwsza
polega na izolacji wirusa, hodowli na odpowiednich komórkach
i identyfikacji czynnika zakaźnego metodami immunologicznymi
lub przy użyciu mikroskopii elektronowej1,2. Druga metoda
polega na bezpośrednim wykazaniu antygenów wirusa w próbce
klinicznej, przy użyciu przeciwciała monoklinalnego znakowanego
fluoresceiną lub w teście immunoenzymatycznym.
Izolacja wirusa jest pracochłonna, wymagająca dużo czasu, droga,
i wymaga pewnego doświadczenia laboratoryjnego, nie zawsze
dostępnego w każdym laboratorium.
Test IDEIA HSV jest alternatywnym testem diagnostycznym
do bezpośredniego wykrywania antygenów wirusa w
próbkach klinicznych. Test opiera się na reakcji przeciwciał
monoklonalnych przeciwko antygenom wirusa HSV 1 i HSV 2,
i na systemie wzmacniania sygnału enzymatycznego3. Test
immunoenzymatyczny jest łatwy do wykonania i szybszy niż
izolacja wirusa w celu wykrycia HSV w próbkach klinicznych I
hodowlach komórek.
Test IDEIA HSV dostarcza wszystkich niezbędnych odczynników
do wykrycia HSV w próbkach klinicznych. Test można wykonać
w ciągu mniej niż dwóch godzin, przy użyciu rutynowego sprzętu
Zawartość wystarcza na <N> testów
N
Studzienki opłaszczone przeciwciałem monoklonalnym
-
Nie przechowywać rozcieńczonego roztworu roboczego do
dalszego użycia (sekcja 8.2.10).
5.2.7
Środek wzmacniający A -
Gotowy do użycia. Przechowywać niezużyty środek wzmacniający
A w temp. 2-8°C.
5.2.8
Amplifier B -
Gotowy do użycia. Przechowywać niezużyty środek wzmacniający
B w temp. 2-8°C.
5.2.9
Roztwór hamujący reakcję -
Gotowy do użycia. Przechowywać niezużyty roztwór hamujący
reakcję w temp. 2-8°C.
6.
DODATKOWE ODCZYNNIKI
6.1. ODCZYNNIKI
Świeżo destylowana lub dejonizowana woda do przygotowania
buforu płuczącego.
6.2. WYPOSAŻENIE
Następujące produkty są przeznaczone do użycia w połączeniu
z zestawem IDEIA HSV. Proszę porozumieć się z miejscowym
przedstawicielem lub dystrybutorem Oxoid w sprawie dalszych
informacji.
IDEIA HSV Extraction Buffer 10mL (nr kat. S601230-2).
IDEIA HSV (Blocking Reagents) (nr kat. S603330-2).
Numer serii
Ograniczenia temperatury przechowywania
5.2.2
Mieszadło do próbek
Użyć przed
ODCZYNNIKI DOSTARCZONE
96 – Każdy zestaw zawiera dostateczną ilość odczynnika do
wykonania 96 oznaczeń. - Czas przydatności zestawu do użycia
jest wskazany na etykiecie zewnętrznego pudełka.
ZAWARTOŚĆ TESTU IDEIA HSV
Jedna książeczka z instrukcją wykonania.
96 studzienkowa płytka (12 pasków
po 8 studzienek), pokryta przeciwciałem
monoklonalnym przeciwko HSV. Nadająca
się do powtórnego zamknięcia torebka
polietylenowa służy do przechowania
niezużytych pasków studzienek.
Jedna buteleczka każdego z następujących odczynników:
5.2.1
roboczy roztwór buforu płuczącego w ilości potrzebnej na
dany dzień roboczy (patrz sekcja 8.2.10). Pozostały koncentrat
przechowywać w temp. 2-8°C.
IDEIA PCE Chlamydia/HSV Wash Buffer Concentrate (X10) 125mL
(nr kat. S603930-2).
Do diagnostyki medycznej In vitro
5.1.
12mL kontroli ujemnej: bufor zawierający
środek przeciwbakteryjny, barwnik i środek
przeciwpieniący.
7 m L ko n i u gat u : mys i e p r ze c i wc i a ł o
monoklonalne (fragment Fab) sprzężone
z fosfatazą zasadową, w buforze
stabilizującym zawierającym barwnik i środek
przeciwbakteryjny.
125mL koncentratu buforu do płukania (x10):
buforowany TRIS-em roztwór zawierający
detergent i środek przeciwbakteryjny.
13mL środka wzmacniającego A: sole
nieorganiczne i buforowany roztwór enzymu
zawierjący filotet tetrazolium i środek
przeciwbakteryjny.
13mL środka wzmacniającego B: stabilizowany
roztwór NADPH.
13mL roztworu hamującego reakcję: 1 mol/L
kwas fosforowy.
5.2. PRZYGOTOWANIE, PRZECHOWYWANIE I POWTÓRNE
UŻYCIE SKŁADNIKÓW ZESTAWU
Format zestawu IDEIA HSV pozwala na badanie maksymalnie
12 serii próbek. Aby zapewnić prawidłowe działanie zestawu,
niezużyte odczynniki powinno się przechowywać zgodnie z
instrukcją.
Otworzyć torebkę z mikropłytką, tnąc wzdłuż zamknięcia.
Odłamać potrzebną ilość pasków ze studzienkami i umieścić je
z powrotem w ramce. Wszystkie nie używane paski umieścić z
powrotem w torebce ze środkiem suszącym, torebkę starannie
zamknąć i przechowywać w temp. 2-8°C. Studzienki można zużyć
w ciągu 6 tygodni od pierwszego otwarcia, jeśli się je przechowuje
w taki sposób.
