IMAGEN Adenovirus [PL] - Thermo Fisher Scientific

IMAGEN™ Adenovirus
PL
K610011-2...................50 Testy
1. PRZEZNACZENIE
Test IMAGEN™ Adenovirus jest testem immunofluorescencji
bezpośredniej służącym do wykrywania antygenu adenowirusa
w próbkach klinicznych oraz potwierdzania obecności wirusa w
hodowlach komórkowych.
2. PODSUMOWANIE
Adenowirusy są bezotoczkowymi wirusami DNA o symetrii
dwunastościennej. Rodzina Adenoviridaen składa się z
dwóch wirusów: adenowirusów ssaków (Mastadenoviruses) i
adenowirusów ptaków (Aviadenoviruses).1 Za pomocą testów
hemaglutynacji, neutralizacji, hybrydyzacji DNA i analizy
endonukleazy restrykcjnej DNA adenowirusów zidentyfikowano
i scharakteryzowano co najmniej 47 serotyopów ludzkich
adenowirusów.1,2,3,4
Ludzkie adenowirusy zarówno u osób immunokompetentnych
jak i nieodpornych, powodują wiele różnych chorób do których
zalicza się infekcje dróg oddechowych, zapalenie spojówek i
przewodu pokarmowego.3,5
Infekcje są częste u dzieci i mogą zdarzać się sporadycznie lub
mieć charakter epidemiczny. Z infekcją adenowirusem wiąże się
około 5% ostrych chorób dróg oddechowych u dzieci i 10% chorób
gorączkowych i przypadków zapaleń płuc u dzieci.3,6,7
Adenowirusowe infekcje oczu mogą prowadzić do gorączki
gardłowo-spojówkowej, pęcherzykowego zapalenia spojówek lub
epidemicznego zapalenia rogówki i spojówki. 3,8
Serotypy adenowirusów 40 i 41 są powszechnie uznawane za
przyczynę zapalenia żołądka i jelit u niemowląt i uważa się,
że odpowiadają za 4-15% zakażeń szpitalnych na oddziałach
pediatrycznych3,9,10. U pacjentów z obniżoną odpornością (np.
pacjentów po przeszczepach lub z AIDS) mogą wystąpić poważne
infekcje ogólnoustrojowe, które mogą zagrażać życiu.3
Laboratoryjna diagnoza infekcji adenowirusowej odgrywa istotną
rolę w leczeniu pacjenta i umożliwia efektywne postępowanie
w przypadku wystąpienia i opanowywaniu epidemii. Metody
diagnostyczne obejmują bezpośrednie wykrywanie wirusa lub
białek wirusa w próbkach klinicznych (np. w aspiratach nosowogardzielowych), izolację żywotnych wirusów w monowarstwach
hodowli komórkowych inokulowanych próbkami z układu
oddechowego, spojówek lub kałowych oraz wykrywanie
adenowirusa swoistymi immunoglobulinami.3,5
Izolacja adenowirusa z próbek klinicznych może być
przeprowadzona w ciągłych liniach komórek, głównie
pochodzenia nabłonkowego, w tym w liniach HeLa, HEp-2, KB oraz
293, w których adenowirusy mogą wykazywać charakterystyczne
działanie cytopatyczne.3,5
Zastosowano wiele różnych technik potwierdzania identyfikacji
izolatów adenowirusów, w tym testy neutralizacji, testy
radioimmunologiczne,
hybrydyzację
DNA,
mikroskopię
elektronową oraz techniki elektoforegramów DNA.11,12,13,14,15
Metody te mogą być skomplikowane, pracochłonne i często nie
nadawać się do rutynowych zastosowań.
Niedawno opisano testy immunofluorescencji oraz enzymatyczne
testy immunologiczne (np. IDEIA™ Adenovirus) wykorzystujące
przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne, do bezpośredniego
wykrywania obecności adenowirusa w próbkach klinicznych lub
monowarstwach kultur komórkowych.15, 16, 17
Testy immunofluorescencji bezpośredniej, wykorzystujące
swoiste przeciwciała monoklonalne są szybką, czułą i swoistą
metodę bezpośredniego wykrywania adenowirusów w próbkach
klinicznych, takich jak aspiraty nosowo-gardzielowe i wymazy
spojówkowe lub do potwierdzania izolatów adenowirusa w
monowarstwach kultur komórkowych.
Test IMAGEN™ Adenowirus jest testem immunofluorescencji
bezpośredniej do wykrywania i identyfikacji serotypów
adenowirusów w próbkach klinicznych lub hodowlach
komórkowych. W teście wykorzystuje się swoiste dla rodzaju
przeciwciało monoklonalne, wykrywające epitop białka heksonu
adenowirusa, które ulega ekspresji we wszystkich znanych
serotypach ludzkiego adenowirusa.18
3. ZASADA TESTU
Odczynnik testu IMAGEN™ Adenovirus zawiera przeciwciało
monoklonalne skoniugowane z izotiocyjanianem fluorosceiny
(FITC). Skoniugowany odczynnik wiąże się swoiście z epitopem
wspólnym dla białka heksonu, występującego we wszystkich
serotypach ludzkiego adenowirusa. Odczynnik jest używany w
jednoetapowej bezpośredniej technice immunofluoroscencji.
Próbki są inkubowane z odczynnikiem przeciwciała
skoniugowanym z FITC przez 15 minut, a następnie nadmiar
odczynnika jest wypłukiwany za pomocą zbuforowanego roztworu
soli fizjologicznej (PBS). Miejsca wybarwione są mocowane i
poddawane obserwacji pod mikroskopem przy użyciu oświetlenia
epifluoroscencyjnego. Jeśli obecny jest adenowirus, obserwuje
się charakterystyczną fluorescencję w kolorze zielonego jabłka,
wewnątrz cytoplazmy i/ lub jądra komórkowego zainfekowanych
komórek, która kontrastuje z czerwonym tłem komórek nie
zainfekowanych.
