Metody wykrywania czynników prognostycznych w ostrej białaczce

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
Diagn Lab 2015; 51(4): 297-304
Praca poglądowa • Review Article
Metody wykrywania czynników prognostycznych
w ostrej białaczce limfoblastycznej u dzieci
Methods of prognostic factors detection in childhood acute lymphoblastic leukemia
Łukasz Sędek1,2
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dziecięcej,
2
SK Nr 1, SUM – Laboratorium Centralne, Pracownia Immunologii
1
Streszczenie
Ostre białaczki to heterogenna grupa chorób. Najczęściej występującym u dzieci podtypem białaczki jest ostra białaczka limfoblastyczna
z komórek prekursorowych limfocytów B. Rozwój ostrych białaczek jest poprzedzony wystąpieniem przynajmniej dwóch tzw. niekorzystnych zdarzeń. Pierwszym z nich jest uszkodzenie DNA, do którego w części przypadków dochodzi już podczas życia płodowego.
Dlatego też, u większości pacjentów w momencie rozpoznania ostrej białaczki można wykryć w blastach białaczkowych określone
aberracje genetyczne. Cytometria przepływowa jest obecnie szeroko rozpowszechnioną techniką stosowaną w laboratoriach zajmujących się diagnostyką chorób hematologicznych. Umożliwia ona ocenę składu antygenowego (fenotypu) komórek białaczkowych,
również pod kątem antygenów, które mogą być związane z określonymi aberracjami genetycznymi (np. obecnością translokacji t(12;21)
o korzystnym znaczeniu rokowniczym lub rearanżacji obejmujących gen MLL o rokowaniu niekorzystnym). Do oceny zawartości DNA,
która również ma znaczenie rokownicze, może być użyta zarówno technika cytometrii przepływowej, jak również klasyczna cytogenetyka. Inne techniki, takie jak łańcuchowa reakcja polimerazowa z odwrotną transkryptazą oraz technika fluorescencyjnej hybrydyzacji
in situ, również są powszechnie w laboratoriach diagnostycznych. Metody te umożliwiają wykrycie zmian na poziomie chromosomów
i pojedynczych genów i są one najczęściej wycelowane w konkretne zaburzenia, zarówno o korzystnym jak i niekorzystnym znaczeniu
prognostycznym. Istnieją również bardziej zaawansowane metody badań genetycznych, jak np. specyficzna dla miejsca ligacji multipleksowa amplifikacja PCR sond, porównawcza hybrydyzacja genomowa z użyciem mikromacierzy, sekwencjonowanie nowej generacji,
które charakteryzują się dużą czułością, jednak mają one zastosowanie głównie w badaniach naukowych. Poszczególne metody mają
swoje zalety, ale i ograniczenia, różnią się czasem potrzebnym do uzyskania wyniku, czułością i specyficznością, kosztem wykonania
oznaczenia, a także dostępnością.
Summary
Acute leukemias constitute a heterogeneous group of diseases. The most common leukemia subtype in children is B-cell precursor
acute lymphoblastic leukemia. Development of acute leukemias is a consequence of at least so-called two unfavorable events. The
first event results in DNA damage, which in part of the cases takes place during fetal development. Therefore, in majority of patients at
diagnosis, it is possible to detect particular genetic abnormalities in leukemic blasts. Flow cytometry is currently broadly used technique
in laboratories dealing with hematological disorders. It enables determination of the antigen repertoire (phenotype) of leukemic cells,
including the antigens associated with certain genetic abnormalities (such as prognostically favorable t(12;21) translocation or MLL
gene rearrangements being a marker of poor prognosis). DNA content, which is also a prognostic factor, can be evaluated both with
flow cytometry and classical cytogenetics. Other techniques, such as reverse transriptase polymerase chain reaction, fluorescent in
situ hybridization, are also commonly used in diagnostic laboratories. These techniques enable detection of changes at chromosomal
or single-gene level and are most frequently targeted into particular aberration, both of favorable and unfavorable prognosis. There
are also more advanced, highly sensitive genetic techniques (such as multiplex ligation-dependent probe amplification, array-comparative genomic hybridization, next generation sequencing), but their application is limited for research. Particular techniques have
their advantages and limitations, differ with result production time, sensitivity and specificity, cost of the analysis as well as availability.
Słowa kluczowe: ostra białaczka limfoblastyczna, czynnik prognostyczny, cytometria przepływowa, reakcja łańcuchowa polimerazy,
fluorescencyjna hybrydyzacja in situ.
Key words:
acute lymphoblastic leukemia, prognostic factor, flow cytometry, polymerase chain reaction, fluorescent in situ
hybridization
297
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
Wprowadzenie
Ostre białaczki (AL; Acute Leukemias) to heterogenna grupa chorób, u podstaw których leży nieprawidłowy rozrost niedojrzałych
komórek prekursorowych (blastów białaczkowych) wywodzących
się z różnych linii komórkowych. W przypadku rozrostu niedojrzałych komórek z linii limfoidalnej, mamy do czynienia z ostrymi
białaczkami limfoblastycznymi (ALL; Acute Lymphoblastic Leukemia), natomiast rozrost komórek linii mieloidalnej, monoidalnej,
erytroidalnej lub megakariocytarnej kategoryzowany jest ogólnie
jako ostre białaczki szpikowe (AML; Acute Myeloid Leukemia). Wg
danych literaturowych popartych prowadzonymi od 2007 roku
badaniami własnymi 87,4% ostrych białaczek u dzieci stanowi
ALL, przy czym 76,7% to ALL z komórek prekursorowych limfocytów B (BCP-ALL; B-Cell Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia),
9,6% to ALL z linii limfocyta T (T-ALL; T-cell Acute Lymphoblastic
Leukemia), natomiast 1,1% stanowią AL bifenotypowe i biliniowe
(ryc. 1) [1–3].