Wytworzone przez
5.
100mL medium transportowego: niejonowy
detergent w buforze zawierającym barwnik,
środek przeciwbakteryjny i przeciwpieniący.
3mL kontroli dodatniej: inaktywowany
homogenat komórek HeLa zakażonych
wirusem HSV w buforze zawierającym białko
i detergent.
Medium trasnportowe -
IDEIA HSV Transport Medium 100mL (nr kat. S605530-2).
7.
WYPOSAŻENIE
Wymagane jest następujące wyposażenie:
Czyste naczynia z nakrętką
Gotowe do użycia. Istotne jest, aby zamieszać medium przed
użyciem.
Czyste ręczniki papierowe, na których będzie się osuszać
mikropłytkę
Środek przeciwpieniący obecny w medium transportowym
powoduje, że wydaje się ono mętne, co nie ma wpływu
na wyniki testu i nie jest spowodowane zanieczyszczeniem
mikrobiologicznym.
Mikropipety i końcówki jednorazowe, do podawania objętości
50µL 1,000µL, ewentualnie miarowe pipety pasteurowskie do
podawania objętości 200µL próbki (opcjonalne)
5.2.3
Kontrola dodatnia -
Gotowa do użycia. Przechowywać niezużytą kontrolę dodatnią w
temp. 2-8°C.
5.2.4
Kontrola ujemna -
Gotowa do użycia. Przechowywać niezużytą kontrolę ujemną w
temp. 2-8°C.
5.2.5
Koniugat -
Gotowy do użycia. Przechowywać niezużyty koniugat w temp.
2-8°C.
5.2.6
Koncentrat roztworu płuczącego -
Dostarczony jako x10 koncentrat. Przygotować roboczy roztwór
płuczący przez dodanie 1 objętości koncentratu do 9 objętości
świeżo destylowanej lub dejonizowanej wody. Dostarczona ilość
wystarcza do sporządzenia 100mL roboczego roztworu płuczącego
na każdy pasek złożony z ośmiu studzienek. Przygotowywać
Pojemnik na odpadki z odpowiednim świeżym środkiem
odkażającym
Inkubator na 37°C
Automatyczna płuczka płytek (opcjonalnie) lub sprzęt odpowiedni
do płukania 8-studzienkowych pasków (sekcja 10.4.4). Uwaga:
jeśli płucze się na raz mniej niż 8 studzienek, trzeba dopełnić
pasek pustymi studzienkami.
Spektrofotometr lub czytnik mikropłytek do odczytu 96studzienkowej płytki składającej się z 8-studzienkowych pasków
przy długości fali 490nm i odczytem odniesienia przy 620-650nm
(opcjonalnie, Sekcja 10.5 Odczyt wyników testu).
8.
ZASTRZEŻENIA
- Do diagnostyki in vitro. Osoba wykonująca badanie musi
być przeszkolona i doświadczona w procedurach laboratoryjnych.
8.1. ŚRODKI BEZPIECZEŃSTWA
8.1.1
Następujące odczynniki zawierają azydek sodowy
(15mmol/L), który jest trucizną; medium transportowe,
8.1.2
8.1.3
8.1.4
8.1.5
8.1.6
8.1.7
8.1.8
8.2.
8.2.1
8.2.2
8.2.3
8.2.4
8.2.5
8.2.6
8.2.7
8.2.8
koniugat, koncentrat buforu płuczącego, kontrola
dodatnia, kontrola ujemna i środek wzmacniający
A. Azydek sodowy może reagować z miedzianymi i
ołowianymi częściami kanalizacji, tworząc wybuchowe
azydki metali. Materiały zawierające azydek należy
usuwać, spłukując dużą ilością wody.
Odczynnik do hamowania reakcji zawiera kwas
fosforowy (1,0mol/L). Unikać kontaktu z oczyma i skórą
przez noszenie ochronnej odzieży i okularów.
Kontrola dodatnia zawiera inaktywowany antygen HSV,
który nie jest zakaźny. Jednak kontrolę należy traktować
i usuwać tak, jakby była zakaźna. Kontrola dodatnia
zawiera także detergent (1%v/v). Należy unikać kontaktu
ze skórą.
Nie jeść, nie pić, nie palić, nie przechowywać ani nie
przygotowywać żywności, ani nie stosować kosmetyków
w miejscu przeznaczonym do pracy.
Nie pipetować ustami.
Nosić jednorazowe rękawiczki podczas pracy z
materiałem klinicznym i zakażonymi komórkami, zawsze
myć ręce po pracy z materiałem zakaźnym.
Usuwać wszelkie pozostałości próbek klinicznych
zgodnie z miejscowymi przepisami.
Arkusz dotyczący bezpieczeństwa dostępny na żądanie
dla osób zawodowo przygotowanych.
UWAGI TECHNICZNE
Nie należy używać składników zestawu po upływie daty
ważności podanej na etykietach. Nie mieszać ani nie
zamieniać odczynników z różnych zestawów i serii.
Odczynniki są dostarczane w ustalonych stężeniach
roboczych. Wynik testu może nie być wiarygodny, jeśli
są one mieszane, rozcieńczane lub przechowywane w
warunkach innych niż wskazane w sekcji 5.2.
Unikać zanieczyszczenia odczynników.
Jeśli używa się metody kroplowej, należy w ten sam
sposób dodawać wszystkie kontrole i odczynniki. Jakość
testu może ulec pogorszeniu, jeśli używa się kombinacji
pipetowania i dodawania kroplowego.
Nie należy pobierać wielokrotnie środka wzmacniającego,
tylko przenieść potrzebną ilość do odpowiedniego
czystego naczynia. Niezużytej pozostałości nie należy
wlewać z powrotem do butelki z zakraplaczem.