Podziękowania
Zastosowane w teście przeciwciało monoklonalne pochodzi z
Division of Microbiological Reagents and Quality Control, Central
Public Health Laboratory, Colindale, London, Wielka Brytania.
4. DEFINICJE
Poniższe symbole zostały użyte w informacji o produkcie.
Nr Katalogowy
Sprawdzić w instrukcji stosowania
N
Zawiera ilość materiału wystarczającą do <n> badań
Producent
Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro
Zużyć przed
Numer serii
Temperatura przechowywania
5. DOSTARCZONE ODCZYNNIKI
50 – Każdy zestaw zawiera materiały wystarczające do 50
bezpośrednich próbek lub preparatów kultury komórkowej.
- Okres przechowywania produktu podano na etykiecie
zewnętrznego opakowania.
5.1.
ODCZYNNIK IMAGEN™ ADENOVIRUS
instrukcji użytkowania
Dwa szkiełka kontroli dodatniej z jedną
studzienką, zawierającą utrwalone w
acetonie komórki ludzkiego nabłonka (Hep-2)
zainfekowane adenowirusem.
Jedna butelka każdego z następujących komponentów:
6.2. AKCESORIA
Do użytku w połączeniu z testem IMAGEN™ Adenovirus
przeznaczone są następujące produkty. Więcej informacji można
uzyskać w najbliższej u dystrybutora.
Pokryte teflonem szkiełka mikroskopowe z pojedynczą studzienką
o średnicy 6mm (100 płytek w pudełku) można uzyskać w
S611430-6).
najbliższej u dystrybutora (nr kat.
Positive Control Slide (nr kat.
S611330-2).
7. WYPOSAŻENIE
Wymagane jest następujące wyposażenie:
Pipeta precyzyjna i jednorazowe końcówki do przenoszenia 25μL.
Kąpiel przemywająca
3mL płynu do mocowania. Środek zawiera
inhibitor fotowybielania w roztworze glicerolu
(pH 10,0).
1 , 4 m L o d c z y n n i ka t e s t u I M A G E N ™
Adenovirus. Odczynnik zawiera oczyszczone
mysie przeciwciała monoklonalne swoiste
dla wspólnego epitopu w białku heksonu
adenowirusa, skoniugowane z FITC.
Koniugat jest przygotowywany w roztworze
buforu stabilizowanego białkiem (pH 7,5),
zawierającym błękit Evansa jako barwienie
ujemne i azydek sodu w stężeniu 15mmol/L
jako środek konserwujący.
5.2. PRZYGOTOWANIE, PRZECHOWYWANIE I POWTÓRNE
UŻYWANIE SKŁADNIKÓW ZESTAWU
Dla zapewnienia optymalnych parametrów zestawu ważne jest
przechowywanie niezużytych składników zestawu w warunkach
zgodnych z następującymi instrukcjami:
Szkiełka nakrywkowe nadające się do przykrycia studzienki o
średnicy 6mm.
5.2.1
SZKIEŁKA KONTROLI DODATNIEJ Szkiełka kontroli dodatniej są dostarczane opakowane osobno,
każde w torebce foliowej zawierającej azot. Nieużyte szkiełka
przechowywać w temperaturze 2-8°C. Przed otwarciem
opakowania szkiełka powinny być pozostawione na 5 minut w
temperaturze pokojowej (15-30°C).
Linie komórek zalecane do hodowli i izolacji adenowirusów.
Barwić szkiełko natychmiast po rozpakowaniu.
5.2.2
PŁYN DO MOCOWANIA Gotowy do użycia. Płyn do mocowania przechowywać w
temperaturze 2-8°C. Płyn do mocowania powinien być
pozostawiony w temperaturze pokojowej(15-30°C) przez 5 minut
przed użyciem.
5.2.3
ODCZYNNIK Gotowy do użycia. Niezużyty odczynnik przechowywać w
temperaturze 2-8°C. Odczynnik przechowywać w ciemnym
miejscu w temperaturze 2-8°C i przed użyciem pozostawić na
5 minut w temperaturze pokojowej (15-30°C).
6. DODATKOWE ODCZYNNIKI
6.1. ODCZYNNIKI
Świeży aceton (do utrwalania).
Zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS) o pH 7,5 do
przepłukiwania wybarwionych próbek i do przygotowywania
próbek.
Niefluorescencyjny olejek imersyjny.
Mikroskop epifluoroscencyjny z systemem filtrów do FITC
(maksymalna długość fali wzbudzenia 490nm, średnia długość fali
emisji 520nm) i powiększenie x200 x 500.
Inkubator przy 37°C.
Wolnoobrotowa wirówka.
Do próbek bezpośrednich
Sterylne waciki.
Urządzenie do pobierania śluzu (tylko próbki z nosogardła).
Do potwierdzenia wyników kultury
Sterylne waciki, medium do przenoszenia wirusów (VTM) oraz
pojemnik odpowiedni do pobierania, przenoszenia i hodowania
adenowirusów.
8. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
- Do badań diagnostycznych in vitro. Każda osoba
wykonująca test przy użyciu tego produktu musi być przeszkolona
w zakresie jego używania i musi mieć doświadczenie w
procedurach laboratoryjnych.
8.1. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
8.1.1
Odczynniki testu IMAGEN™ Adenovirus zawierają
azydek sodu o stężeniu <0.1%, który jest trujący. Azydek
sodu może reagować z miedzianymi i ołowianymi
elementami kanalizacji tworzącymi wybuchowe azydki
metalu. Zawsze usuwać materiały zawierające azydek
spłukując je dużą ilością wody.