Według obecnie przyjętych teorii, ostre białaczki rozwijają się
na skutek wystąpienia przynajmniej dwóch tzw. niekorzystnych
zdarzeń. Pierwszym jest uszkodzenie DNA (w postaci rearanżacji
chromosomalnych takich jak translokacje, delecje, duplikacje lub
inwersje), do którego w części przypadków dochodzi już podczas życia płodowego. Drugim zdarzeniem jest prawdopodobnie zadziałanie pewnych czynników środowiskowych (takich jak
promieniowanie jonizujące lub infekcje wirusowe często powodujące mutacje punktowe, zmieniające funkcje genów) [4, 5].
Dlatego też, u większości pacjentów w momencie rozpoznania
ALL, można wykryć w blastach białaczkowych określone aberra-
Tabela I. Wybrane aberracje genetyczne w ALL (na podstawie [7, 8])
Produkt genowy
Podtyp ALL
Częstość
występowania
Znaczenie
prognostyczne
t(12;21)(p13;q22)
ETV6-RUNX1
(TEL-AML1)
BCP-ALL
15 – 25%
+
t(9;22)(q34;q11.1)
BCR-ABL1
BCP-ALL
2 – 4%
–; ulega
poprawie
w ostatnich
latach
t(1;19)(q23;p13.3)
TCF3-PBX1
(E2A-PBX1)
BCP-ALL
5–6%
+
BCP-ALL
1 – 2%
–
BCP-ALL
20 – 30%
+
BCP-ALL
pacjenci z
zespołem
Downa: 55%
pozostali: 5
– 7%
– tylko dla
BCP-ALL bez
zespołu Downa
BCP-ALL
10%
– (zwiększone
ryzyko
wznowy)
BCP-ALL
7%
+
BCP-ALL
2%
+
5 – 8%
– tylko dla
niemowląt z
ALL
Rodzaj aberracji
hipodiploidia
(≤44 chromosomów)
hiperdiploidia
(>50 chromosomów)
rearanżacje
genu
CRLF2
tworzą
podgrupę BCRABL1-like
IGH@-CRLF2
P2RY8-CRLF2
(nadekspresja CRLF2)
rearanżacje
genu IKZF1
delecja ERG
rearanżacje MYC
t(8;14)(q24;q32)
t(2;8)(q12;q24)
RT-PCR, FISH,
FC, fosfo-FC
FC, klasyczna
cytogenetyka
MLPA, fosfo-FC
RT-PCR, FISH
różne produkty
BCP-ALL
T-ALL
rearanżacje genu MLL
t(4;11)(q21;q23)
Techniki
diagnostyczne
MLL-AFF1
(MLL-AF4)
translokacje genów TCR z różnymi onkogenami:
BCP-ALL
T-ALL
5 – 10%
niemowlęta:
70-80%
starsze dzieci:
ok. 2%
RT-PCR, FISH,
FC
–
40 – 50%
t(10;14)(q24;q11)
nadekspresja
TLX1 (HOX11)
–
t(5;14)(q35;q32)
nadekspresja
TLX3 (HOX11L2)
+
(10;11)(p12;q14)
PICALM-MLLT10
(CALM-AF10)
RT-PCR, FISH
T-ALL
10%
–
BCP-ALL – ostra białaczka limfoblastyczna z komórek prekursorowych limfocytów B; FC – cytometria przepływowa; FISH – fluorescencyjna hybrydyzacja in
situ; MLPA – specyficzna dla miejsca ligacji multipleksowa amplifikacja sond; RT-PCR łańcuchowa reakcja polimerazowa z odwrotną transkryptazą; T-ALL
– ostra białaczka limfoblastyczna z komórek prekursorowych limfocytów T; + – korzystne znaczenie rokownicze, – – niekorzystne znaczenie rokownicze;
298
Diagn Lab 2015; 51(4): 297-304
cje genetyczne, a część z nich może być korzystnym
lub niekorzystnym czynnikiem prognostycznym [6].
W ostatnich 30 latach zidentyfikowano wiele różnych aberracji genetycznych towarzyszących różnym podtypom ALL u dzieci, które zostały zestawione
w tabeli I. Zaburzenia te wykrywane są podczas rutynowej diagnostyki różnymi metodami, takimi jak:
cytometria przepływowa, klasyczna cytogenetyka,
fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, łańcuchowa
reakcja polimerazowa z odwrotną transkryptazą.
Inne, bardziej zaawansowane metody charakteryzują
się dużą czułością jednak mają one zastosowanie
głównie w badaniach naukowych (np. fosfo-cytometria przepływowa, specyficzna dla miejsca ligacji
multipleksowa amplifikacja PCR sond, porównawcza
Rycina 1. Częstość występowania poszczególnych podtypów białaczek i innych chorób hematologicznych u dzieci na podstawie badań własnych prowadzonych od 2007 roku na grupie 1750
hybrydyzacja genomowa z użyciem mikromacierzy,
pacjentów (Pracownia Immunologii Laboratorium Szpitala Klinicznego Nr 1 im. Prof. Stanisława
sekwencjonowanie nowej generacji). Metody cytoSzyszko w Zabrzu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach). Skróty: AML – ostra białaczka szpikowa, BCP-ALL – ostra białaczka limfoblastyczna z komórek prekursorowych limfocytów
genetyczne, genetyczne, molekularne umożliwiają
B, BF/BL-AL. – ostra białaczka bifenotypowa/biliniowa, B-NHL – chłoniak nieziarniczy z dojrzałych
wykrycie tych zmian bezpośrednio na poziomie chrolimfocytów B, MDS – zespół mielodysplastyczny, T-ALL – ostra białaczka limfoblastyczna z komórek
prekursorowych limfocytów T, T-NHL – chłoniak nieziarniczy z dojrzałych limfocytów T.