Do każdej próbki, kontroli i odczynnika należy używać
osobnej pipety jednorazowej lub końcówki (jeśli nie
używa się metody kroplowej), aby uniknąć krzyżowego
zanieczyszczenia próbek, kontroli i odczynników, co
mogłoby spowodować błędne wyniki.
Przechowywać dejonizowaną lub destylowaną wodę
do rozcieńczania stężonych odczynników w czystych
naczyniach, aby uniknąć skażenia mikrobiologicznego.
Należy dopilnować, aby nie doszło do krzyżowego
zanieczyszczenia pomiędzy studzienkami mikropłytki
na żadnym z etapów testu. Szczególnie istotne jest,
aby koniugat nie zanieczyścił innych odczynników
ani sprzętu. Jeśli nie używa się metody kroplowej, do
dodawania koniugatu i środka wzmacniającego należy
używać innych pipet. Należy także unikać dotykania lub
zapryskania brzegu studzienek mikropłytki koniugatem.
Koniugat zaschnięty na brzegu studzienki może źle
wpłynąć na wynik testu.
8.2.9
8.2.10
Studzienek nie można użyć powtórnie.
Nie należy przechowywać buforu do płukania w stężeniu
roboczym. Kiedy naczynia na bufor do płukania nie są
używane, powinno się je przepłukać dejonizowaną lub
destylowaną wodą i pozostawić do wyschnięcia.
8.2.11 System wzmocnienia enzymatycznego wykrywa z dużą
czułością cząsteczki fosfatazy zasadowej. Jest bardzo
ważne, aby przez staranne wypłukanie studzienek
usunąć wszystkie resztki niez wiązanego koniugatu
przed dodaniem środka wzmacniającego. Staranne
wypłukanie studzienek osiąga się metodami opisanymi
w sekcji 10.4.4. Nieskuteczne płukanie może prowadzić
do nieprawdziwych wyników.
8.2.12 Sprzęt do ręcznego lub automatycznego płukania
musi być wolny od zanieczyszczeń mikrobiologicznych,
prawidłowo wykalibrowany I utrzymany zgodnie z
zaleceniami producenta.
8.2.13 Nie wolno używać do tego testu roztworu soli
fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) ani innych
roztworów płuczących zawierających fosforany, aby
zapobiec hamowaniu enzymu użytego w koniugacie,
co mogłoby wpłynąć na wyniki testu. Jeśli sprzęt
do płukania był uprzednio używany z roztworami
zawierającymi fosforany, trzeba go dokładnie wypłukać
dejonizowaną lub destylowaną wodą, zanim naleje
się roztworu roboczego buforu do płukania IDEIA PCE
Chlamydia/HSV Wash Buffer (nr kat. S603930-2).
9.
POBIERANIE I PRZYGOTOWANIE PRÓBEK
Testem IDEIA HSV można badać następujące próbki:
Próbki pobrane do medium transportowego IDEIA HSV (patrz
sekcja 9.3.1)
Próbki pobrane do medium transportowego używanego do
hodowli komórkowych (patrz sekcja 9.3.2).
9.1. MEDIUM TRANSPORTOWE
Jeśli do pobierania próbek ma być używane medium
transportowe IDEIA HSV, należy umieścić 1mL medium w czystym
naczyniu, zaopatrzonym w zakrętkę. Takie 1mL porcje mogą być
przechowywane w temp. 2-8°C przez 12 miesięcy lub do daty
ważności wskazanej na etykietce. Przechowywać w temperaturze
pokojowej (15-30°C) przez 6 miesięcy.
Uwaga: Bardzo ważne jest, aby zamieszać medium ręcznie lub na
urządzeniu do mieszania przed porcjowaniem lub użyciem. Środek
przeciwpieniący obecny w medium transportowym powoduje,
że wydaje się ono mętne, co nie ma wpływu na wyniki testu
i nie jest spowodowane zanieczyszczeniem mikrobiologicznym.
Medium zawiera silny detergent, a zatem próbka do niego
pobrana nie nadaje się do hodowli komórkowej.
9.2. POBIERANIE PRÓBEK
Odpowiednia technika pobrania jest bardzo ważna dla
optymalnego wykrywania wirusa HSV w próbkach klinicznych.
Próbki ze zmian chorobowych powinny zostać pobrane przez
wykwalifikowaną osobę za pomocą jałowej pałeczki wymazowej.
Powinno się tak pobrać próbkę, aby zawierała możliwie jak
najwięcej materiału zakaźnego. Zaleca się użycie jałowych
pałeczek wymazowych z bawełny lub Dacron®, na trzonkach
plastikowych lub z prasowanego papieru.
Kremy, maści, lotiony, lód, alkohol, roztwory betadiny, cynk lub
nasiadówki zmniejszają znacząco możliwość pozyskania wirusa8.
Powinno się unikać stosowania tych środków przed pobraniem
próbki, albo zgłosić lekarzowi ich użycie przy pobraniu.
9.2.1
Próbki kliniczne
Wrzody powinno się przetrzeć pałeczką wymazową, aby pozyskać
zakażone komórki I wydzielinę z wnętrza wrzodu. Pęcherzyki
należy ostrożnie otworzyć, zebrać płyn na pałeczkę i przetrzeć
zmianę u podstawy. Pałeczkę należy umieścić w czystym
zakręcanym naczyniu z odpowiednim medium transportowym.
Zmiany ropne powinno się traktować jak pęcherzyki; strupy
można dodać do medium w zakręcanym naczyniu albo przesłać
suche. Próbki można przechowywać w temp. 2-8°C nie dłużej niż
przez 3 dni.