8.1.2
Wykazano, że adenowirusy na szkiełkachkontroli
dodatniej nie są zakaźne w kulturze komórkowej,
jednakże ze szkiełkiem należy się obchodzić i usuwać
jako materiał potencjalnie zakaźny.
8.1.3
Odczynnik zawiera barwnik w postaci błękitu Evansa.
Stężenie barwnika jest na tyle niskie, że produktu nie
klasyfikuje się jako środka rakotwórczego. Należy jednak
unikać kontaktu ze skórą.
8.1.4
Należy zachować ostrożność przy stosowaniu płynu
do mocowania, ponieważ może on powodować
podrażnienie skóry. Jeśli dojdzie do takiego kontaktu
skórę należy spłukać wodą.
8.1.5
Nie jeść, nie pić, nie palić, nie przechowywać ani nie
przygotowywać żywności oraz nie stosować kosmetyków
w obrębie wyznaczonego miejsca pracy.
Nie pipetować materiału ustami.
Używać rękawiczek jednorazowych przy pracach z
próbkami klinicznymi i zakażonymi komórkami, zawsze
myć ręce po pracy z zakaźnymi materiałami.
8.1.8
Wszystkie próbki kliniczne usuwać zgodnie z lokalnymi
przepisami.
8.1.9
Na żądanie dostępne są Karty charakterystyki
bezpieczeństwa materiału.
8.2. TECHNICZNE ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
8.2.1
Nie używać składników po upływie daty ważności
wydrukowanej na etykietkach. Nie mieszać i nie
wymieniać odczynników z różnych partii/ serii.
8.2.2
Odczynniki są dostarczane w stałych stężeniach
roboczych. Modyfikacja odczynników lub ich
przechowywanie w warunkach innych niż podane w
Rozdziale 5 niekorzystnie wpłynie na wyniki testu.
8.2.3
Świeży zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS)
przygotować zgodnie z wymaganiami w dniu użycia.
8.2.4
Jeśli jest to konieczne, przepłukiwać w PBS. Użycie
innych płynów do przepłukiwania, takich jak woda
wodociągowa lub destylowana wpłynie na pogorszenie
wyników.
8.2.5
Unikać mikrobiologicznego skażenia odczynników.
8.2.6
Odczynników nie wolno zamrażać.
9. POBIERANIE I PRZYGOTOWYWANIE PRÓBEK
Pobieranie i przygotowywanie próbek ma fundamentalne
znaczenie przy diagnozie adenowirusa metodami bezpośredniej
immunofluorescencji i hodowli komórkowej. Próbki musza być
pobierane z miejsca infekcji w czasie największej aktywności
wirusa, tak aby zawierały jak najwięcej zainfekowanego materiału
i przygotowane w taki sposób, aby zachować albo nienaruszone
komórki wolne od przylegającego śluzu itp. do bezpośredniej
obserwacji próbek pod mikroskopem, albo żywotność wirusów w
próbkach, które mają być hodowane.
8.1.6
8.1.7
9.1. PRÓBKI KLINICZNE
9.1.1 Próbki oczne
Pobieranie
Zastosować w oku lokalne znieczulenie, następnie obnażyć górną i
dolna spojówkę. Przy użyciu wacika o bawełnianej lub dakronowej
(Dacron™) końcówce energicznie przetrzeć powierzchnie
zarówno górnej jak i dolnej spojówki, obracając wacik w czasie
pobierania próbki, aby mieć pewność, że próba została pobrana z
całej powierzchni spojówek.
Przygotowanie płytek
Obracać wacik z próbką, lekko ja naciskając, w obrębie 6mm
powierzchni studzienki szkiełka mikroskopowego. Upewnić się,
że do przygotowania szkiełka użyto całego koniuszka wacika.
Pozostawić próbkę do dokładnego wyschnięcia na powietrzu
w temperaturze pokojowej (15-30°C), a następnie utrwalać w
świeżym acetonie przez 10 minut. Pozwolić, aby szkiełko wyschło
na powietrzu. Jeśli próbka nie zostaje natychmiast wybarwiona,
pozostawić ją na noc w temperaturze 4°C.
9.1.2
Aspiraty/ wydzieliny nosogardłowe
Pobieranie
Pobrać próbki z rejonu nosogardła do ekstraktora śluzu za pomocą
rurki o rozmiarze 8. Zachowując temperaturę 2-8°C należy jak
najszybciej dostarczyć do laboratorium ekstraktor śluzu i rurki w
celu dokonania badań.
Rozdzielanie komórek
Jeśli potrzeba, przed wirowaniem dodać do próbki 2mL
zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej (PBS) w celu
zmniejszenia lepkości i rozpuszczenia śluzu. Wirować ekstraktor
śluzu w temperaturze pokojowej (15- 30°C) przez 10 minut przy
380g. Usunąć supernatant, który może być użyty do kultury
komórkowej. Ponownie przygotować zawiesinę osadu komórek
w 2mL PBS i delikatnie wykonać mieszanie przy użyciu pipety
kilkakrotnie napełniając i wydmuchując objętość pipetyo
szerokim otworze lub delikatnie zamieszać, aż śluz się rozdzieli i
zostanie uwolniony materiał komórkowy. Unikać gwałtownego
pipetowania/ mieszania, aby nie uszkodzić komórek. Po uzyskaniu
jednolitej zawiesiny dodać więcej PBS, zgodnie z wymaganiami,
wykonując mieszanie za pomocą pipety lub mieszając po
dodaniu dodatkowego PBS, żeby dokładniej przepłukać
komórki. Usunąć wszelkie widoczne drobiny śluzu, które jeszcze
pozostały. Nadmierna ilość śluzu musi zostać usunięta, ponieważ
przeszkadzałaby w odpowiednim przenikaniu odczynnika i
mogłaby spowodować nieswoistą fluorescencję.