mosomów i pojedynczych genów i są one najczęściej
wycelowane w konkretne zaburzenie. Z kolei inne
(np. guzów lub węzłów chłonnych) po uprzedniej homogenizacji.
metody, takie jak cytometria przepływowa, umożliwiają ocenę
Technika FC umożliwia ocenę fenotypu komórek tj. określenie
składu antygenowego (fenotypu) komórek białaczkowych, rówrepertuaru antygenów obecnych zarówno na ich powierzchni,
nież pod kątem antygenów, które mogą być związane z określojak i wewnątrz cytoplazmy. W przypadku oznaczeń obejmujących
nymi aberracjami genetycznymi [7, 8].
zarówno antygeny powierzchniowe, jak i wewnątrzkomórkowe,
w pierwszej kolejności oznacza się antygeny powierzchniowe,
Podstawowe techniki diagnostyczne stosowane do wykrywapo czym próbkę poddaje się utrwaleniu, permeabilizacji i reakcji
nia czynników prognostycznych w ALL
z przeciwciałami skierowanymi przeciwko antygenom wewnątrzDiagnostyka ALL (oprócz oceny mielogramu) oparta jest obecnie
komórkowym. Do określenia fenotypu (immunofenotypizacji) stona szeroko rozpowszechnionej w laboratoriach diagnostycznych
suje się przeciwciała monoklonalne, które wysoce swoiście rozpotechnice cytometrii przepływowej (FC; Flow Cytometry). Materiaznają antygeny docelowe. Przeciwciała monoklonalne sprzężone
łem badanym w FC jest najczęściej szpik kostny lub krew obwosą ze znacznikiem fluorescencyjnym (fluorochromem), który pod
dowa, ale możliwe jest również zastosowanie fragmentów tkanek
Rycina 2. Przykładowy wynik immunofenotypizacji ALL techniką cytometrii przepływowej. Różnice w ekspresji poszczególnych antygenów pozwalają ustalić linię komórkową, z której wywodzi się białaczka. A – BCP-ALL, B – T-ALL. Skróty: cy – marker cytoplazmatyczny, pow – marker powierzchniowy, MPO – mieloperoksydaza.
299
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
wpływem wzbudzenia światłem monochromatycznym o określonej długości fali emituje światło fluorescencyjne. Nowoczesna FC
umożliwia ocenę wielu antygenów (tj. wielu rodzajów/kolorów
fluorescencji) jednocześnie – w powszechnym użyciu są cytometry
8-kolorowe, a w wyspecjalizowanych ośrodkach diagnostyczno-badawczych 10-, 12-, a nawet 20-kolorowe. Warto nadmienić, że
jednoczesne użycie większej liczby przeciwciał monoklonalnych
w wieloparametrycznej FC umożliwia pełniejszą ocenę fenotypu
badanych komórek i zwiększa specyficzność metody [5, 9-11].
Do celów diagnostycznych, dobiera się przeciwciała wykrywające pożądane antygeny, liniowo specyficzne dla określonego
typu badanych komórek, w tym określonego rodzaju blastów
białaczkowych (ryc. 2). Dzięki temu można rozpoznać linię komórek z której nastąpił rozrost oraz ocenić stopień dojrzałości
blastów białaczkowych. Panele diagnostyczne, które muszą być
również dopasowane pod względem rodzaju użytych fluorochromów do możliwości cytometru, powinny zawierać przeciwciała
umożliwiające odpowiednią klasyfikację i określenie podtypu
ALL (np. CD19, cytCD79a, CD22, CD10, CD20, CD22, CD34, TdT
dla BCP-ALL oraz CD3, cytCD3, CD2, CD7, CD5, CD4, CD8, CD1a,
CD99 dla T-ALL). Ważnym dopełnieniem w diagnostyce ALL jest
również ocena ekspresji antygenów linii mieloidalnej (takich jak
powierzchniowe CD13, CD14, CD15, CD33, CD64, CD66c, CD117
oraz cytoplazmatyczna mieloperoksydaza). Daje to możliwość
wykrycia tzw. koekspresji antygenów mieloidalnych na blastach
w ALL oraz immunofenotypów nietypowych. W zależności od
liczby i rodzaju wykrytych antygenów innej linii komórkowej
(zarówno limfoidalnej jak i mieloidalnej) możliwe jest wykrycie
białaczek o mieszanym fenotypie (MPAL; mixed phenotype acute
leukemia) oraz białaczek dwuliniowych (BAL; bilineage acute leukemia), w których wykrywalne są dwie populacje blastów pochodzących z różnych linii (zarówno limfoidalnych, jak i mieloidalnych).
W panelu diagnostycznym warto również uwzględnić przeciwciała
przeciwko antygenom, mającym potencjalne znaczenie prognostyczne o silnej korelacji zarówno z korzystnymi, jak i niekorzystnymi czynnikami rokowniczymi [10-12].
Przykładem aberracji o korzystnym znaczeniu prognostycznym,
które może być badane techniką FC jest translokacja t(12;21),
prowadząca do powstania genu fuzyjnego ETV6-RUNX1 (dawniej TEL-AML1). Stwierdzana jest u ok. 22% dzieci z BCP-ALL [6-8].
