Przegląd piśmiennictwa • Journal Club Analiza podfrakcji HDL

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2011 • Volume 47 • Number 4 • 469-477
Przegląd piśmiennictwa • Journal Club
Analiza podfrakcji HDL: nowa laboratoryjna analiza diagnostyczna u pacjentów
z chorobą sercowo-naczyniową i dyslipoproteinemią
HDL w przeciwieństwie do lipoprotein LDL, uważa się za
ochronną, przeciwmiażdżycową i nawet przeciwzapalną
frakcję lipoprotein osocza. Wśród lipoprotein HDL możemy
wyróżnić następujące podfrakcje: dużych HDL, pośrednich
HDL, małych HDL oraz VHDL. Frakcję dużych i pośrednich
HDL uważa się za antyaterogenną część rodziny cząstek
HDL. Aterogenność podklasy małych HDL natomiast jest
obecnie przedmiotem dyskusji.
W omawianej pracy u pacjentów ze zdiagnozowaną chorobą
sercowo-naczyniową (nadciśnienie tętnicze, choroba wieńcowa) i u osób z nieaterogenną hypercholesterolemią analizowano profil lipoprotein oraz określono stężenie małych,
gęstych LDL. W pierwszym etapie w grupie badanej i grupie
kontrolnej określono fenotyp lipoprotein LDL. W drugim etapie badań u wszystkich pacjentów zmierzono stężenie poszczególnych podfrakcji HDL. Celem podjętych badań było
zidentyfikowanie reprezentowanej najczęściej frakcji HDL
u pacjentów z chorobą sercowo-naczyniową, u których występował aterogenny fenotyp B lipoproteid LDL oraz u osób
ze zdiagnozowaną nieaterogenną hyperbetalipoproteinemią
LDL1,2, u których występował nieaterogenny fenotyp A lipoproteid LDL.
Grupę badaną stanowiło 72 pacjentów z nowo zdiagnozowanym nadciśnieniem tętniczym (36 mężczyzn; średni
wiek 47+/-10 lat oraz 36 kobiet; średni wiek 49+/-12 lat), 96
z nowo zdiagnozowaną chorobą wieńcową (60 mężczyzn;
średni wiek 56+/-12 lat oraz 36 kobiet; średni wiek 59+/-11,6
lat), 110 pacjentów z nieleczoną hipercholesterolemią (hyperbetalipoproteinemia LDL1,2; 26 mężczyzn; średni wiek
50+/-9,3 lat oraz 84 kobiet; średni wiek 56+/-12,2 lat). Grupa
kontrolna składała się z 103 (48 mężczyzn; średni wiek 47+/10 lat oraz 55 kobiet; średni wiek 47,5+/-8,5 lat) zdrowych
ochotników z normolipidemią, u których nie zaobserwowano
jakichkolwiek oznak chorób sercowo-naczyniowych.
Materiał do badań stanowiło osocze EDTA. Identyfikacji
specyficznego fenotypu lipoprotein oraz ilościowej oceny
małych gęstych LDL dokonano przy zastosowaniu elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, używając metody Lipoprint LDL system. Do identyfikacji i ilościowej analizy frakcji
dużych, pośrednich oraz małych HDL wykorzystano nowoczesną metodę elektroforezy na żelu poliakrylamidowym,
przy użyciu metody Lipoprint HDL system, która umożliwia
zróżnicowanie 10 podfrakcji HDL: HDL1-HDL10. Do frakcji
dużych HDL włączono podfrakcje HDL1-HDL3, do frakcji pośrednich, podfrakcje HDL4-HDL7, natomiast do frakcji ma-
łych, podfrakcje HDL8-HDL10. Nowa metoda elektroforezy
w oparciu o system HDL Lipoprint, może stanowić ważne
diagnostyczne uzupełnienie analizy podfrakcji LDL, zwłaszcza w tych przypadkach, w których zidentyfikowano już aterogenny fenotyp lipoprotein, z wysokim stężeniem małych
gęstych LDL. Całkowite stężenie cholesterolu i triglicerydów
w osoczu oznaczono przy użyciu metody enzymatycznej
CHOD PAP (Roche Diagnostics).
W grupie pacjentów ze zdiagnozowanym nadciśnieniem
tętniczym i chorobą niedokrwienną serca stężenie podklasy
dużych LDL było istotnie obniżone (odpowiednio p<0,0002
i p<0,0001), natomiast stężenie podklasy małych HDL było
znacząco podwyższone (p<0,0001), natomiast stężenie
podklasy pośrednich HDL nie różniło się istotnie pomiędzy
grupą badaną a kontrolną. Uzyskane wyniki były zgodne
z aterogennym fenotypem B lipoproteid LDL u pacjentów
ze zdiagnozowanymi chorobami sercowo-naczyniowymi,
u których stwierdzono wysokie stężenie aterogennych małych gęstych LDL (p<0,0001). U pacjentów z nieaterogenną
hyperbetalipoproteinemią LDL1,2 odnotowano podwyższone stężenie całkowitego HDL (p<0,0001), podklasy dużych
HDL (p<0,005) i pośrednich HDL (p<0,0001). Stężenie podklasy małych HDL nie różniło się istotnie od wyników uzyskanych w grupie kontrolnej. U tych pacjentów stwierdzono
jedynie śladowe ilości aterogennych małych gęstych LDL.
Opracowane metody umożliwiły identyfikację 10 podfrakcji
HDL przy pomocy metody Lipoprint HDL (duże HDL 1-3, pośrednie 4-7 oraz małe HDL 8-10). Obecność małych HDL
w wysokim stężeniu wśród osoczowych lipoprotein u pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi charakteryzujących
się aterogennym fenotypem B lipoproteid LDL oraz ich obecność w niskim stężeniu u osób z nieaterogenną hipercholesterolemią potwierdzają, że małe HDL mogą stanowić aterogenną podklasę HDL, a ich ilościowe oznaczanie może
odegrać ważną uzupełniającą rolę w identyfikacji pacjentów,
którzy są narażeni na ryzyko incydentów sercowo-naczyniowych. Obecność małych gęstych LDL jest konieczna do
zdiagnozowania aterogennego profilu lipoprotein zarówno
u osób z hyperlipidemią, jak i z normolipidemią.