Próbki z odbytnicy lub odbytu, zanieczyszczone kałem, mogą
dawać fałszywie dodatnie wyniki. Można to potwierdzić
używając odczynników blokujących IDEIA HSV Blocking Reagents
(nr kat. S603330-2).
9.2.2
Próbki z szyjki macicy u objawowych chorych
Należy mocno przetrzeć pałeczką wymazową wszelkie widoczne
zmiany, jeśli ich nie ma, przetrzeć ściany szyjki. Wyciągnąć
pałeczkę nie dotykając ścian pochwy i umieścić w zakręcanym
naczyniu zawierającym medium transportowe. Próbki można
przechowywać w temp. 2-8°C nie dłużej niż przez 3 dni.
9.3. PRZYGOTOWANIE PRÓBEK
9.3.1 Pałeczki wymazowe w medium transportowym IDEIA
HSV
Silnie zamieszać próbkę przed badaniem I przejść do sekcji 10.2.
9.3.2
Pałeczki w medium transportowym do izolacji wirusa
Bufor ekstrakcyjny IDEIA HSV Extraction Buffer (nr kat. S6012302) jest niezbędny do przygotowania próbek pobranych za
pomocą pałeczek wymazowych i umieszczonych w medium
transportowym do izolacji wirusa. Próbki można poddać badaniu
w teście IDEIA HSV po zakażeniu hodowli komórkowej, ponieważ
potraktowanie próbki stężonym buforem ekstrakcyjnym sprawia,
że staje się ona nieprzydatna do izolacji wirusa.
Dodać 100µL buforu ekstrakcyjnego (nr kat. S601230-2) do 900µL
wirusowego medium transportowego. Postępować z próbką dalej
jak wskazano w sekcji 10.2.
Nie używać medium transportowego wchodzącego w skład
zestawu do przygotowania próbek pobranych na pałeczki
wymazowe i umieszczonych w medium transportowym do
izolacji wirusa, ponieważ nie zapewnia ono optymalnej ekstrakcji
antygenów HSV z pałeczek wymazowych.
10.
WYKONANIE TESTU
PROSZĘ ZAPOZNAĆ SIĘ Z SEKCJĄ 8.2 ZASTRZEŻENIA TECHNICZNE
PRZED WYKONANIEM TESTU.
10.1. PRZYGOTOWANIE KONTROLI
Kontrola ujemna
Mieszać kontrolę ujemną przez co najmniej 15 sekund. Dodać
odczynnika wprost do odpowiednich studzienek.
Kontrola dodatnia
Mieszać kontrolę dodatnią przez 1 minutę. Dodać odczynnika
do odpowiedniej studzienki. Jeśli to konieczne, dla lepszej oceny
wyników testu można posłużyć się dodatkową kontrolą dodatnią
o niskim poziomie reaktywności.
10.2. DODAWANIE PRÓBEK I KONTROLI
Mieszać wszystkie przygotowane uprzednio próbki (patrz sekcja
9.3) I kontrole przez 15 sekund przed podaniem do studzienek.
10.3. PRZECHOWYWANIE PRZYGOTOWANYCH PRÓBEK
Próbki można przechowywać w temp. -20°C do czterech
tygodni po przygotowaniu. Jeśli poddawane badaniom próbki
zostały uprzednio zamrożone, należy pozwolić im się rozmrozić
do temperatury pokojowej (15-30°C), a następnie zamieszać
intensywnie przez co najmniej 1 minutę tuż przed badaniem.
10.4. PROCEDURA TESTU
Zaleca się użycie jednej metody dodawania odczynników
(kroplowej, mikropipetą lub automatycznie) w całym przebiegu
testu. Przy wykonywaniu badań wielokrotnie na mniejszej liczbie
próbek zaleca się metodę kroplową, aby uniknąć wielokrotnego
nabierania końcówką z buteleczek z odczynnikami.
10.4.1 Dodawanie kontroli I próbek
Umieścić potrzebną liczbę studzienek w ramce. Dodać po 200µL
próbek do odpowiednich studzienek. Dodać 6 kropli (lub 200µL)
kontroli ujemnej I dodatniej do osobnych studzienek. (Z każdą
serią badanych próbek powinno się wykonać badanie co najmniej
3 kontroli ujemnych I jednej kontroli dodatniej).
10.4.2 Dodawanie koniugatu
Po dodaniu próbek i kontroli do każdej studzienki należy dodać
jedną kroplę (lub 50µL) koniugatu. Unikać zanurzania pipety lub
końcówki butelki w studzienkach podczas dodawania koniugatu,
ponieważ może to prowadzić do krzyżowego zanieczyszczenia
pomiędzy próbkami. Nie należy również dotykać brzegów
(krawędzi) studzienek podczas dodawania, ponieważ pogarsza
to wyniki testu.
10.4.3 Pierwsza inkubacja
Umieścić pokrywkę na płytce i inkubować w temp. 35-37°C w
komorze wilgotnej przez 90 minut.
10.4.4 Płukanie studzienek
Studzienki należy wypłukać, dodając świeżo sporządzonego
roztworu buforu płuczącego (patrz sekcja 5.2.6).
Sposób płukania ma krytyczne znaczenie dla jakości testu (patrz
sekcja 8.2.10) i powinno ono zostać przeprowadzone tak, żeby
zapewnić całkowite napełnianie studzienek (co najmniej 350µL
buforu płuczącego) i całkowite ich opróżnianie.
Niezbędne są cztery cykle płukania, ręcznego bądź
automatycznego, przy czy w każdym cyklu powinny się znaleźć
dwie minuty namaczania podczas drugiego płukania albo w sumie
namaczanie przez dwie minuty w czasie całego cyklu.