Wykrycie tego zaburzenia wymaga stosowania technik molekularnych (głównie RT-PCR lub FISH – por. niżej), jednak wykazano,
że powstanie genu fuzyjnego ETV6-RUNX1 jest silnie skorelowane
z brakiem lub obniżoną ekspresją antygenu CD9 na blastach (wg
danych literaturowych, czułość: 88-92%, specyficzność: 71-90%,
dodatnia wartość predykcyjna: 47-75%) [13]. Natomiast zaburzeniem będącym niekorzystnym czynnikiem prognostycznym,
możliwym do oceny techniką FC, są różne rearanżacje obejmujące gen MLL. Stwierdzane są w ok. 8% przypadków ALL u dzieci
i obserwowane są w 70-80% przypadków niemowlęcej BCP-ALL,
najczęściej o fenotypie CD10– (pro-B-ALL). Zidentyfikowanych
zostało wiele genów-partnerów dla genu MLL, z którymi dochodzi do fuzji, jak np. najczęściej występująca i mająca szczególnie niekorzystne znaczenie prognostyczne translokacja t(4;11)
(q21;q23), której efektem jest gen fuzyjny MLL-AFF1(AF4). Detekcja
300
rearanżacji genu MLL jest silnie skorelowana ze stwierdzeniem
na blastach białaczkowych ekspresji antygenu NG2 oraz często
towarzyszących antygenów CD15 i CD65 [14, 15]. Na podstawie
niepublikowanych wyników badań własnych, przeprowadzonych na grupie 654 dzieci z ALL, rearanżacje genu MLL zostały
potwierdzone referencyjną techniką FISH (por. niżej) u 43 pacjentów (6,6%), podczas gdy ekspresja antygenu NG2 potwierdzona
techniką FC była obserwowana u 39 pacjentów (6,0%). Czułość
i specyficzność ekspresji antygenu NG2 z rearanżacją genu MLL
wyniosła odpowiednio 73% i 98%, a dodatnia i ujemna wartość
predykcyjna ekspresji antygenu NG2 wyniosła odpowiednio 82%
i 98%. Natomiast ekspresja NG2 w połączeniu z brakiem antygenu
CD10, zwiększa zarówno pozytywną, jak i negatywną wartość
prognostyczną do niemal 100% [16].
Technika FC, oprócz oceny cech fenotypowych może być również
użyta do oceny zawartości DNA (ploidii) w blastach białaczkowych, co również ma znaczenie rokownicze (ryc. 3). Do tego celu
służy oznaczenie tzw. indeksu DNA (DI), czyli stosunku zawartości
DNA w blastach białaczkowych w fazie G0/G1 cyklu komórkowego
do zawartości DNA w prawidłowych komórkach diploidalnych
(również w fazie G0/G1). Do oznaczenia DI używa się barwników
(takich jak np. jodek propidyny), które stechiometrycznie wiążą
się z DNA, dzięki czemu możliwa jest ilościowa ocena reakcji [9,
12]. Hipodiploidia stwierdzana jest, gdy wyznaczona wartość DI
jest mniejsza niż 0,9, dotyczy ok. 1% przypadków ALL u dzieci i związana jest z niekorzystnym rokowaniem. W odróżnieniu
od niej, hiperdiploidia skojarzona jest z dobrym rokowaniem,
zwłaszcza gdy DI jest wyższy niż 1,20. Stwierdzana jest u ok. 25%
dzieci z ALL [7, 8]. Proponowanych jest wiele mechanizmów
tłumaczących różnice w odpowiedzi na leczenie pomiędzy pacjentami z hipo– i hiperdiploidią (np. zwiększona wrażliwość na
sygnały proapoptotyczne spowodowana stresem komórkowym
związanym z hiperdiploidią, wyższa ekspresja białek będących
receptorami czynników proapoptotycznych lub zaangażowanych
w dokomórkowy transport różnych cząsteczek, w tym leków) [17,
18]. Wykazano, że z hiperdiploidią skorelowana jest ekspresja antygenu CD123 na blastach (czułość: 81,5%, specyficzność: 91,5%,
dodatnia wartość predykcyjna 78,6%) [19].
Ploidia może być również oceniana techniką klasycznej cytogenetyki – oceny kariotypu. Polega ona na liczeniu chromosomów
pod mikroskopem, w preparatach blastów poddanych wcześniej
hodowli w zoptymalizowanych warunkach, z dodatkiem mitogenów (np. pochodzących ze szkarłatki amerykańskiej), przez co
zwiększa się częstotliwość wejścia komórek w fazę mitozy. W metafazie mitozy, wyodrębnione w jądrach chromosomy układają
się w centralnej części komórki, tworząc tzw. płytkę metafazową.
Dodanie do hodowli kolcemidu zapewnia zatrzymanie cyklu komórkowego w tej fazie, po czym preparaty komórek poddaje się
utrwaleniu i wybarwieniu. Stwierdzenie liczby chromosomów ≤ 45
lub ≥ 47 określa się odpowiednio jako hipodiploidia lub hiperdiploidia. Klasyczna cytogenetyka umożliwia również stwierdzenie
obecności charakterystycznego chromosomu Filadelfia, będącego produktem wymiany części dłuższych ramion pomiędzy
chromosomami 9 i 22. Doprowadza to do powstania fuzji genów
BCR-ABL1, która jest niekorzystnym czynnikiem prognostycznym
Diagn Lab 2015; 51(4): 297-304
Rycina 3. Ocena indeksu DNA (DI) w ALL. A – kontrola z prawidłowej krwi obwodowej, B – ALL bez zmian w zawartości DNA (DI = 1), C – ALL z hiperdiploidią (DI = 1,22)
strzałką zaznaczono pik hiperdiploidalny, D – wysoka ekspresja antygenu CD123 towarzysząca BCP-ALL z hiperdiploidią.
w BCP-ALL [20, 21]. Wadą klasycznej cytogenetyki jest to, że uzyskanie płytek metafazowych z komórek białaczkowych nie jest
możliwe u wszystkich pacjentów.