Według: Oravec S, Dostal E, Dukát A i wsp. HDL subfractions analysis: a new laboratory diagnostic assay for patients
with cardiovascular diseases and dyslipoproteinemia. Neuroendocrinol Lett 2011; 32: 502–509.
Agnieszka Pater
Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej,
UMK Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy
469
Przegląd piśmiennictwa
Czułe troponiny i N-końcowy pro-peptyd
mózgowego czynnika natriuretycznego
w stabilnej chorobie niedokrwiennej serca
Stabilna choroba niedokrwienna serca (ang. stable angina
pectoris) jest jedną z najczęstszych postaci choroby wieńcowej (CAD; ang. coronary artery disease). Od lat duży wysiłek kładzie się na zwiększenie wartości predykcyjnej testów
to oceny wystąpienia zdarzeń niepożądanych u chorych ze
stabilną CAD. Największe trudności diagnostyczne wiążą
się z oceną ryzyka wystąpienia przyszłych nagłych zdarzeń,
w tym zawału serca. W takiej sytuacji przyjmuje się strategię
oceny ryzyka w oparciu o tak zwane klasyczne czynniki ryzyka, do których zalicza się: wiek, płeć, hipercholesterolemię,
nadwagę lub otyłość (BMI), palenie tytoniu i nadciśnienie
tętnicze (patrz też: Modrzejewski W, Musiał W 2010). Aby
zwiększyć wartość oceny ryzyka populacyjnego stosuje się
strategią opartą o ocenę biomarkerów, przy czym oznaczanie wielu markerów (ang. multimarker strategy) znacząco
poprawia wartość predykcyjną testów laboratoryjnych w porównaniu do oznaczenia tylko jednego biomarkera.
W pracy opublikowanej przez Gjin Ndrepepa i współpracowników podjęto próbę oceny na ile strategia oznaczania
dwóch markerów chorób układu krążenia: czułej sercowej
troponiny T (hs-TnT) i N-końcowego pro-peptydu mózgowego czynnika natriuretycznego (NT-proBNP) jest przydatna
w ocenie ryzyka i stratyfikacji chorych ze stabilną chorobą
niedokrwienną serca. Autorzy poddali 4-letniej obserwacji dużą grupę chorych (n=869) leczonych interwencyjnie
przezskórną plastyką wieńcową. Oznaczenia biomarkerów
(hs-TnT i NT-proBNP) wykonano z zastosowaniem metody
elektrochemiluminescencyjnej (cobas e 411, Roche Diagnostics) przed badaniem angiograficznym. Ponadto u chorych
wykonano oznaczenia białka CRP metodą turbidymetryczną
o wysokiej czułości (INTEGRA 800, Roche Diagnostics). Dokonano oceny klasycznych czynników ryzyka, występowania
cukrzycy, wydolności serca ocenianej wg klasyfikacji NYHA
oraz stopienia zaawansowania CAD na podstawie badania
koronarograficznego w aspekcie rokowania chorych. Ponadto w analizie porównywano wpływ badanych wskaźników na
zgon z przyczyn sercowych, zawału, powtórnej rewaskularyzacji naczyń, jak i udaru mózgu.
W wyniku szczegółowej analizy statystycznej: analizy przeżycia wg Kaplan-Maiera, analizy regresji wielu zmiennych
i modelu proporcjonalnego hazardu Coxa, autorzy ocenili,
że włączenie do analizy dodatkowo 2 biomarkerów (hs-TnT
i NT-pro-BNP) zwiększa wartość predykcyjną w ocenie 4-letniego ryzyka wystąpienia incydentów sercowo-naczyniowych o 26%. Ponadto chorzy, u których poziomy hs-TnT i NT
-pro-BNP przekraczały wartości mediany, charakteryzowali
się ponad 8-krotnie większym prawdopodobieństwem zgonu
w porównaniu do chorych z grupy o niższych wartościach
tych markerów (OR = 8,64; 95% przedział ufności: 3,8519,40). Najsilniejszymi predyktorami podwyższonej wartości
hs-TnT były kolejno: płeć męska (β=0,141; p=0,028), cu470
krzyca (β=0,127; p=0,031), NYHA (β=0,089; p=0,081) i BMI
(β=0,037; p<0,001). Istotność wykazywały takie parametry
jak: stężenie hs-CRP, wskaźnik przesączania kłębuszkowego (GFR) i wartość frakcji wyrzutowej lewej komory serca.
Co ciekawsze, nadciśnienie tętnicze korelowało odwrotnie
ze stężeniami hs-TnT. Istotnymi predyktorami podwyższonego poziomu NT-proBNP były kolejno: płeć żeńska (β=0,285;
p<0,001), nadciśnienie tętnicze (β=0,221; p=0,002), NYHA
(β=0,208; p<0,001), miażdżyca wielonaczyniowa (β=0,193;
p=0,038) i uprzednio przebyty zawał serca (β=0,192;
p=0,007). Ponadto, istotny wpływ wykazywały takie parametry jak: stężenie hs-CRP, wskaźnik przesączania kłębuszkowego (GFR) i wartość frakcji wyrzutowej lewej komory
serca, podczas gdy nie stwierdzono wpływu cukrzycy i BMI
na poziom NT-proBNP w tym modelu badawczym. Analiza
proporcjonalnego hazardu (HR) w modelu Coxa wskazała
na palenie tytoniu, jako najsilniejszy czynnik ryzyka (HR=
2,74; 95% przedział ufności: 1,08-6,96), natomiast HR dla
NT-proBNP i hs-TnT wynosiły odpowiednio: HR= 2,46; 95%
przedział ufności: 1,26-4,86 oraz HR= 2,39; 95% przedział
ufności: 1,20-4,75.