Jeśli wszystkie wydzieliny pozostają w rurce i nic nie dociera
do ekstraktora, wypłukać je z rurki do PBS. Najlepiej zrobić
to wkładając pipetę typu Pasteur’a do końca rurki, która była
przymocowana do ekstraktora śluzu. Zasysać odpowiedni płyn do
rurki i wydmuchiwać go, dopóki nie zostaną uwolnione wydzieliny
przylegające do ścinki rurki. Zasysać do pipety zawiesinę i uwalniać
ją dopóki śluz nie zostanie odpowiednio rozdrobniony.
Przygotowanie szkiełek
Po zakończeniu procedury rozdzielania komórek odwirować
powstałą zawiesinę komórkowa w temperaturze pokojowej (1530°C) przez 10 minut przy 380g i odrzucić supernatant. Ponownie
przygotować zawiesinę komórek w odpowiedniej ilości PBS, aby
rozpuścić cały pozostały śluz, zachowując zarazem wysoką gęstość
komórek. Umieścić 25mL ponownie przygotowanej zawiesiny
komórek w miejscu studzienek na szkiełku. Pozostawić próbkę do
dokładnego wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej
(15-30°C) i utrwalić w świeżym acetonie przez 10 minut w
temperaturze pokojowej. Jeśli próbka nie zostaje natychmiast
wybarwiona, zostawić na noc w temperaturze 4°C lub zamrozić w
–20°C w przypadku dłuższego okresu przechowywania.
9.2. HODOWLA KOMÓRKOWA
Inokulacja kultur komórkowych
Próbki pobrane w celu dokonania diagnozy infekcji adenowirusem
powinny być inokulowane w linie komórek rutynowo stosowanych
w laboratorium, metodami przyjętymi w laboratorium. Kultury
komórkowe powinny być regularnie badane w kierunku działania
cytopatycznego (CPE), powinny być też w regularnych odstępach
przeprowadzane testy hemadsorpcyjne. Wszystkie hodowle
dodatnie w teście hemadsorpcyjnym lub hodowle komórek
wykazujące CPE mogą być pobierane i badane w kierunku
adenowirusów.
Przygotowanie szkiełek
Jeśli obserwuje się hemadsorpcję lub CPE odpowiadające infekcji
adenowirusem, to monowarstwa kultury komórkowej powinna
być zebrana, kiedy co najmniej 50% komórek jest zarażonych.
Używając sterylnej pipety zebrać warstwę komórek do płynnej
pożywki. Wytrącić komórki przez wirowanie przy 200g przez
10 minut w temperaturze pokojowej (15-30°C) i usunąć
supernatant.
Przepłukać komórki przez powtórne przygotowanie zawiesiny
osadu komórek w PBS (patrz Rozdział 8.2) i powtórzyć wirowanie.
Usunąć supernatant i powtórnie przygotować zawiesinę osadu
komórek w niewielkiej objętości świeżego PBS, aby utrzymać
wysoką gęstość komórek.
Umieścić objętości zawiesiny komórek równe 25μL w
poszczególnych studzienkach na płytkach. Pozostawić próbkę
do dokładnego wyschnięcia na powietrzu i utrwalać w świeżym
acetonie przez 10 minut w temperaturze pokojowej (15-30°C).
Jeśli próbka nie zostaje natychmiast wybarwiona, zostawić
szkiełka na noc w temperaturze 4°C lub zamrozić w –20°C w
przypadku dłuższego okresu przechowywania.
10. PROCEDURA TESTU
PRZED PRZEPROWADZENIEM PROCEDURY TESTOWEJ NALEŻY
ZAPOZNAĆ SIĘ Z TREŚCIĄ ROZDZIAŁU 8.2 TECHNICZNE ŚRODKI
OSTROŻNOŚCI
10.1. DODAWANIE ODCZYNNIKA
Do każdej 6mm studzienki dodać 25μL odczynnika. Upewnić się,
że odczynnik pokrywa całą powierzchnię każdej studzienki.
10.2. PIERWSZA INKUBACJA
Inkubować szkiełka z odczynnikiem w wilgotnej komorze przez
15 minut przy temperaturze 37°C. Nie pozwolić, aby odczynnik
wysechł na próbce, ponieważ spowoduje to pojawienie się
nieswoistego zabarwienia.
10.3. PRZEPŁUKIWANIE SZKIEŁKA
Wypłukać nadmiar odczynnika za pomocą zbuforowanego
roztworu soli fizjologicznej (PBS) a następnie delikatnie
przez 5 minut przepłukiwać szkiełko w kąpieli z mieszadłem
zawierającej PBS. Odsączyć PBS i wysuszyć szkiełko na powietrzu
w temperaturze pokojowej (15-30°C).
10.4. DODAWANIE PŁYNU DO MOCOWANIA
Dodać jedną kroplę płynu do mocowania IMAGEN™ Adenovirus
do centrum każdej studzienki i umieścić szkiełko nakrywkowe
na płynie do mocowania i próbce, upewniając się, że nie zostały
uwięzione żadne pęcherzyki powietrza.
10.5. ODCZYTYWANIE SZKIEŁKA
Obejrzeć cały obszar studzienki zawierającej wybarwione próbki
przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego. Fluoroscencja
opisana w Rozdziale 11, powinna być widoczna przy powiększeniu
x200-x500. (Najlepsze wyniki uzyskuje się, jeśli oględzin
dokonuje się bezpośrednio po barwieniu, ale próbki mogą być
przechowywane do 24 godzin w ciemności w temperaturze
2-8°C).