Płukanie ręczne
Jeśli płucze się studzienki ręcznie, należy odsysać lub wytrząsać
zawartość studzienek, używając świeżo przygotowanego
buforu płuczącego i dbając o całkowite napełnianie i całkowite
opróżnianie studzienek. Pomiędzy poszczególnymi cyklami
plukania należy usuwać pozostałości buforu płuczącego, stukając
odwróconą mikropłytką o suchy ręcznik papierowy. Płukanie
ręczne będzie też bardziej skuteczne, jeśli studzienki napełnia się
pod kątem, aby podawany bufor zawirował. Po ostatnim płukaniu
powinno się odwrócić płytkę i postukać nią o ręcznik papierowy,
aby usunąć wszelkie pozostałości buforu płuczącego.
Plukanie automatyczne
Automatyczne płuczki należy tak zaprogramować, aby wykonały
cztery pełne cykle płukania, zawierające namaczanie trwające
w sumie dwie minuty w ciągu całego cyklu. Płuczki muszą
być odpowiednio wykalibrowane, aby całkowicie napełniały i
opróżniały studzienki po każdym płukaniu. Po ostatnim płukaniu
powinno się odwrócić płytkę i postukać nią o ręcznik papierowy,
aby usunąć wszelkie pozostałości buforu płuczącego.
10.4.5 Dodanie środka wzmacniającego
Dodać 2 krople (lub 100µL) środka wzmacniającego A do każdej
studzienki.
Dodać 2 krople (lub 100µL) środka wzmacniającego B do każdej
studzienki.
Unikać dotykania studzienek butelką z kroplomierzem lub
końcówką pipety przy dodawaniu środków wzmacniających A i
B, ponieważ może to prowadzić do krzyżowego zanieczyszczenia
studzienek.
10.4.6 Druga inkubacja
Umieścić pokrywkę na mikropłytce I inkubować w temp. 35-37°C
w komorze wilgotnej przez 30 minut.
10.4.7 Zahamowanie reakcji
Dodać 2 krople (lub 100µL) rozstworu hamującego reakcję do
każdej studzienki. Starannie zamieszać zawartość studzienek.
Barwny product jest trwały przez 30 minut. Nie wystawiać wprost
na światło słoneczne, ponieważ następuje blaknięcie produktu
barwnego.
10.5. ODCZYT WYNIKÓW TESTU
10.5.1 Odczyt wizualny
Studzienki można oceniać wizualnie w ciągu 30 minut po dodaniu
roztworu hamującego reakcję. Zaleca się, aby studzienki, w których
interpretacja zabarwienia jest trudna w porównaniu do kontroli
ujemnej, zostały odczytane fotometrycznie (patrz sekcja 10.5.2).
10.5.2 Odczyt fotometryczny
Studzienki powinno się odczytać fotometrycznie w ciągu 30 minut
po dodaniu roztworu hamującego reakcję. Zamieszać zawartość
studzienek i odczytać absorbancję każdej studzienki przy użyciu
odpowiedniego spektrofotometru lub czytnika płytek EIA
ustawionego na 490nm. Przed odczytem należy sprawdzić, czy dno
studzienek jest czyste I czy w studzienkach nie ma zanieczyszczeń.
Czytnik powinien się wyzerować wobec powietrza (bez płytki w
wózku) zanim dokona się odczytu płytki.
Jeśli czytnik umożliwia pomiar przy referencyjnej długości fali
(przy 620–650nm), powinno się przeprowadzić pomiar podwójny,
aby uniknąć zakłóceń powodowanych przez zanieczyszczenia czy
napisy na powierzchni odczytu.
10.6. STRESZCZENIE WYKONANIA TESTU IDEIA HSV
11.
KONTROLA JAKOŚCI I INTERPRETACJA WYNIKÓW
TESTU
11.1. KONTROLA UJEMNA
Jak wskazano w sekcji 10.4.1 (Dodawanie próbek i kontroli), w
każdej serii oznaczeń powinny się znaleźć trzy ujemne kontrole.
Ocena wizualna
Wszystkie kontrole ujemne powinny być bezbarwne lub tylko
bladoróżowe. Jeśli tak nie jest, wyników testu nie można oceniać
wizualnie. Powinno się odczytać wyniki fotometrycznie lub
powtórzyć badanie.
Ocena fotometryczna
Pojedyncze kontrole ujemne powinny dawać odczyt mniejszy lub
równy 0,30. Pojedyncze kontrole ujemne nie powinny wykraczać
poza zakres + 0,05 od średniej dla wszystkich trzech kontroli
ujemnych. Jeśli jedna z kontroli ujemnych wykracza poza ten
zakres, należy ją odrzucić i do obliczeń przyjąć wartość średnią dla
pozostałych dwóch kontroli ujemnych. Jeśli dwie kontrole ujemne
wypadają poza dozwolonym zakresem, test trzeba powtórzyć.
Wyliczenie punktu odcięcia (wartości cut-off)
Wartość punktu odcięcia wylicza się, dodając 0,15 do średniej
odczytu dla kontroli ujemnych.
11.2. KONTROLE DODATNIE
Jak wskazano w sekcji 10.4.1 (Dodawanie próbek i kontroli), w
każdej serii oznaczeń należy uwzględnić jedną kontrolę dodatnią.
Ocena wizualna
Studzienka zawierająca kontrolę dodatnią powinna mieć
zabarwienie czerwone/ amarantowe, wyraźnie różne od
zabarwienia kontroli ujemnych. Jeśli tak nie jest, wyników testu
nie należy oceniać wizualnie. Należy je odczytać fotometrycznie
lub powtórzyć badanie.