W opinii autorów, pomimo że pomiar stężenia NT-proBNP
i hs-TnT przed interwencją kardiologiczną nie pozwala na
ocenę ryzyka wystąpienia zawału w obserwacji 4-letniej, to
u chorych ze stabilną chorobą serca pozwala z większym
prawdopodobieństwem przewidzieć ryzyko zgonu z przyczyn sercowo-naczyniowych. Klasyczne czynniki ryzyka mające związek z podwyższonymi stężeniami tych biomarkerów
charakteryzują się również istotną wartością predykcyjną.
Według: Ndrepepa G, Braun S, Schulz S i wsp. Sensitive
troponin and N-terminal probrain natriuretic peptide in stable
angina. Eur J Clin Invest 2011; 41:1054-62
Ewa Stępień
Katedra i Zakład Biochemii Klinicznej CMUJ
w Krakowie
Gamma-glutamylotransfereaza – nowy
marker ryzyka rozwoju nadciśnienia tętniczego
W chorobach wątroby często obserwowany jest wzrost aktywności osoczowej fosfatazy alkalicznej (ALP), aminotransferazy alaninowej (ALT), aminotransferazy asparaginowej
(AST) i γ-glutamylotransferazy (GGT). Ostatnie doniesienia
wskazują, że powyższe enzymy, szczególnie GGT mogą
stać się nowymi markerami chorób sercowo-naczyniowych.
W badaniach przeprowadzonych na populacjach: japońskiej,
koreańskiej oraz kaukaskiej wykazano silną korelację GGT
z rozwojem oraz występowaniem nadciśnienia tętniczego.
Przeprowadzone badania koncentrowały się przede wszystkim na GGT, pomijając inne enzymy wątrobowe, takie jak
Przegląd piśmiennictwa
ALT, AST czy ALP. Rutynowe oznaczanie markerów wątrobowych może być pomocne w ocenie ryzyka zachorowania
i monitorowania nadciśnienia tętniczego.
Pacjenci zostali wyselekcjonowani z badania prowadzonego
w latach 2000-2004 w ramach programu Hong Kong Cardiovascular Risk Factor Study-2 (CRISP-2). Do powyższego
badania zakwalifikowano pacjentów u których stwierdzono
uszkodzenie wątroby i którzy piją alkohol nie częściej niż raz
w tygodniu. Grupa badana składała się z 235 osób ze zdiagnozowanym nadciśnieniem tętniczym (grupa I) i 708 osób
z prawidłowym ciśnieniem tętniczym (grupa II). Następnie
w latach 2005-2008 przeprowadzono obserwację grupy II
z prawidłowym ciśnieniem tętniczym (badanie Hong Kong
Cardiovascular Risk Factor Study-3, CRISP-3). W ciągu
tego czasu u 126 pacjentów rozpoznano nowo rozwinięte
nadciśnienie tętnicze (grupa IIa), a u pozostałych 582 pacjentów nie zaobserwowano odchyleń od normy ciśnienia
tętniczego (grupa IIb).
W badaniu CRISP-2 wszystkie cztery markery wątrobowe
były znamiennie statystycznie podwyższone u pacjentów ze
zdiagnozowanym nadciśnieniem tętniczym (grupa I) w porównaniu do 708 pacjentów z ciśnieniem wyjściowo prawidłowym (grupa II); odpowiednio ALP:77,2 (74,5-80,0) i 66,1
(64,7-67,6) U/l, p=0,01; ALT: 24,6 (22,9-26,4) i 20,0 (19,220,9) U/l, p=0,001; ASP: 24,2 (23,2-25,4) i 21,6 (21,0-22,2)
U/l, p>0,05; GGT: 28,2 (26,1-30,6) i 20,5 (19,7-21,4) U/l,
p=0,001). Po przeprowadzeniu dalszej analizy z wykorzystaniem regresji logistycznej, po standaryzacji na zmienne zakłócające wykazano, że zarówno aktywność ALT (p = 0,045)
jak i aktywność GGT ​​( p = 0,001) są związane z nadciśnieniem tętniczym.
Wyjściowo w badaniu CRISP-3 wszystkie parametry, oprócz
AST, były znamiennie podwyższone u pacjentów, którzy
rozwinęli nadciśnienie tętnicze (grupa IIa) w porównaniu do
pacjentów u których nie zdiagnozowano choroby (grupa IIb)
w czasie przeprowadzonej obserwacji, odpowiednio:
ALP:72,7 (68,9-76,6) i 64,8 (63,2-66,3) U/l, p=0,01; ALT: 22,5
(20,1-25,0) i 19,5 (18,7-20,4) U/l ,p=0,01; GGT: 24,1(21,626,9) i 19,8 (18,9-20,8) U/l, p=0,001). Po przeprowadzeniu
analizy z użyciem regresji logistycznej stworzono trzy modele doświadczalne w których badano zależność pomiędzy parametrami uszkodzenia wątroby, a ryzykiem rozwoju
nadciśnienia tętniczego. W modelu pierwszym, w którym
nie zastosowano standaryzacji większość badanych parametrów, wykazano istotną zależność z nowo rozpoznanym
nadciśnieniem tętniczym, jednak w modelu drugim i trzecim
po standaryzacji na różne czynniki zakłócające dla ALP,
ALT, ASP ta zależność zanikła. Jedynie zależność pomiędzy
wyjściowo podwyższonym GGT, a noworozwiniętym nadciśnieniem tętniczym została zachowana, pomimo standaryzacji wobec czynników zakłócających (w modelu 2: p>0,001,
w modelu 3: p=0,003). Badanie wykazało, że spośród wszystkich ocenianych parametrów uszkodzenia wątroby GGT
jest najsilniejszym markerem ryzyka rozwoju nadciśnienia
badanej populacji. Potwierdzają to także wcześniejsze do-
niesienia na ten temat. Mechanizmy wiążące ten parametr
z nadciśnieniem tętniczym nie są do końca poznane. Badanie nie wykazało związku pomiędzy rozwojem nadciśnienia
tętniczego, a pozostałymi wskaźnikami uszkodzenia wątroby. Pomimo niewielkiej liczby pacjentów w badaniu CRISP-3,
GGT wydaje się być obiecującym markerem nadciśnienia
tętniczego. Potwierdzenie jednak użyteczności diagnostycznej dla tego parametru wymaga dalszych badań klinicznych
i poznania ewentualnego mechanizmu rozwoju nadciśnienia
tętniczego u chorych z podwyższonym poziomem tego parametru.