Wykrywanie zaburzeń leżących u podstaw dziecięcej ALL rutynowo wykonuje się również innymi technikami.
Do wykrywania aberracji genetycznych takich jak np. translokacje
chromosomalne szeroko stosowana jest technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH; Fluorescent In Situ Hybridization)
[20-22]. Zaletą tego badania jest to, że można je wykonać na
rozmazach szpiku kostnego pobranych przy rozpoznaniu choroby – tak więc jest dostępne praktycznie dla wszystkich pacjentów. Do badań tą techniką można również zastosować komórki
z hodowli przygotowanej do klasycznej cytogenetyki. Następnie
preparaty komórek poddaje się reakcji (hybrydyzacji) z sondami tj.
krótkimi odcinkami polinukleotydowymi wyznakowanymi znacznikiem fluorescencyjnym (najczęściej o kolorze zielonym i czerwonym), komplementarnymi do określonych sekwencji DNA.
W wariancie FISH z sygnałem fuzyjnym, sondy dobiera się tak, by
hybrydyzowały z różnymi genami, na różnych chromosomach, na
podstawie znajomości często występujących rodzajów pęknięć
chromosomów w ALL. W przypadku gdy nie ma żadnych zaburzeń, w obrazie mikroskopu fluorescencyjnego, sondy widoczne
są jako osobne sygnały (czerwony i zielony), natomiast wystąpienie translokacji powoduje, że również sondy przemieszczają
się w pobliże siebie, przez co pod mikroskopem widoczny jest
jeden sygnał fuzyjny (żółty) pochodzący od nałożonych na siebie
sond (ryc. 4). Z kolei w wariancie FISH z rozszczepieniem sygnału,
sondy dobiera się tak, by hybrydyzowały w obrębie jednego określonego genu, po przeciwstawnych stronach znanego miejsca
pęknięcia, do którego dochodzi w ALL. Umieszczone blisko siebie
sondy wyznakowane są różnymi znacznikami fluorescencyjnymi.
W sytuacji prawidłowej (brak translokacji), ze względu na bliskie
sąsiedztwo sond, pod mikroskopem widoczny jest jeden sygnał
fluorescencyjny (żółty). Dopiero zajście translokacji powoduje
rozszczepienie sygnału od obydwu sond i w różnych miejscach
preparatu mikroskopowego uwidaczniają się sygnały (czerwone
i zielone) pochodzące od pojedynczych sond zhybrydyzowanych
z przemieszczonymi różnymi fragmentami tego samego genu
(ryc. 4). Wariant z rozszczepieniem sygnału jest niezależny od
partnera genowego, z którym dochodzi do fuzji i umożliwia identyfikację nowych rodzajów translokacji genów [20, 22]. Technika
FISH umożliwia wykrywanie w BCP-ALL np. translokacji chromosomalnych t(9;22) prowadzącej do powstania genu fuzyjnego
BCR-ABL1, translokacji obejmującej gen MLL (markery rokowania
niekorzystnego), jak również translokacji t(12;21) prowadzącej
do powstania genu fuzyjnego ETV6-RUNX1, translokacji t(1;19),
prowadzącej do powstania genu fuzyjnego TCF3-PBX1 (korzystne czynniki prognostyczne). Natomiast w T-ALL, możliwe jest
wykrycie translokacji genów TCR z różnymi onkogenami m.in.
t(10;14) prowadzącej do powstania genu fuzyjnego TCR-TLX1
(niekorzystny czynnik prognostyczny) oraz t(5;14) prowadzącej
do powstania genu fuzyjnego TCR-TLX3 (marker rokowania korzystnego) (tab. I).
301
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
rów rozpoznających różne miejsca złączeń genów
fuzyjnych, czyli multipleksowanie (ang. multiplex PCR),
co znacząco wpływa na wydajność metody [21-25].
Inne techniki o potencjalnym zastosowaniu w detekcji czynników prognostycznych w ALL
Oprócz stosowanych rutynowo technik wykrywania
znanych czynników prognostycznych, istnieją inne
techniki, umożliwiające bardzo dokładną analizę genomu, eksomu i zmian w ich obrębie, które mogą służyć wykryciu nowych rodzajów zmian genetycznych,
będących potencjalnie nowymi czynnikami prognostycznymi w ALL. Jedną z tych technik jest odmiana
techniki FC, tzw. fosfocytometria przepływowa (fosfo-FC; phospho-flow). Przy zastosowaniu odpowiednio
zmodyfikowanego protokołu przygotowania materiału
do FC, możliwe jest wykrywane ufosforylowanych form
białek-cząsteczek przekaźnikowych lub ocena indukcji
fosforylacji pod wpływem określonego stymulatora
(np. różnych cytokin i interleukin) [26]. Przykładem
pierwszego z wymienionych zastosowań jest oznaczenie ufosforylowanej formy białka CrkL, którego
obecność silnie koreluje ze wspomnianą wcześniej
translokacją genetyczną o niekorzystnym znaczeniu
rokowniczym t(9;22) (tzw. chromosom Filadelfia) oraz
genu fuzyjnego BCR-ABL1 [7, 8]. Wykorzystanie fosfo-FC
daje przewagę w wykrywaniu ALL z fuzją genów BCRRycina 4. Zasada metody FISH. A – z sygnałem fuzyjnym, B – z rozszczepieniem sygnału (opis
w tekście ). Zaadaptowano z [20].