11. INTERPRETACJA WYNIKÓW TESTU
11.1. KONTROLE
11.1.1 Szkiełko kontroli dodatniej
W przypadku barwieniu i oglądaniu zgodnie z opisem w Rozdziale
10, szkiełko kontroli dodatniej powinno zawierać komórki z
widoczną wewnątrzkomórkową, jądrową i/ lub cytoplazmatyczną,
soczyście zieloną fluorescencją, kontrastującą z czerwienią
tła materiału zabarwionego negatywnie. Komórki te są nieco
większe niż komórki nabłonka układu oddechowego lub nabłonka
spojówkowego, ale wykazują podobną wewnątrzkomórkową,
jądrową i/ lub cytoplazmatyczną fluorescencję przy infekcji
adenowirusem. Aby przekonać się, czy procedura barwienia
została przeprowadzona w sposób zadowalający, należy
zastosować szkiełka kontroli dodatniej.
11.1.2 Kontrola ujemna:
Jeśli potrzebne jest szkiełko kontroli ujemnej, zaleca się
zastosowanie nie zainfekowanych, nienaruszonych komórek tego
samego typu, co użyte do hodowli i izolacji adenowirusa. Komórki
powinny być przygotowane i utrwalone zgodnie z opisem w
Rozdziale 9.2 i wybarwione zgodnie z opisem w Rozdziale 10.
11.2. PRÓBKI KLINICZNE
11.2.1 Wygląd komórek zainfekowanych przez adenowirusa
W komórkach nabłonka układu oddechowego lub nabłonka
spojówkowego zainfekowanego adenowirusem widoczna jest
wewnątrzkomórkowa, jądrowa i/ lub cytoplazmatyczna, ziarnista,
soczyście zielona fluorescencja.
Nie zainfekowane komórki barwią się na czerwono przy
negatywnym barwieniu błękitem Evansa.
11.2.2 Interpretacja wyników
Diagnoza dodatnia stawiana jest, kiedy jedna lub więcej komórek
w utrwalonej, wybarwionej próbce wykazuje typowy wzór
fluorescencji, opisany w Rozdziale 11.2.1.
Ujemną diagnozę stawia się wtedy, gdy utrwalone, wybarwione
próbki nie wykazują fluorescencji z odczynnikiem.
W przypadku bezpośrednio barwionych próbek aspiratów z
nosogardła lub próbek ocznych, zanim poda się wynik ujemny
należy zaobserwować co najmniej 20 nie zainfekowanych komórek
nabłonka układu oddechowego lub nabłonka spojówkowego.
Jeśli obecne są komórki niedostatecznie wybarwione patrz
rozdział 11.2.3
11.2.3 Komórki niedostatecznie wybarwione
Jeśli na szkiełku obecne są niedostatecznie wybarwione komórki,
to pozostała część próbki klinicznej powinna być wirowana przez 10
minut przy 380g w temperaturze pokojowej (15-30°C). Ponownie
przygotować zawiesinę komórek wmniejszej objętości PBS
przed powtórnym przeniesieniem (25μL) do obszaru studzienki.
Alternatywnie można zażądać powtórnej próbki klinicznej.
11.3. POTWIERDZENIE WYNIKÓW HODOWLI KOMÓRKOWEJ
11.3.1 Wygląd komórek zainfekowanych przez adenowirusa
Zainfekowane komórki będą wykazywać wewnątrzkomórkową,
jądrową i/ lub cytoplazmatyczną soczyście zieloną fluorescencję
i powinny być uznane za dodatnie pod względem obecności
adenowirusa.
Przy negatywnym barwieniu błękitem Evansa niezainfekowane
komórki zabarwią się na czerwono.
11.3.2 Interpretacja wyników
Diagnozę dodatnią stawia się, kiedy co najmniej jedna utrwalona,
wybarwiona komórka wykazuje po barwieniu wzór fluorescencji
opisany w Rozdziale 11.3.1.
Przed przedstawieniem wyniku ujemnego, w studzience szkiełka
musi być obserwowanych co najmniej 50 niezainfekowanych
komórek z hodowli komórkowej. Jeśli obecne są komórki
niedostatecznie wybarwione patrz rozdział 11.3.3.
11.3.3 Komórki niedostatecznie wybarwione
Jeśli na płytce obecne są niedostatecznie wybarwione komórki,
to pozostała część próbki klinicznej powinna zostać odwirowana
przez 10 minut przy 200g w temperaturze pokojowej (15-30°C).
Ponownie przygotować zawiesinę komórek wmniejszej objętości
PBS przed powtórnym przeniesieniem (25μL) do obszaru
studzienek.
Alternatywnie, należy powtórnie inokulować nowa próbkę na
świeże pojedyncze warstwy komórek, także hodowla komórkowa
powinna zostać powtórzona.
12. OGRANICZENIA DZIAŁANIA
12.1. Stosować wyłącznie płyn do mocowania dostarczony
razem z testem IMAGEN™ Adenovirus.
12.2. Wygląd obrazu fluorescencji może różnić się zależnie od
typu mikroskopu i zastosowanego źródła światła.
12.3. Zaleca się, aby do pokrycia obszaru studzienki o średnicy
6mm zastosować 25μL odczynnika. Zmniejszenie tej
objętości może spowodować trudności z pokryciem
miejsca zajmowanego przez próbkę i zmniejszyć czułość.
12.4. Odczynniki są dostarczane w stałych stężeniach roboczych.
Jeśli odczynniki będą w jakikolwiek sposób modyfikowane
i przechowywane w warunkach innych niż zalecane w
Rozdziale 5, może to mieć wpływ na przebieg testu.
12.5. Brak wykrycia adenowirusa może być wynikiem
takich czynników jak niewłaściwe pobranie próbki,
nieodpowiednie postępowanie z próbką, nieudana
hodowla komórkowa itd. Wynik ujemny nie wyklucza
możliwości infekcji adenowirusowej.