Według: Cheung BM, Ong KL, Tso AW I wsp. Gamma-glutamyl transferase level predicts the development of hypertension in Hong Kong Chinese. Clin Chim Acta 2011; 412:
1326-31
Dorota Pawlica
Zakład Diagnostyki, Katedry Biochemii CM UJ,
w Krakowie
N-końcowy propeptyd natriuretyczny typu
B we wczesnej i zaawansowanej fazie otyłości
Otyłość jest rosnącym problemem zarówno w krajach bogatych jak i rozwijających się. W USA około 70% dorosłych
cierpi na nadwagę lub otyłość, współczynnik otyłości stale
wzrasta w krajach europejskich i Chinach. Dlatego uznaje
się, że otyłość może być globalną pandemią. Otyłość wieku
dziecięcego ma charakter epidemii w Europie i jest obecnie
najczęstszą chorobą występującą u dzieci. Dwudziestoletnie
badania populacyjne prowadzone w grupie ponad 15 000
osób wykazały, że otyłość jest związana ze zwiększonym
ryzykiem chorób układu sercowo-naczyniowego, również ze
skutkiem śmiertelnym. Zaskakująca jest natomiast obserwacja, że osoby otyłe z niewydolnością serca rokują lepiej
niż chorzy z wagą prawidłową. Określa się to jako fenomen
otyłości. A zatem, otyłość może wywierać wieloraki wpływ na
system naczyniowy.
Zaobserwowano, że stężenie NT-proBNP jest znacząco
niższe u chorych z otyłością niż u chorych szczupłych, co
nasuwa sugestię, że białko to może być zaangażowane
w patomechanizm związany z otyłością. Co więcej, mogą
istnieć powiązania między endokrynną funkcją serca a układem neurohormonalnym.
Celem pracy była ocena poziomu NT-proBNP u młodzieży
i dorosłych z otyłością oraz u osób z prawidłową wagą ciała
i ocena jego przydatności jako markera sercowego u osób
otyłych.
Badaniami objęto osoby zakwalifikowane do badania klinicznego STYJOBS/EDECTA (clinicaltrials.gov, numer badania NCT00482924), które zaprojektowano w celu wykry471
Przegląd piśmiennictwa
cia wczesnego stadium miażdżycy i chorób metabolicznych
u dzieci, młodzieży i dorosłych w średnim wieku z otyłością.
Kryterium włączenia była nadwaga z BMI>90≤97 percentyla
u osób poniżej 18 roku życia i BMI>25≤29,9 kg/m2 powyżej
18 roku życia. W badaniu uczestniczyło 411 osób z nadwagą/otyłością (218 kobiet, 193 mężczyzn), i 239 osób (143
kobiety, 96 mężczyzn) z prawidłową wagą, w wieku 10-50
lat. Wszyscy uczestnicy byli zdrowi z klinicznego punktu
widzenia. U badanych przeprowadzono badania antropometryczne, pomiar ciśnienia tętniczego oraz badania laboratoryjne: poziom NT-proBNP, leptyny, rezystyny, stężenie
cholesterolu całkowitego, frakcji HDL, LDL, oxLDL, hsCRP,
homocysteiny, insuliny, AST, ALT, γ-GT, kreatyniny i kwasu
moczowego.
Wykazano znaczące różnice stężenia NT-proBNT w zależności od wieku i płci. Poziom NT-proBNP u dorosłych kobiet
był znacząco wyższy niż u dorosłych mężczyzn i małoletnich kobiet, natomiast u dorosłych mężczyzn stężenie NTproBNP było niższe niż u małoletnich chłopców. U otyłych
małoletnich stwierdzono wyższy poziom NT-proBNP niż
u dorosłych otyłych. Stężenie NT-proBNP u badanych z prawidłową masą ciała było wyższe niż u badanych z nadwagą
i otyłością. W analizie regresji wieloczynnikowej wykazano,
że płeć, kreatynina i kwas moczowy są najlepszymi czynnikami predykcyjnymi dla NT-proBNP, a u dorosłych płeć
żeńska.
Uzyskane wyniki nie przemawiają za istotnym wpływem otyłości na regulację wydzielania NT-proBNP u osób zdrowych,
co pozwala stwierdzić, że NT-proBNP może być użytecznym
markerem sercowym niezależnie od wieku i otyłości.
Ograniczeniem w tym badaniu był brak chorych z niewydolnością serca, co nie pozwala na ocenę wpływu otyłości na
poziom NT-proBNP w tych sytuacjach klinicznych.
Według: Mangge H, Almer G, Zelzer S i wsp. N-terminal proB-type natriuretic peptide in early and advanced phases of
obesity. Clin Chem Lab Med. 2011; 49: 1539-1545.