Ocena fotometryczna
Studzienki kontroli dodatniej powinny wykazywać absorbancję
wyższą niż 0,50. Jeśli tak nie jest, test należy powtórzyć.
11.3. PRÓBKI
Ocena wizualna
Próbka o zabarwieniu czerwonym/ amarantowym bardziej
intensywnym niż kontrola ujemna jest dodatnia. Próbka o
zabarwieniu równym lub mniej intensywnym niż kontrola ujemna
jest ujemna. Próbka o bladoróżowym zabarwieniu zbliżonym do
kontroli ujemnej powinna zostać odczytana fotometrycznie albo
zbadana jeszcze raz. Można też ponownie pobrać próbkę od
chorego.
Ocena fotometryczna
Próbki kliniczne wykazujące gęstość optyczną (absorbancję)
większą niż wartość punktu odcięcia są dodatnie (patrz sekcja
11.1). Wynik w zakresie do 0,015 powyżej punktu odcięcia
powinien być interpretowany ostrożnie, badanie powtórzone albo
próbka pobrana jeszcze raz. Nie powinno się podawać wyników
badań klinicznych, jeśli kontrole nie mieszczą się w spodziewanym
zakresie.
11.4. INTERPREATACJA I WERYFIKACJA WYNIKÓW TESTU
11.4.1 Interpretacja wyników testu
Następująca tabela jest streszczeniem zalecanej interpretacji
wyników i ich podawania.
Tabela 11.4
format wyniku
Wynik
OD > CO + 0,015
OD = CO ± 0,015
OD < CO - 0,015
Streszczenie interpretacji wyników i zalecany
Interpretacja
Dodatni*
Zalecenie dotyczące podawania wyniku
Przypuszczalny antygen HSV.
(Nie przeprowadzono testu blokowania)
Niejednoznaczny* Nie można zinterpretować.
Powtórzyć badanie.
Ujemny
Nie wykryto antygenu HSV
OD = Optical Density (gęstość optyczna, absorbancja)
CO = Cut-off /punkt odcięcia= średnia wyników dla kontroli
ujemnych + 0,15
* Dodatnie I niejednoznaczne wyniki należy potwierdzić.
11.4.2 Weryfikacja wyników testu
Jeśli uzna się za niezbędną weryfikację wyników uzyskanych
w teście IDEIA HSV, zaleca się użycie odczynnika blokującego
IDEIA HSV Blocking Reagents (nr kat. S603330-2). Wykonanie
testu blokującego zapewnia dodatkowy sposób kontroli jakości
sposobu pobrania próbek.
12.
OGRANICZENIE WYNIKÓW
12.1. Jakość próbek ma podstawowe znaczenie dla powodzenia
wszelkich procedur diagnostycznych. Pobrane próbki
muszą zawierać tak dużo antygenów wirusa jak to możliwe
(patrz Sekcja 9). A zatem wynik negatywny nie wyklucza
możliwości zakażenia wirusem HSV.
w klinikach chorób przenoszonych drogą płciową11,12.
W objawowych zakażeniach pierwotnych i wtórnych zmiany
chorobowe można wykryć na skórze, błonie śluzowej jamy
ustnej, gardła, narządów płciowych lub w oku. Podczas zakażeń u
noworodków lub u osób z obniżoną odpornością zakażenie może
być bardziej rozsiane, obejmując także takie narządy jak płuca,
mózg, wątrobę, śledzionę itd.
Antygen HSV może być obecny i wirusy można wyhodować z płynu
zmian pęcherzykowatych, a także ze śliny lub wydzielin z innych
zakażonych miejsc, np. gardła, oka lub genitaliów. Ponadto wirusy
można też wyhodować z tkanek zakażonych podczas rozsianego
zakażenia, np. z bioptatu mózgu przy wirusowym zapaleniu opon
mózgowych.
Prawdopodobieństwo wykrycia wirusa HSV spada z czasem od
pojawienia się objawów choroby i rozwoju zmian chorobowych.
Prawdopodobieństwo spada również, gdy zmiany przybierają
postać wrzodu, potem strupa i goją się. Próbki powinno
się pobrać jak najszybciej po pojawieniu się zmian5,6. W
przeprowadzonych badaniach wirusa udało się wykryć w 94%
zmian pęcherzykowatych, 87% zmian ropnych, 70% wrzodów i w
27% strupów7.
14.
SZCZEGÓŁOWA CHARAKTERYSTYKA WYNIKÓW
Wszystkie podane wyniki wskazują, że badanie metodą hodowli
komórkowej jest w 100% czułe I swoiste.
12.2. Dla uzyskania najlepszych wyników powinno się używać
medium transportowego IDEIA HSV lub buforu do
ekstrakcji. Nie sprawdzano wyników testu po użyciu
próbek pobranych do innych mediów transportowych.
14.1. BADANIA KLINICZNE
Test IDEIA HSV oceniano w stosunku do ustalonych systemów
hodowli komórkowych w czterech niezależnych rutynowych
laboratoriach diagnostycznych.
12.3. Nie sprawdzano wyników testu przy badaniu chorych
bezobjawowych, płynu mózgowo-rdzeniowego, biopsji
tkankowych lub wydzieliny z oka, ani dla potwierdzenia
hodowli komórkowych.
Testem IDEIA HSV zbadano w sumie 1375 ludzkich próbek
klinicznych i porównano wyniki z wynikami hodowli komórkowych
używanych w ośrodkach przeprowadzających badania (Tabela
14.1). W badaniach tych częstość potwierdzonego hodowlą
komórkową zakażenia HSV wynosiła 12,7 do 36,9%.