12.6. Obecność wirusa adenowirusa w wydzielinach
nosogardzielowych niekoniecznie wyklucza możliwość
równoczesnej infekcji innymi patogenami. Wszystkie
dodatnie wyniki powinny być traktowane z ostrożnością
bowiem adenowirus przejawia zdolność do przechodzenia
okresów utajenia i zaostrzania. Bezobjawowe wydalanie
wirusów może zachodzić przez 18 miesięcy od zakażenia.20
Wyniki testu powinny być interpretowane w powiązaniu
z informacjami dostępnymi na podstawie badań
epidemiologicznych, diagnozy klinicznej pacjenta i innych
procedur diagnostycznych.
12.7. Wyniki testu powinny być interpretowane w powiązaniu
z informacjami dostępnymi na podstawie badań
epidemiologicznych, badań klinicznych pacjenta i innych
procedur diagnostycznych.
13. OCZEKIWANE WARTOŚCI
Przedstawiciele różnych podrodzajów wirusa charakteryzują się
tropizmem w stosunku do różnych narządów. Choroby przejawiają
się jednak przede wszystkim infekcjami układu oddechowego,
oczu i układu pokarmowego. Częstość dodatniego wyniku
izolacji różni się, w zależności od użytego tekstu, odpowiedniości
pobierania próbek, wieku testowanej populacji i tego, czy w
badanych populacjach dochodzi do nadmiernego zagęszczenia.
Na częstość izolacji wirusa ma wpływ to, na ile poważne są
choroby powodowane przez wirusa, a także tendencja szczepów
wirusa do wywołania przedłużających się infekcji z wydalaniem
zakaźnego wirusa przez długi okres.
Adenowirusy są przyczyną 5% ostrych infekcji układu
oddechowego u dzieci poniżej 4 roku życia i odpowiadają za 10%
hospitalizowanych przypadków infekcji układu oddechowego
w tej grupie wiekowej.3,6,7 Adenowirusy mogą powodować
krwotoczne zapalenia pęcherza moczowego u dzieci. Uznano,
że adenowirusy jelitowe były przyczyną 4% do 15% wszystkich
przypadków hospitalizacji z powodu zapalenia żołądka i jelit u
dzieci, a najczęstsze są u dzieci w wieku poniżej 3 roku życia.3,11,12
Oczne infekcje adenowirusem (epidemiczne zapalenie rogówki i
spojówek oraz basenowe zapalenie spojówek) mogą występować
w każdej grupie wiekowej, podobnie jaki adenowirusowa infekcja
u pacjentów immunosupresjonowanych. 3,8
U dorosłych, adenowirusy izolowano z szyjki macicy i uszkodzeń
cewki moczowej oraz w przypadku ostrej infekcji układu
oddechowego, szczególnie u personelu wojskowego.
14. CHARAKTERYSTYKA WYNIKÓW DLA KONKRETNYCH
WIRUSÓW
14.1. SWOISTOŚĆ PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNEGO W
STOSUNKU DO SEROTYPÓW ADENOWIRUSÓW
Wykazano, że przeciwciało monoklonalne użyte w tym teście
reaguje ze swoistym dla rodzaju epitopem adenowirusowego
białka heksonu, które występuje we wszystkich ludzkich
serotypach.
14.2. BADANIA KLINICZNE
Test IMAGEN™ Adenovirus był oceniany jako test do
bezpośredniego stosowania w dwóch klinicznych ośrodkach
badawczych, zajmujących się badaniem wydzielin i plwociny
pobieranych od dzieci i dorosłych, hospitalizowanych z objawami
infekcji układu oddechowego. Test był także oceniany w
czołowej klinice okulistycznej zajmującej się badaniem próbek
spojówkowych pobieranych od pacjentów z zapaleniem
spojówek. Trzy ośrodki badawcze zajmowały się oceną testu
IMAGEN™ Adenovirus w zakresie wykrywania adenowirusa w
hodowli komórkowej.
Ośrodki badawcze przebadały 474 próbek klinicznych pobranych
z układu oddechowego i 179 próbek spojówkowych, plus 296
próbek do potwierdzenia wyników hodowli. Standardowymi
testami do próbek bezpośrednich była hodowla komórkowa wraz
z lub bez immunofluorescencji pośredniej, a standardowymi
testami do potwierdzenia wyników hodowli była fluorescencja
pośrednia przeciwciał poliklonalnych lub swoista neutralizacja.
We wszystkich obliczeniach założono, że testy standardowe były
w 100% czułe i swoiste. Czułość, swoistość i wartości predyktywne
były wyliczane tak, jak opisano poprzednio21.
14.3. WYNIKI KLINICZNE
14.3.1 Próbki bezpośrednie
Wydzieliny nosogardłowe
Świeże próbki kliniczne były testowane zimą 1988/89, badano
też przechowywane (zamrożone) próbki zebrane między 1978
a 1988. W dwóch ośrodkach porównywano test IMAGEN™
Adenovirus z metodami wzorcowymi. Przy zastosowaniu metod
wzorcowych wynik uznawano za dodatni, jeśli albo wynik dla
kultury komórkowej albo immunofluroscencji pośredniej był
dodatni. Umożliwiało to wykrycie obecności nieżywotnego wirusa
przez fluorescencję lub komórek pozbawionych wirusa za pomocą
hodowli komórkowej. Próbka była oceniana jako dodatnia w
teście IMAGEN™ Adenovirus kiedy obserwowano 1 lub więcej
fluorozyjących komórek nabłonka (patrz Rozdział 11.2).