Ewa Leporowska
Pracownia Diagnostyki Laboratoryjnej
Wielkopolskie Centrum Onkologii, w Poznaniu
Odsetek błędów jakości w testach typu
point of care (POCT)
Testy typu point of care (POCT) stanowią jeden z najszybciej rozwijających się segmentów współczesnej diagnostyki.
Poszukiwanie coraz doskonalszych metod i technicznych
rozwiązań stosowanych w tym typie testów, które poprawią
jakość oznaczenia, wydaje się konieczne by sprostać problemom jakie stawia zmienność środowiska, w którym wykonywane są te oznaczenia. Ponadto różne doświadczenie,
przygotowanie oraz procesy postępowania z próbką pacjen472
ta przez osoby wykonujące oznaczenia może nie być wystarczająco wystandaryzowane do wdrożenia testów POCT
do rutynowej diagnostyki. Mimo, że teoretycznie sugeruje
się, że testy typu POCT wydają się być wyjątkowo podatne
na błąd, mało jest dostępnych informacji na temat poziomu
takiego błędu.
Celem prowadzonego badania była analiza rodzaju błędu
oraz oszacowanie wartości bezwzględnej błędu związanego
z testami typu POCT oznaczanych u pacjentów w wybranych szpitalach w Wielkiej Brytanii oraz porównane z poziomem błędu oznaczonym w testach centralnego laboratorium
danego szpitala.
Badanie w którym uczestniczyły dwa szpitale specjalizujące się w leczeniu ostrych przypadków (posiadające centralne laboratorium medyczne czynne 24h) oraz jeden szpital
specjalizujący się w opiece ambulatoryjnej (posiadające
centralne laboratorium czynne od 9.00 do 17.00) przeprowadzono w okresie od listopada 2009 roku do grudnia 2010
roku w Western Health and Social Care Trust (WHSCT)
w Północnej Irlandii. Wyniki badanych parametrów oznaczane testami POCT były porównywane z wynikami wydanymi przez centralne laboratorium danego szpitala dla
danej próbki. Oznaczanymi parametrami były zarówno badania wykonywane w krwi (RKZ, elektrolity, hemoglobiny
A1c (HbA1c), glukozy, ciał ketonowych, badania przesiewowe dla środków uzależniających) oraz testy wykonywane
w moczu (βHCG, badania ogólne testem paskowym).
W ciągu 14 miesięcy trwania tego projektu wykonano łącznie 407 704 testów POCT, każdy wynik został
wpisany i poddany odpowiednim przeliczeniom matematycznym, z ośrodków wysłano 225 sprawozdań.
Prawie dwie trzecie sprawozdań zostało zarejestrowanych przez klinicznych użytkowników testów POCT,
a pozostała część przez pracowników laboratorium. Odsetek błędnych testów POCT wahał się od 0% dla ciał
ketonowych do 0,65% dla Hb A1c. Dwie trzecie błędów wystąpiło w fazie analitycznej procesu testowania.
O ile stwierdzano brak lub minimalny negatywny wpływ
tych błędów na stan zdrowia chorych, to potencjalny negatywny wpływ ich skutków na decyzje kliniczne lekarzy
wydaje się być silniejszy.
Z przeprowadzonego badania wynika, że błąd dla testów
typu POCT może być znacznie wyższy niż dla testów wykonywanych w centralnych laboratoriach medycznych. Badania „typu POCT” jednak zapewniają lekarzom szybki dostęp
do wyników pacjenta, co umożliwia szybszą interpretację
kliniczną badania, a co za tym idzie wdrożenie właściwego leczenia czy podjęcie natychmiastowej interwencji medycznej, z drugiej strony minimalizują zmienność w czasie
niestabilnych parametrów takich jak glukoza czy mleczany,
którą obserwuje się w próbkach transportowanych do laboratorium. Ze względu na wpływ wyników testu typu POCT
na decyzje kliniczne istotnym wydaje się określenie typu
popełnianych błędów oraz zminimalizowanie częstości ich
występowania.
Przegląd piśmiennictwa
Według: O’Kane M, McManus P, McGowan N i wsp. Quality
Error Rates In Point-of-Care Testing. Clin Chem 2011; 57:
1267-1271.
Dorota Pawlica
Zakład Diagnostyki Katedry Biochemii CM UJ
w Krakowie
Równoczesne wykrywanie składników
systemu urokinazowego aktywatora plazminogenu w tkance nowotworowej i w surowicy wykazuje korelację z niekorzystnym rokowaniem pacjentów z mięsakami
tkanek miękkich
System urokinazowego aktywatora plazminogenu obejmuje
proteazę serynową uPA (urokinase plasminogen activator),
jej receptor uPAR oraz dwa inhibitory PAI-1 i PAI-2. Składniki
systemu uPA odgrywają istotną rolę zarówno w karcynogenezie, degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej, angiogenezie jak i w proliferacji, migracji i adhezji komórek nowotworowych. Są one uznawane za czynniki prognostyczne
w różnych typach nowotworów. Dla przykładu, podwyższone
poziomy uPA w tkance nowotworowej mają znaczenie prognostyczne m.in. w nowotworach piersi, jelita grubego, przełyku, jajnika i żołądka; wysokie poziomy uPAR są związane
z niekorzystnym rokowaniem w raku piersi i jelita grubego,
zaś podwyższone poziomy PAI-1 korelują ze skróconym
całkowitym i/lub bezobjawowym czasem przeżycia chorych
w nowotworach nerki, jajnika i piersi. Wynik obserwacji klinicznej świadczący o tym, że inhibitor enzymu nie posiada
funkcji ochronnej, ale jest wskaźnikiem gorszego rokowania,
na pierwszy rzut oka wydaje się być zaskakujący. Jednakże, poza hamowaniem urokinazowego aktywatora plazminogenu, PAI-1 wykazuje także działanie stymulujące wzrost
guza.