12.4. Test wykrywa oba typy wirusa Herpes Simplex (1 i 2), ale
ich nie różnicuje.
12.5. Testu nie powinno się używać jako jedynego potwierdzenia
do diagnozy zakażenia HSV, jeśli rozważa się cięcie
cesarskie. Przeważyć powinny wyniki hodowli komórkowej
(jeśli są dostępne) i ocena kliniczna.
12.6. Test może nie wykryć nieżywych lub nie dających się
hodować wirusów HSV ani ich antygenów.
12.7. Wyniki testu powinno się interpretować w połączeniu z
danymi epidemiologicznymi, oceną kliniczną chorego I
innymi badaniami diagnostycznymi.
13.
SPODZIEWANE WYNIKI
Odsetek wyników dodatnich różni się dla różnych populacji,
rejonów geograficznych, sposobu pobierania próbek, obchodzenia
się z nimi, przechowywania, transportowania, zachowań
seksualnych i ogólnego stanu zdrowia otoczenia populacji
poddanej badaniom.
Wirus Herpes simplex jest zakażeniem obecnym na całym świecie
i ponad 80% dorosłej populacji przebyło zakażenie pierwotne, z
czego w części było to zakażenie bezobjawowe9. W następstwie
pierwotnego zakażenia około 45% osób zakażonych przez jamę
ustną i około 60% osób z zakażeniem narządów płciowych będzie
cierpiało z powodu nawracających ponownych zakażeń10.
Zakażenia wirusem Herpes simplex oka są głównym powodem
wizyt w klinikach okulistycznych10. Wirusa HSV wyizolowano z
narządów płciowych od 0,3 do 5,4% mężczyzn i 1,0 to 8,0% kobiet
Każda próbka została uznana za dodatnią w teście IDEIA HIV, jeśli
absorbancja próbki przy długości fali 492nm była większa niż
zalecana wartość odcięcia (patrz sekcja 11.1). Próbkę uznawano
za dodatnią w hodowli komórkowej, jeśli obserwowano
charakterystyczny efekt cytopatyczny powodowany przez HSV.
Dodatnie hodowle komórkowe zbadano pod kątem typu wirusa w
dwóch z trzech ośrodków badawczych, przy użyciu bezpośredniej
immunofluorescencji. Z 37* dodatnich próbek badanych w
Centrum 1, oceniono 15/37 (40,5%) jako typ 1 i 22/37 (59,5%)
jako typ 2. W Centrum 4, oceniono 14/71 (19,7%) jako typ 1 i
57/71 (80,3%) jako typ 2.
*(cztery dodatnie próbki nie były dostępne do typowania).
Wyniki testu IDEIA HSV zgadzały się z wynikami hodowli
komórkowej w 1302 na 1375 próbek, ogólna zgodność wynosiła
94,7%.
Usunięcie 29 rozbieżnych, “fałszywie dodatnich” wyników testu
IDEIA HSV po zbadaniu dostępnych szczegółów klinicznych
spowodowało, że całkowita zgodność wyników wynosiła 96,8%
(1331/1375).
14.2. CHARAKTERYSTYKA WYNIKÓW TESTU
Czułość*
Ogólnie czułość testu IDEIA HSV wynosiła 93,6% (307/328).
Swoistość*
Ogólna swoistość testu IDEIA HSV wynosiła 97,8% (1024/1047).
Wartości predykcyjne*
Ogólnie wartości predykcyjne dodatnie I ujemne testu IDEIA HSV
wynosiły odpowiednio 93,0% (307/330) i 98,0% (1024/1045).
Tabela 14.2:
Powtarzalność wewnątrz testu i między
testami testu IDEIA HSV
*Po usunięciu 29 “fałszywie dodatnich” wyników testu IDEIA HSV,
(patrz tabela 14.2).
14.3. DOKŁADNOŚĆ TESTU
Tabela 14.2 pokazuje wyniki badania dokładności testu IDEIA HSV.
Wewnątrz testu (n = 3)
Poziom
antygenu
DZIEŃ 1
Średnia
SD
Średnia
SD
DZIEŃ 3
% CV
Średnia
SD
% CV
Średnia
SD
% CV
Ujemny
0,105
0,005
4,9
0,104
0,006
5,4
0,108
0,005
4,6
0,106
0,005
nisko dodatni
0,275
0,010
3,5
0,287
0,010
3,7
0,247
0,003
1,2
0,270
0,019
7,0
wysoko dodatni
1,279
0,079
6,2
1,205
0,080
6,6
1,100
0,037
3,4
1,195
0,100
8,4
15.
5,0
PIŚMIENNICTWO
Badano kontrolne zawiesiny o trzech poziomach antygenu
HSV w medium transportowym testu IDEIA HSV w triplikatach,
trzykrotnie różnymi testami (w sumie 9 oznaczeń). Wyniki
wyrażono jako jednostki absorbancji przy długości fali 492 nm. Dla
oznaczonego zakresu wyników współczynniki zmienności CV dla
oznaczeń wewnątrz testu I między testami wynosiły odpowiednio
1.2 do 6.6% i 5.0 do 8.4%.
1.
Adam E. (1982)
Herpes simplex virus infections. In Herpes virus infections clinical
aspects
Glaser R, ed. Marcel Dekker Inc New York pp 1-55.
Nahmias AJ and Josey WE (1976)
14.4. REAKTYWNOŚĆ KRZYŻOWA
Następujące mikroorganizmy, w stężeniu około 107
mikroorganizmów/mL w hodowlach nie wirusowych, I około 50100% CPE dla hodowli wirusowych, nie wykazały reakcji w teście
IDEIA HSV.
3.