W Tabeli 14.1 przedstawiono wyniki dla odczynnika testu
IMAGEN™ Adenovirus. W sumie częstość występowania
adenowirusa w tych populacjach wynosiła 9,1% (43/474). Wyniki
korelowały ze standardowymi testami w 468 przypadkach (98,7%).
Czułość testu IMAGEN™ Adenovirus wyniosła 86,0% (37/43) a
swoistość wyniosła 100% (431/431) Wartości predyktywne dla
wyników dodatnich i ujemnych wynosiły odpowiednio 100%
(37/37) i 98,6% (431/437).
Tabela 14.1
Porównanie wyników testów otrzymanych za
pomocą hodowli komórkowej oraz testu IMAGEN™ Adenovirus
na próbkach nosogardłowych w dwóch ośrodkach badawczych.
Wyniki (Tabela 14.3) wskazują że test IMAGEN™ Adenovirus
wykrywał wszystkie dodatnie izolaty adenowirusa dając czułość
100% (162/162). Swoistość odczynnika wyniosła 100% (134/134).
RODZAJ TESTU
Metoda wzorcowa
IMAGEN™ Adenovirus
Liczba próbek (474)
Tabela 14.3
Porównanie wyników testów otrzymanych
za pomocą testu IMAGEN™ Adenovirus i metod standardowych
potwierdzających wyniki hodowli, przeprowadzone w 3
ośrodkach badawczych.
WYNIK
Uje
Uje
431
Dod
Dod
37
Dod
Uje
6*
Uje
Dod
0
*1)
W 4/6 próbek w hodowli CPE zarejestrowano po okresie
dłuższym niż 10 dni. Może to wskazywać na bardzo niski
początkowy poziom liczebności wirusów w próbce.
2)
2/6 próbki były ujemne w teście immunofluorescencji
pośredniej.
Próbki oczne
Test IMAGEN™ Adenovirus był oceniany w porównaniu z uznanym
systemem hodowli komórkowej. Rozmazy spojówkowe pobrano
od 179 pacjentów z zapaleniem spojówek leczonych w szpitalu
okulistycznym. Częstość występowania infekcji adenowirusem
w populacji, z której pochodziła badana próba wynosiła 19,6%
(35/179). Rozmazy robiono z wacików z próbkami w klinikach,
a następnie waciki były umieszczane w pożywce transportowej
w celu oceny hodowli komórkowej. Próbka była oceniana jako
dodatnia w teście IMAGEN™ Adenowirus, jeżeli zaobserwowano 1
lub więcej fluoryzujących komórek nabłonka (patrz Rozdział 11.2).
W przypadku testu hodowli komórkowej próbka była uznawana
za dodatnia jeśli charakterystyczne działanie cytopatyczne
zostało potwierdzone przez immunofluorescencję pośrednią.
Wyniki tego badania przedstawiono w Tabeli 14.2. Z 179
przetestowanych próbek ten sam wynik otrzymano za pomocą
obu metod w 174 przypadkach po powtórzonym teście, dając
korelację 97,2%. Czułość i swoistość testu IMAGEN™ Adenovirus
wyniosła odpowiednio 91,4% (32/35) i 98,6% (142/144).
Wartości predyktywne dla testów dodatnich i ujemnych wynosiły
odpowiednio 94,1% (32/34) i 97,9% (142/145).
Tabela 14.2
Porównanie wyników testów otrzymanych za
pomocą hodowli komórkowej oraz testu IMAGEN™ Adenovirus
na próbkach ocznych
RODZAJ TESTU
Metoda wzorcowa
IMAGEN™ Adenovirus
Liczba próbek (179)
WYNIK
Uje
Uje
142
Dod
Dod
32
Dod
Uje
3*
Uje
Dod
2**
*
Materiał niewystarczający do powtórnego przetestowania
jednej próbki.
** Obie próbki były hodowane tylko przez dwa dni.
14.3.2 Potwierdzenie hodowli komórkowej
Trzy ośrodki badawcze testowały test IMAGEN™ Adenovirus
na hodowlach komórkowych z próbek klinicznych. Wyniki te
porównano z wynikami immunofluorescencji i/ lub testów
neutralizacji potwierdzających wyniki hodowli. Izolacji
dokonywano w rutynowych liniach komórek użytych do hodowli
adenowirusa. Hodowle komórkowe były przemywane w PBS
przed pobraniem i nałożeniem na szkiełka. Szkiełka były utrwalone
w acetonie a następnie badane za pomocą odczynników testu
IMAGEN™ Adenovirus. Do tych ocen użyto zarówno świeżych
klinicznych izolatów, jak i wcześniej zamrożonych próbek. Oceniono
w sumie 296 hodowli. Dodatnie izolaty z hodowli komórkowych
były potwierdzane albo przez testy immunofluorescencji, albo
neutralizacji.
RODZAJ TESTU
Standardowe potwierdzenie
IMAGEN™ Adenovirus
Liczba próbek (296)
WYNIK
Uje
Uje
134
Dod
Dod
162
Dod
Uje
0
Uje
Dod
0
14.4. REAKTYWNOŚĆ KRZYŻOWA
Test IMAGEN™ Adenovirus był przeprowadzany w zestawieniu
z preparatami innych wirusów i organizmów, których obecność
w próbkach z układu oddechowego i próbkach ocznych, czy
kulturach komórkowych jest prawdopodobna. Wszystkie
testowane organizmy (Tabela 14.4) były ujemne w teście
IMAGEN™ Adenovirus.
Tabela 14.4
Organizmy przetestowane w teście IMAGEN™
Adenovirus, dla których stwierdzono brak reaktywności.