Oceniono ekspresję uPA, uPAR i PAI-1 w grupie pacjentów
z mięsakami tkanek miękkich (STS soft-tissue sarcoma),
i określono ich związek z parametrami kliniczno – patologicznymi oraz całkowitym przeżyciem. Ponadto analizie poddano wpływ komplementarnych oznaczeń uPA, uPAR i PAI-1
w tkance nowotworowej oraz w surowicy krwi na ocenę rokowania pacjentów z mięsakami tkanek miękkich.
Badanie przeprowadzono w próbkach tkanki nowotworowej
pochodzących od 82 dorosłych pacjentów ze zweryfikowanymi histologicznie mięsakami tkanek miękkich (mediana
wieku pacjentów w chwili zabiegu chirurgicznego: 55,8 lat
(zakres 17 – 83 lat); mediana czasu obserwacji pacjentów
po zabiegu: 46 miesięcy (zakres 2 – 146 miesięcy po pierwotnej resekcji guza). Poziomy uPA, uPAR i PAI-1, zarówno w tkance nowotworowej (uPA-T, uPAR-T, PAI-1-T) jak
i w próbkach surowicy krwi pobranej 2 dni przed zabiegiem
chirurgicznym (uPA-S, uPAR-S, PAI-1-S) oznaczono metodą
ELISA. Stężenia antygenu w ekstraktach tkankowych wyrażano w ng analitu/ mg białka całkowitego.
Wartości median stężenia w tkance nowotworowej (uPA-T =
1,78 ng/mg, uPAR-T = 3,98 ng/mg, PAI-1-T = 21,43 ng/mg)
i w surowicy (uPA-S = 0,66 ng/ml, uPAR-S = 1,60 ng/ml, PAI1-S = 1084,0 ng/ml) wykorzystano jako punkty odcinające
do rozdzielenia pacjentów na grupy z niskimi lub wysokimi
poziomami badanych parametrów.
Wykazano istotny związek wysokich poziomów antygenów
w tkance nowotworowej (uPA-T, uPAR-T i PAI-1-T) z podtypem histologicznym (p<0,001; p<0,001; p = 0,006; odpowiednio), stopniem zróżnicowania histologicznego (p<0,001;
p<0,001; p<0,001) i zaawansowaniem klinicznym nowotworu (p<0,001; p<0,001; p = 0,006). Ponadto stwierdzono istotnie wyższe poziomy uPA-T, uPAR-T i PAI-1-T u pacjentów,
którzy zmarli w okresie obserwacji.
U chorych, których guzy wykazują wysoki poziom uPA lub
PAI-1 wykryto istotnie, blisko 3-krotnie, zwiększone ryzyko
zgonu z powodu nowotworu (RR = 2,9; 95% CI = 1,1 – 7,7;
p = 0,032 i RR = 2,6; 95% CI = 1,1 – 6,0; p = 0,029) w porównaniu do chorych z niskimi wartościami uPA lub PAI-1
w tkance nowotworowej.
Zaobserwowano istotne zależności wysokich stężeń uPAR
w surowicy względem podtypu histologicznego (p = 0,004),
stopnia zróżnicowania histologicznego (p<0,001) i zaawansowania klinicznego nowotworu (p = 0,019). Nie wykazano
zależności między stężeniami uPA i PAI-1 w surowicy a parametrami kliniczno–patologicznymi.
Analiza wieloczynnikowa wykazała, że pacjenci z podwyższonymi poziomami uPAR w surowicy mają 3,5-krotnie
zwiększone ryzyko zgonu z powodu nowotworu (RR = 3,5;
95% CI = 1,5 – 8,3; p = 0,004) w porównaniu z pacjentami
z niskim stężeniem uPAR w surowicy. Zbadano wpływ komplementarnych oznaczeń uPA, uPAR i PAI-1 w tkance nowotworowej i uPAR w surowicy na ocenę rokowania pacjentów
z mięsakami tkanek miękkich.
W analizie jednoczynnikowej wg Kaplana–Meiera stwierdzono istotne różnice w czasach przeżycia całkowitego pomiędzy chorymi z wysokimi wartościami komplementarnych
oznaczeń markerów w porównaniu do chorych z niskimi wartościami, dla wszystkich trzech kombinacji markerów: uPA
-T/uPAR-S (44 vs 94 miesiące, p = 0,012); uPAR-T/uPAR-S
(38 vs 80 miesiące, p = 0,008); PAI-1-T/uPAR-S (39 vs 82
miesiące, p = 0,007).
W wieloczynnikowej analizie regresji wg Coxa potwierdzono blisko 6-krotnie zwiększone ryzyko zgonu z powodu nowotworu u chorych z wysokimi wartościami uPA-T/uPAR-S,
uPAR-T/uPAR-S lub PAI-1-T/uPAR-S (RR = 5,9; 95% CI =
1,8 – 19,2; p = 0,003; RR = 6,2; 95% CI = 1,9 – 20,0; p
= 0,002; RR = 5,8; 95% CI = 1,9 – 17,0; p = 0,001; odpowiednio) w porównaniu do chorych z niskimi wartościami dla
każdej kombinacji markerów.
Podsumowując, równoczesne wykrycie wysokiego poziomu
ekspresji składników systemu uPA w tkance nowotworowej
i stężenia uPAR w surowicy wykazuje istotną korelację ze
473
Przegląd piśmiennictwa
skróconym czasem przeżycia całkowitego pacjentów z mięsakami tkanek miękkich sugerując, że dla bardziej precyzyjnej oceny rokowania, ekspresja białka w tkance nowotworowej powinna być rozpatrywana łącznie ze stężeniem
w surowicy.
Według: Taubert H, Würl P, Greither T i wsp: Co-detection
of members of the urokinase plasminogen activator system
in tumour tissue and serum correlates with a poor prognosis for soft-tissue sarcoma patients. Br J Cancer 2010; 102:
731-737.