-ABL1 nad tradycyjną FC, gdyż nie wykazano dotychczas dostatecznie silnej asocjacji tego zaburzenia z eksRównie powszechnie, do detekcji aberracji genetycznych w ALL
presją określonych antygenów powierzchniowych. W ostatnich
stosowana jest technika łańcuchowej reakcji polimerazowej z odlatach wyodrębniono dodatkową podgrupę w obrębie BCP-ALL,
wrotną transkryptazą (RT-PCR; reverse transriptase polymerase
tzw. BCR-ABL-like ALL, o niekorzystnym znaczeniu prognostyczchain reaction). Materiałem wyjściowym jest wyizolowane z blanym. Podstawą wyróżnienia tej podgrupy, która stanowi 5-10%
stów RNA, które następnie poddawane jest transkrypcji do cDNA
pacjentów z BCP-ALL, jest charakterystyczny profil ekspresji genów,
w reakcji z odwrotną transkryptazą. W następnym etapie stosuje
podobny do profilu ALL z fuzją genów BCR-ABL1. Cechą wspólną
się startery (krótkie sekwencje DNA) komplementarne do znaobydwu tych podgrup jest występowanie mutacji aktywujących
nych miejsc złączeń genów fuzyjnych wspomnianych wcześniej
gen JAK, wpływający na przekaźnictwo sygnału komórkowego
(tab. I), będących matrycą dla nowopowstającej nici DNA. Reakcje
szlakiem JAK-STAT. Mutacjom tym może towarzyszyć nadekspresja
przebiegają sekwencyjnie w odpowiednio zaprogramowanym
białka będącego receptorem dla cytokin (CRLF2; Cytokine Receptortermocyklerze. Cykl reakcji obejmuje denaturację cDNA w 95°C,
-Like Factor-2) poprzez fuzję genu CRLF2 m.in. z genem P2RY8 lub
następnie przyłączenie startera w temperaturze 60-65°C oraz właz lokus rodziny genów ciężkiego łańcucha immunoglobulinowego
ściwą reakcję polimeryzacji (elongacji) w temperaturze około 72°C,
(IGH@) i/lub aberracje (delecje, mutacje punktowe, inne rearanżaprzebiegającą w kilkunastu-kilkudziesięciu cyklach. W każdym
cje) w obrębie genu IKZF1, zaangażowanego w prawidłowe dojrzecyklu powstają nowe, komplementarne do badanej sekwencji odwanie limfocytów B. Ponadto, w podgrupie BCR-ABL1-like stwierdza
cinki DNA, które również służą jako matryce w kolejnych cyklach
się nadmierną fosforylację białka przekaźnikowego Stat5, co może
amplifikacji, dzięki czemu przyrost produktu jest wykładniczy. Do
być wykryte właśnie techniką fosfo-FC [27, 28].
mieszaniny reakcyjnej konieczne jest dostarczenie (oprócz enzymów) substratu, którym jest mieszanina nukleotydów (trifosforaMetoda specyficznej dla miejsca ligacji multipleksowej amplifinów deoksyrybonukleozydów). Produkt reakcji poddawany jest
kacji PCR sond (MLPA; Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplielektroforezie, która daje możliwość identyfikacji otrzymanego
fication) jest techniką opartą na multipleks-PCR umożliwiającą
produktu. Często stosuje się modyfikację metody umożliwiającą
wykrywanie zmienionej liczby kopii genów. W odróżnieniu od
śledzenie postępu reakcji w czasie rzeczywistym – tzw. real time
typowej reakcji multipleks-PCR, w MLPA amplifikacji ulegają sondy
PCR (RQ-PCR), w której konieczne jest zastosowanie oprócz star(a nie sekwencje badanego DNA, do których one hybrydyzowaterów sondy wyznakowanej znacznikiem fluorescencyjnym. Inną
ły). Technika ta umożliwia jednoczesną amplifikację wielu sond
modyfikacją reakcji RT-PCR jest jednoczesne użycie wielu startezhybrydyzowanych do różnych sekwencji DNA, przy użyciu poje302
Diagn Lab 2015; 51(4): 297-304
dynczego startera, gdyż każda sonda zawiera komplementarną do
niego sekwencję. Uzyskane produkty reakcji amplifikacji są analizowane poprzez elektroforezę kapilarną, a wyniki (wzorce pików)
porównywane z wynikami uzyskanymi dla określonych próbek
referencyjnych. Analiza wyników reakcji MLPA umożliwia identyfikację, które z badanych sekwencji DNA mają zmienioną liczbę
kopii. Możliwa jest również analiza nawet całych chromosomów.
Ponadto, w połączeniu z techniką długodystansowego (długoodcinkowego) PCR (ang. long range PCR), możliwe jest wykrywanie
znanych rodzajów mikrodelecji lub mikroduplikacji obejmujących
krótkie sekwencje (kilkadziesiąt nukleotydów) w obrębie jednego
genu, co daje znaczną przewagę nad techniką FISH, która nie
jest wystarczająco czuła, by wykryć zmiany obejmujące tak małe
fragmenty DNA [22, 23, 29].
Technika porównawczej hybrydyzacji genomowej z użyciem mikromacierzy, aCGH (Array-Comparative Genomic Hybridization) lub
mikromacierzy SNP o wysokiej gęstości (HD-SNP; high-density SNP
array), umożliwia przeszukiwanie (skrining) całego genomu (lub
określonych chromosomów) pod kątem wykrycia aneuploidii,
duplikacji, delecji, z rozdzielczością limitowaną wyłącznie liczbą
oraz wielkością sond użytych do konstrukcji mikromacierzy. Macierze używane w technice aCGH zawierają sondy odpowiadające
poszczególnym fragmentom każdego z chromosomów, ciasno
upakowane na powierzchni mikromacierzy, na które nanosi się
badane DNA. Odpowiednie fragmenty badanego DNA hybrydyzują do sondy genetycznej na zasadzie komplementarności, dzięki
czemu możliwa jest identyfikacja delecji i duplikacji o wielkości
nawet kilkudziesięciu par zasad. Badanie techniką aCGH dostarcza
ogromnych ilości danych, wymaga zastosowania specjalistycznego sprzętu, wysoko wykwalifikowanego personelu (bioinformatyk), w związku z czym, koszty są wysokie.