Acholeplasma laidlawii
Branhamella catarrhalis
Candida albicans
Chlamydia psittaci
Chlamydia trachomatis
Coxsackie virus
Cytomegalovirus
Echovirus
wirus Epsteina-Barra
Haemophilus influenzae
Herpes simplex virus
Influenza virus A & B
Legionella pneumophila
wirus odry
Wirus świnki
Mycobacterium avium
Mycobacterium intracellulare
Mycobacterium tuberculosis
Mycoplasma arginini
Mycoplasma hominis
Mycoplasma hyorhinus
Mycoplasma orale
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma salivarium
Neisseria cinerea
Neisseria flavescens
Neisseria gonorrhoea
Neisseria lactamica
Neisseria meningitidis A, B, C1
Neisseria mucosa
Neisseria perflava
Neisseria pharyngis
Parainfluenza virus typy 1,2,3 & 4b
Pneumocystis carinii
Wirus polio typy 1 i 2
Syncytialny wirus oddechowy
Rhinovirus
Staphylococcus aureus
Streptococcus gps A,B,C,D,F,G
Varicella zoster virus
15. PIŚMIENNICTWO
1.
Frankl, R.I.B., Fauquet, C.M., Knudson, D.L., and Brown, F. (1992)
2.
Classification and Nomenclature of Viruses. Fifth Report of the
International Committee on Taxonomy of Viruses. Archives of Virology
Supplement 2, Spurger Velacy, New York, pp 140-144.
Rosen, L. (1960)
3.
Haemagglutination inhibition technique for typing adenoviruses.
American Journal of Hygiene 71, 120-128
Wadell, G. (1990)
4.
Adenoviruses. In Principles and Practice of Clinical Virology (eds A.J.
Zuckerman et al) John Wiley and Sons Ltd, Chapter 4 iv, pp 267-287.
Albert, M.J. (1986)
5.
Enteric Adenoviruses.
Archives of Virology 88, 1-17.
Horwitz, M.S. (1985)
Adenoviral diseases in “Virology”, Raven Press, New York (eds B.N. Fields
et al) pp 477-495.
6.
Mallett, R., Ribierre, M., Bonnenfant, F., Labrune, B., and Reyrole,
L. (1966)
7.
Les pneumopathies graves à adenovirus.
Arch. FR. Pediatr 23: 1057-1073.
Pacini, D.L., Collier, A.M., and Henderson, F.W. (1987)
8.
Adenovirus Infections and Respiratory Illnesses in Group Day Care.
Journal of Infectious Diseases 156, No 6: 920-927.
Ford, E., Nelson, K.E., and Warren, D. (1987)
9.
Epidemiology of Epidemic Keratoconjunctivitis.
Epidemiological Reviews 9: 244-261.
Madeley, C.R. (1986)
The emerging role of adenovirus as inducers of gastroenteritis.
Pediatric Infectious Diseases 5: 563-574.
10. Uhnoo, I., Wadell, G., Svensson, L., and Johansson, M.E. (1984)
Importance of enteric adenoviruses 40 and 41 in acute gastroenteritis
in infants and young children.
Journal of Clinical Microbiology 20: 365-372.
11. Miller, S.E., (1986)
Detection and identification of viruses by electron microscopy.
Journal of Electron Microscopy Technique 4: 265-301.
12. Darougar, S., Walpita, P., Thaker, U., Viswalingham, N., and Wishart,
M.S. (1984)
Rapid culture test for adenovirus isolation.
British Journal of Ophthalmology 68: 405-408.
13. Kidd, A.H., Harley, E.H., and Erasmus, M.J. (1985)
Specific detection and typing of adenovirus types 40 and 41 in stool
specimens by dot-blot hybridization.
J. Clinical Microbiology 22: 934-939.
14. Gomes, S.A., Nascimento, J.P., Siquera, M.M., Krawczuk, M.M.,
Pereira, H-G., and Russel W.C. (1985)
In situ hybridization and biotinylated DNA probes: a rapid diagnostic
kit for adenovirus upper respiratory infections.
Journal of Virological Methods 12: 105-110.
15. Lehtomaki, K., Julkunen I., Sandelin, K., Salonen, J., Virtanen, M.,
Ranki, M, and Hovi, T. (1986)
Rapid diagnosis of respiratory adenovirus infections in young adult men.
Journal Clinical Microbiology 24: 108-111.
16. Pereira, H.G., Azeredo, R.S., Leite, J.P.G., Andrade, Z.P., and De
Castro, L. (1985)
A combined enzyme immunoassay for Rotavirus and Adenovirus.
Journal of Virological Methods 10: 21-28.
17. August, M. J., and Warford, A.L. (1987)
Evaluation of a commercial monocloncal antibody for detection of
adenovirus antigen.
Journal of Clinical Microbiology 25, No 11: 2233-2235
18. Cepko, C.L., Whetstone, C.A. and Sharp, P.A. (1983)
Adenovirus hexon monoclonal antibody that is group specific and
potentially useful as a diagnostic reagent.
Journal of Clinical Microbiology 17: 360-364.
19. Gardner, P.S. and McQuillen, J. (1980)
Rapid virus diagnosis. Application of immunofluorescence (2nd Ed).
Butterworth, London, Chapter 5, 92-109.
20. Greenburg, S.B. and Krilov, L. (1986)
Laboratory diagnosis of viral respiratory disease.
Cumitech. No 21. ASM. Drew, W.L. and Rubin, S.J., editors.
21. Galen, R.S. (1982)
Application of the predictive value model in the analysis of test
effectiveness. In Clinics in Laboratory Medicine. Symposium on Test
Selection Strategies.
Volume 2. W. B. Saunders Company, pp 685-699.
IFU X7846, Zmieniony Marca 2013
OXOID Limited, Wade Road, Basingstoke,
Hampshire, RG24 8PW, Wielka Brytania
W sprawie wszelkich informacji należy się kontaktować z najbliższą
dystrybutorem firmy.