Jadwiga Tarapacz
Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej,
Centrum Onkologii, Oddział w Krakowie
Kliniczne znaczenie naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu oraz interleukiny 6 u chorych na nowotwory jelita
grubego
Istotną rolę w stymulacji wzrostu guza, angiogenezy oraz
rozwoju przerzutów nowotworowych odgrywa szereg czynników biologicznych, jednak kliniczne znaczenie większości
z nich nie jest w pełni potwierdzone. Wzrost oraz progresja
nowotworu uzależnione są m.in. od angiogenezy – procesu,
w którym formowane są nowe naczynia krwionośne w obrębie guza. Kluczową rolę w tym procesie odgrywa naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (ang. vascular endothelial
growth factor - VEGF). Proangiogenne działanie wykazuje
także interleukina 6.
Celem podjętych przez autorów badań była ocena klinicznego znaczenia oznaczeń VEGF i IL-6 u chorych operowanych
z powodu nowotworów jelita grubego.
Oznaczenia VEGF oraz IL-6 wykonano u 35 chorych na nowotwory jelita grubego przed operacją oraz u 30 zdrowych
osób. Badania wykonano metodą ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) przy pomocy zestawów odczynnikowych firmy R&D Systems.
U chorych na nowotwory jelita grubego, w porównaniu do
grupy referencyjnej, stwierdzano istotnie wyższe stężenia
VEGF oraz IL-6 (p < 0,001). Chorzy w wyższych stadiach
zaawansowania (T2-T4) cechowali się istotnie wyższymi stę-
żeniami VEGF i IL-6 w porównaniu do chorych w stadium
zaawansowania T1 (p < 0,001). Podobnie, w grupie chorych
ze stwierdzonymi przerzutami do węzłów chłonnych poziom
VEGF i IL-6 był istotnie wyższy aniżeli u chorych bez cech
przerzutów (p < 0,001). Diagnostyczna dokładność VEGF
(cut off = 240 pg/ml) jako wyrazu inwazyjności nowotworu
wynosiła 83% przy 79% czułości oraz 68% swoistości. Zaś
dla IL-6 (cut off = 6,7 pg/ml) wynosiła 66% przy 74% czułości
i 59% swoistości diagnostycznej.
Według autorów podwyższone stężenia VEGF i IL-6 u cho-
474
rych na nowotwory jelita grubego przed operacją potwierdzają ich użyteczność jako nieinwazyjnych wskaźników diagnostycznych określających wyższe stadia zaawansowania
oraz obecność przerzutów.
Według: Eldesoky A, Phouma A, Mosaad Y, Elhawary A.
Clinical relevance of Serum Vascular Endothelial Growth
Factor and interleukin – 6 in patients with colorectal cancer.
Saudi J Gastroenterol 2011; 17: 170-3.
Zofia Stasik
Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej
Centrum Onkologii, Oddział w Krakowie
HE4 nowy marker w raku jajnika: porównanie ze stężeniami CA 125 i algorytmem
ROMA u chorych na choroby narządu rodnego.
Rak jajnika, mimo że stanowi tylko 4 % nowotworów złośliwych występujących u kobiet, jest przyczyną zgonów u ponad 50% chorych z tym rozpoznaniem. Tak jak we wszystkich nowotworach złośliwych przeżycie chorych zależy
w znacznej mierze od stopnia zaawansowania klinicznego.
Niestety ze względu na lokalizację jajników i brak swoistych
objawów klinicznych, rak jajnika jest rozpoznawany najczęściej u chorych w wysokim stopniu zaawansowania.
Do chwili obecnej wiadomo, że w diagnostyce raka jajnika
obok powszechnie stosowanych metod obrazowych, istotne
znaczenie ma marker nowotworowy CA 125. Jednak pomimo
relatywnie wysokiej czułości u chorych w zaawansowanych
stadiach, użyteczność diagnostyczna oznaczeń markera we
wczesnych stopniach zaawansowania jest niezadowalająca.
Ostatnio, wielu badaczy zwróciło uwagę na włączenie do badań dodatkowo obok CA 125 nowego markera HE4, który
jest podfrakcją 4 ludzkiego białka z komórek nabłonkowych
najądrza. Wykazano nadekspresję HE4 szczególnie w typie
raka surowiczego, który jest najczęstszym typem histopatologicznym raka jajnika. Szczególnie interesujące są wyniki
badań wskazujące na wyższą jego swoistość w porównaniu
z CA 125.
Istotnym problemem w praktyce ginekologiczno-onkologicznej jest diagnostyka różnicowa guzów miednicy. Większość
zmian ma charakter nowotworu łagodnego, zatem istotne
jest ustalenie przed operacją, ryzyka wystąpienia nowotworu złośliwego, celem wykonania zabiegu operacyjnego
w ośrodkach specjalistycznych, co ma wpływ na przeżycie
chorych. Opracowano, w oparciu o test HE4 i CA 125 algorytm ROMA (ang. risk of ovarian malignancy algorithm),
który pozwala na określenie prawdopodobieństwa wystąpienia raka jajnika, u chorych z guzem przydatków. Uzyskane
wyniki interpretowane są w zależności od stanu hormonalnego chorych.
Przegląd piśmiennictwa
Celem pracy było oszacowanie stężeń HE4 i CA 125 u kobiet zdrowych jak i chorych zarówno ze zmianami łagodnymi jak i złośliwymi narządu rodnego. Autorzy pracy określali
użyteczność HE4 i CA 125 oraz algorytmu ROMA w diagnostyce różnicowej chorób narządu rodnego. Wyniki badań
dotyczyły reprezentatywnych grup, zarówno osób zdrowych
jak i chorych. Stężenia obu markerów oznaczano zestawami
firmy Abbott na analizatorze Architect.