Podobnie, technika sekwencjonowania nowej generacji (NGS;
Next Generation Sequencing), która umożliwia badanie wybranych
paneli genów, całego eksomu lub genomu. Rzadko jednak jest
konieczne badanie całego genomu, zwykle badania są celowane, przez co koszty analiz można znacznie obniżyć. Analiza NGS
pozwala na wychwycenie zmian na poziomie pojedynczych par
zasad, co ma zastosowanie w wykrywaniu rzadkich form polimorficznych alleli genów, w tym zaangażowanych w przekaźnictwo
sygnału komórkowego i różnicowanie komórek różnych linii komórkowych, z których mogą wywodzić się białaczki [22, 23].
stycznym. Niewątpliwą zaletą oznaczeń metodą FC jest jej szybkość
– wyniki mogą być dostępne w ciągu czasu rzędu godzin od pobrania materiału do badań. Technika FC, oprócz znacznie krótszego
czasu potrzebnego do identyfikacji nieprawidłowości genetycznych, charakteryzuje się o wiele niższym kosztem w porównaniu
do technik molekularnych takich jak FISH, RT-PCR czy MLPA, które
ponadto nie są dostępne we wszystkich ośrodkach hematologicznych, wymagają specjalistycznych laboratoriów, centralizacji badań
i transportu próbek. Technika FC staje się obecnie coraz bardziej
powszechna i wymaga jedynie standardowego laboratorium wyposażonego w cytometr przepływowy. Wadą techniki FC jest brak
stuprocentowej czułości i specyficzności (oraz dodatniej i ujemnej
wartości predykcyjnej), dlatego zasadne jest zróżnicowanie metodyki w zakresie wykrywania poszczególnych czynników rokowniczych.
W kontekście zarysowanej różnorodności ALL, dokładna charakterystyka biologii ALL daje perspektywy na możliwość zastosowania zindywidualizowanej terapii w przyszłości po to, by osiągnąć jak najlepsze wyniki leczenia tej choroby. Ma to już miejsce
np. u pacjentów ze stwierdzoną fuzją genów BCR-ABL1 (głównie
techniką FISH lub RT-PCR), których rokowanie, pierwotnie niekorzystne, uległo znaczącej poprawie w związku z zastosowaniem
leków – inhibitorów kinazy tyrozynowej [30]. Upowszechnienie
technik fosfo-FC oraz MLPA może przyczynić się do właściwej
identyfikacji podgrupy BCR-ABL1-like, których rokowanie jest
również niekorzystne, jednak wstępne wyniki badań wskazują, że poprawę wyników leczenia może przynieść zastosowanie
nowych leków o działaniu inhibitorów kinazy tyrozynowej, albo
inhibitorów JAK2 [27]. Dalszy postęp może przynieść synteza
wyników uzyskanych różnymi technikami przy użyciu metod
bioinformatycznych. Dla przykładu, identyfikacja różnych grup
prognostycznych, oprócz tego, że charakteryzują się one ekspresją
„typowego” pojedynczego parametru (np. cytometryczna ocena
ekspresji antygenu CD123 w hiperdiploidii) w połączeniu z innymi
parametrami, określonymi innymi technikami może skutkować
wyższą czułością, specyficznością i dodatnią wartością predykcyjną w porównaniu do oceny tylko pojedynczych parametrów.
Utworzenie bazy danych dla pacjentów z ALL zawierającej taką
kompleksową informację i wzajemne korelacje pomiędzy poszczególnymi wynikami mogłoby stanowić odniesienie dla nowo
rozpoznawanych przypadków, a niewykluczone, że również przyczynić się do identyfikacji nowych czynników prognostycznych.
Piśmiennictwo
Podsumowanie
Jak pokazują wyniki wielu badań, ALL jest chorobą bardzo heterogenną, zarówno genetycznie, immunofenotypowo jak i klinicznie,
a do oceny tej różnorodności można stosować różne techniki
diagnostyczne. Sytuacją idealną byłoby przeprowadzenie dla
wszystkich pacjentów z rozpoznaną ALL wszelkich niezbędnych
badań, by skutecznie zaklasyfikować pacjentów do różnych grup
prognostycznych (stratyfikacja) na podstawie wszystkich wykrytych czynników rokowniczych.
Diagnostyka ALL przy użyciu wieloparametrycznej FC umożliwia
identyfikację wielu markerów o potencjalnym znaczeniu progno-
1.
Sędek Ł, Bulsa J, Sonsala A i wsp. The immunophenotypes of blast cells in B-cell acute lymphoblastic leukemia: how different are they from their normal
counterparts? Cytometry B Clin Cytom 2014; 86B: 329-339.
2.
Onciu M. Acute lymphoblastic leukemia. Hematol Oncol Clin N Am 2009;
23:655–674.
3.
Pui CH, Robison LL, Look AT. Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet 2008;
371: 1030-1043.
4.
Greaves M. Infection, immune responses and the aetiology of childhood leukaemia. Nat Rev Cancer 2006; 6: 193-203.
5.
Inaba H, Greaves M, Mullighan CG. Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet
2013; 381: 1943-1955.
6.