Acholeplasma laidlawii
Acinetobacter spp
Aeromonas spp
Bacteroides spp
Campylobacter spp
Candida spp
Citrobacter spp
Chlamydia trachomatis
Clostridium spp
Cytomegalovirus
Enterobacter spp
Epstein Barr Virus
Escherichia coli
Gardnerella spp
Haemophilus influenzae
Klebsiella spp
Lactobacillus spp
Listeria spp
Mycoplasma spp
Neisseria gonorrhoeae
Peptococcus spp
Peptostreptococcus spp
Proteus spp
Pseudomonas spp
Salmonella spp
Serratia spp
Shigella spp
Staphylococcus aureus (cowan 1 strain)
Staphylococcus spp (coag.neg)
Staphylococcus spp (coag.pos)
Streptococcus spp
Trichomonas spp
Ureaplasma urealyticum
Varicella zoster virus
Veillonella spp
Tabela 14.1:
Porównanie wyników testu IDEIA HSV i
hodowli komórkowej
IDEIA HSV TEST
WARTOŚCI PREDYKCYJNE
2.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Epidemiology of herpes simplex virus 1 and 2. In Viral infections of
humans, Epidemiology and control.
Evans AS, ed J Wiley and Sons, London pp 253-271.
Stanley CJ, Johannsson A and Self CH (1985)
Enzyme amplification can enhance both the speed and the sensitivity
of immunoassays.
Journal of Immunological Methods 83: 89-95.
Buckmaster A (1987)
Monoclonal antibodies to HSV. In Herpes Simplex Virus: New
technologies in diagnostics. Eds Freke A and Sherwood D. Boots-Celltech
Diagnostics Ltd. Symposium Proceedings pp 16-20.
Drew WL and Rawls WE (1985)
Herpes Simplex Viruses
Chapter 64 in Manual of clinical Microbiology, Fourth edition, eds by
Lennette EH, Balows A, Hausler WJ Jr and Shadomy HJ, published by
American Society for Microbiology, pp 705-710.
Lennette DA (1985)
“Collection and Preparation of Specimens for Virological Examination”,
Chapter 61 in Manual of Clinical Microbiology, Fourth edition, eds by
Lennette EH, Balows A, Hausler WJ Jr and Shadomy HJ, published by
American Society for Microbiology, pp 687-693.
Moseley RC, Corey L, Benjamin D, Winter C and Remington ML
(1981)
Comparison of Viral Isolation, Direct Immunofluorescence and Indirect
Immunoperoxidase Techniques for Detection of Genital Herpes Simplex
Virus Infection.
Journal of Clinical Microbiology 13: 913-918.
“The (herpes) helper (1984)” published by the American Social Health
Association, Box 100, Palo Alto, CA 94302. Fall 1984 pp 7.
Nahmias AJ and Roizman B (1973)
*
Infection with herpes-simplex virus 1 and 2.
New England Journal of Medicine 289: 667-74.
10. Longson M (1987)
1 (UK)
35,3%
(41/116)
90,2%
(37/41)
90,2%
(37/41)
98,7%
(74/75)
98,7%
(74/75)
97,3%
(37/38)
97,3%
(37/38)
94,9%
(74/78)
94,9%
(74/78)
2 (UK)
36,9%
(89/241)
89,9%
(80/89)
90,2%
(83/92)
94,1%
(143/152)
96,0%
(143/149)
89,9%
(80/89)
93,3%
(83/89)
94,1%
(143/152)
94,1%
(143/152)
BADANIE
% POTWIERDZENIA
CZUŁOŚĆ
HODOWLĄ
KOMÓRKOWĄ
SWOISTOŚĆ
*
DODATNIE
*
UJEMNE
*
3 (UK)
12,7%
(98/774)
94,9%
(93/98)
95,5%
97,5%
(106/111) (659/676)
99,4%
(659/663)
84,5%
(93/110)
96,4%
(106/110)
99,2%
(659/664)
99,2%
(659/664)
4 (US)
29,1%
(71/244)
95,8%
(68/71)
96,4%
(81/84)
92,5%
(148/160)
73,1%
(68/93)
87,0%
(81/93)
98,0%
(148/151)
98,0%
(148/151)
sumie
*
85,5%
(148/173)
93,0%
93,6%
95,2%
97,8%
(278/299) (307/328) (1024/1076) (1024/1047)
84,2%
93,0%
(278/330) (307/330)
98,0%
98,0%
(1024/1045) (1024/1045)
Dane w tych kolumnach zostały przeliczone po usunięciu 29
“fałszywie dodatnich” wyników IDEIA. Próbki te pochodziły
od chorych, którzy zostali wskazani jako pozytywni w innych
badaniach, mieli partnerów HSV-dodatnich lub byli w
przeszłości zakażeni HSV.
Herpes simplex in Principles and Practice of Clinical Virology (eds AJ
Zuckerman et al), John Wiley and Sons Limited. Chapter 1.1 pp 3-20.
11. Corey L, Adams HG, Brown ZA and Holmes (1983)
Genital herpes simples virus infection: clinical manifestations course
and complications.
Annals International Medicine 98: 918-72.
12. Corey L and Holmes KK (1983)
IFU X7845 Zmieniony grudnia 2013
Między testami (n = 9)
DZIEŃ 2
% CV
PORADY TECHNICZNE I SERWIS DLA KLIENTA
Genital herpes simplex virus infections: current concepts in diagnosis,
therapy and presentation.
Annals International Medicine 98: 973-83.
OXOID Limited, Wade Road, Basingstoke,
Hampshire, RG24 8PW, Wielka Brytania
W sprawie wszelkich pytań proszę kontaktować się z miejscowym
przedstawicielem lub dystrybutorem Oxoid.