Belson M, Kingsley B, Holmes A. Risk factors for acute leukemia in children:
a review. Environ Health Perspect 2007; 115: 138-145.
303
www.diagnostykalaboratoryjna.eu
7.
Szczepański T, Harrison CJ, van Dongen JJM. Genetic aberrations in paediatric
22. Sanak M. Metody biologii i genetyki molekularnej. W: Solnica B, Sztefko K [red.]
acute leukaemias and implications for management of patients. Lancet Oncol
Medyczne laboratorium diagnostyczne. Metodyka i aparatura. PZWL, Warszawa
2010; 11: 880-889.
8.
Mullighan CG. Molecular genetics of B-precursor acute lymphoblastic leukemia.
J Clin Invest 2012; 122: 3407-3415.
9.
Sędek Ł, Sonsala A, Szczepański T, Mazur B. Techniczne aspekty cytometrii
przepływowej. Diagn Lab 2010; 46(4): 415-420.
10. Sędek Ł, Flores-Montero J, Bulsa J, et al. Flow cytometric immunophenotyping
2015, s. 233-256.
23. Demkow U. Nowoczesne metody badania genomu. Diagnosta Laboratoryjny
2015; 3(39): 16-19.
24. Fueller E, Schaefer D, Fischer U, et al. Genomic Inverse PCR for Exploration
of Ligated Breakpoints (GIPFEL), a new method to detect translocations in
leukemia. PLoS ONE 2014; 9(8): e104419. doi:10.1371/journal.pone.0104419.
as diagnostic tool of hematopoietic malignancies. W: Witt M, Dawidowska M,
25. Hang QY, Garner K, Viswanatha DS. Rapid detection of leukemia-associated
Szczepański T [red.] Molecular aspects of hematologic malignancies. Diagnostic
translocation fusion genes using a novel combined RT-PCR and flow cytometric
tools and clinical applications. Springer Verlag, Berlin 2012, s.143-159.
11. Maecker H, Trotter J. Wybór odczynników do wielokolorowej cytometrii przepływowej. Post Bioch 2009; 55(4): 461-467.
12. Sędek Ł, Mazur B. Cytometria przepływowa. W: Solnica B, Sztefko K [red.] Medyczne laboratorium diagnostyczne. Metodyka i aparatura. PZWL, Warszawa
2015, s. 209-232.
13. Gandemer V, Aubry M, Roussel M, et al. CD9 expression can be used to predict
childhood TEL/AML1-positive acute lymphoblastic leukemia: proposal for an
accelerated diagnostic flowchart. Leuk Res 2010; 34:430-437
14. Emerenciano M, Renaud G, Santana M, et al. Challenges in the use of NG2
antigen as a marker to predict MLL rearrangements in multi-center studies.
Leuk Res 2011; 35: 1001-1007.
15. Meyer C, Hofmann J, Burmeister T, et al. The MLL recombinome of acute luekemias in 2013. Leukemia 2013; 27: 2165-2176.
metod. Leukemia 2002; 16: 144–149.
26. Krutzik PO, Iris JM, Nolan G, Perez OD. Analysis of protein phosphorylation and
cellular signaling events by flow cytometry: techniques and clinical applications.
Clin Immunol 2004; 110: 206-221.
27. Roberts KG, Pei D, Campana D, et al. Outcomes of children with BCR-ABL1–like
acute lymphoblastic leukemia treated with risk-directed therapy based on the
levels of minimal residual disease. J Clin Oncol 2014; 32: 3012-20.
28. Roberts KG, Li Y, Payne-Turner D, et al. Targetable kinase-activating lesions
in Ph-like acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med 2014; 371: 1005-15.Ł
29. Łaczmańska I, Łaczmański Ł. Metoda MLPA oraz jej zastosowanie w diagnostyce
chorób uwarunkowanych genetycznie. Post Biol Kom 2009; 36(4): 559-563.
30. Schultz KR, Bowman WP, Aledo A, et al. Improved early event-free survival with
Imatinib in Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia:
A Children’s Oncology Group Study. J Clin Oncol 2009, 27: 5175-5181.
16. Bulsa J. Charakterystyka kliniczna, biologiczna i immunofenotypowa ostrej
białaczki limfoblastycznej z rearanżacją genu MLL u dzieci – rozprawa na stopień doktora nauk medycznych. Śląski Uniwersytet Medyczny, Wydział Lekarski
z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu, 2015.
17. Carroll WL. Safety in numbers: hyperdiploidy and prognosis. Blood 2013; 121(13):
2374-2376.
18. Dastugue N, Suciu S, Plat G, et al. Hyperdiploidy with 58-66 chromosomes in
childhood B-acute lymphoblastic leukemia is highly curable: 58951 CLG-EORTC
results. Blood 2013; 121(13): 2415-2423.
19. Djokic M, Björklund E, E. Blennow, Mazur J, et al. Overexpression of CD123
Adres do korespondencji:
dr Łukasz Sędek
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dziecięcej
41-800 Zabrze, ul. 3 Maja 13-15
tel. +48 32 3704313
e-mail: [email protected]
correlates with the hyperdiploid genotype in acute lymphoblastic leukemia.
Haematologica 2009; 94: 1016-1019.
20. Van der Burg M, Poulsen TS, Hunger SP, et al. Split-signal FISH for detection of
chromosome aberrations in acute lymphoblastic. Leukemia 2004; 18: 895–908.
21. Marin C, Martinez-Delgado B, Melendez B, et al. Multiplex-polymerase chain
reaction assay for the detection of prognostically significant translocations in
acute lymphoblastic leukemia. Hematologica 2001; 86: 1254-1260.
304
Zaakceptowano do publikacji: 17.12.2015