Wykazano, znacząco wyższe stężenia CA 125 u kobiet zdrowych przed menopauzą w stosunku do kobiet po menopauzie, podczas gdy takich zależności nie stwierdzono dla HE4.
U chorych ze zmianami łagodnymi stężenia HE4 były podwyższone tylko sporadycznie u ok. 1%, podczas gdy stężenia CA 125 były podwyższone u 30% chorych. Wykazano
również, że obydwa badane markery miały podobną czułość,
a bezwzględne stężenia jak i częstość podwyższonych wyników u chorych na raka były znacząco wyższe w porównaniu ze zmianami łagodnymi. Stężenia CA 125 jak i HE4
wzrastały wraz ze stopniem zaawansowania klinicznego.
W porównaniu do oznaczeń każdego markera z osobna, równoczesne ich oznaczanie podnosi czułość diagnostyczną.
Reasumując, przydatność HE4 w diagnostyce różnicowej
związana jest z wyższą czułością i swoistością tego markera
wynikającą przede wszystkim, ze sporadycznie podwyższonych stężeń u chorych ze zmianami łagodnymi w narządzie
rodnym. Autorzy pracy potwierdzają, że pomiar stężenia HE4,
może istotnie poprawić efektywność diagnostyki raka jajnika.
Stężenia HE4 i CA 125 w odniesieniu do stanu hormonalnego (algorytm ROMA), charakteryzują się wysoką wartością
dyskryminacyjną w różnicowaniu rodzaju masy guza w obrębie miednicy. Zastosowanie algorytmu ROMA ma istotne
znaczenie wówczas kiedy poziomy HE4 są niskie a wyniki
CA 125 podwyższone. Komplementarne oznaczenie obu
markerów znacznie podwyższa czułość i swoistość diagnostyki różnicowej.
Według: Molina R, Escudero JM, Augé JM i wsp. HE4
a novel tumour marker for ovarian cancer: comparison with
CA 125 and ROMA algorithm in patients with gynaecological
diseases. Tumor Biol 2011; 32: 1087–1095
Maria Kowalska
Zakład Markerów Nowotworowych,
Centrum Onkologii, Oddział w Warszawie
Korelacja pomiędzy stężeniami HE4 a wielkością guza i naciekiem błony mięśniowej
macicy u chorych na raka trzonu macicy
Rak trzonu macicy stanowi ponad połowę wszystkich nowotworów narządu rodnego i 6% wszystkich nowotworów
złośliwych u kobiet w USA. Jego występowanie ma związek
z różnymi czynnikami, w tym istotną rolę odgrywa otyłość.
Jest to nowotwór złośliwy, którego charakterystyczne objawy kliniczne, pozwalają na postawienie rozpoznania, już
w niskich stopniach zaawansowania.
W chwili obecnej, nie dysponujemy dobrym markerem klinicznym, pozwalającym na monitorowanie leczenia oraz
takim, który byłby pomocny w przedoperacyjnej ocenie zaawansowania choroby. Wcześniejsze zaplanowanie rozległości zabiegu operacyjnego jest bardzo istotne, ze względu
na różnorodne czynniki obciążające tą grupę chorych. Istotna jest również rola markerów w pooperacyjnym monitorowaniu leczenia, ponieważ metody obrazowe potwierdzają
obecność masy guza, dopiero po osiągnięciu przez niego
odpowiednich rozmiarów. W diagnostyce i monitorowaniu
leczenia chorych na raka trzonu macicy rutynowo oznaczanym markerem jest CA 125. Ponieważ czułość diagnostyczna tego markera, zwłaszcza u chorych w niskich stopniach
zaawansowania jest niezadowalająca, od 10 do 20%, stale
poszukuje się nowych markerów, które mogłyby być pomocne w szeroko pojętej diagnostyce tej grupy chorych. Autorzy
wskazują na HE4, który znalazł zastosowanie w diagnostyce
chorych na raka jajnika. Do chwili obecnej tylko niewielu autorów badało przydatność oznaczanie tego markera w raku
trzonu macicy.
Celem pracy było oszacowanie związku stężeń HE4 z różnymi cechami kliniczno-patologicznymi tego nowotworu
tj. z wielkością guza, stopniem złośliwości histologicznej
i stopniem zaawansowania klinicznego. Stężenia HE4 były
oznaczane u chorych z typem I (rak endometrioidalny, histologicznie rak płaskonabłonkowy lub śluzowy, znacznie
częstszy, związany z ekspozycją na estrogeny) i typem II
(rak surowiczy lub jasnokomórkowy, rzadszy, o nie znanej
etiologii).
Badaniami objęto 75 chorych, u których HE4 oznaczano
metodą BioPlex Assay. U chorych tych równocześnie oznaczano CA125. U chorych na raka wykazano istotnie wyższe
stężenia median HE4 w porównaniu z grupą kontrolną, jak
również wtedy, kiedy stratyfikowano chore w zależności od
typu (I, II). U chorych z typem I wykazano statystycznie niższe stężenia median u tych, u których wielkość guza była ≤
2 cm i głębokość nacieku błony mięśniowej ≤ 50%. Takich
zależności nie wykazano dla stężeń CA 125. Nie wykazano
różnic pomiędzy stężeniami median HE4 u chorymi w typie
I a II. Autorzy badali także zależności pomiędzy stężeniami
median HE4 a stopniem zaawansowania wg. FIGO, wykazując jedynie różnice istotnie niższe u chorych w stopniu IA
vs pozostałe grupy badane. Nie wykazano różnic statystycznych w zależności od stopnia złośliwości histologicznej.
Wnioski:
Autorzy wykazali, że u chorych na raka trzonu macicy:
1. stężenia HE4 podwyższone są u znacznego odsetka chorych,
2. stężenia HE4 korelują z wielkością guza i głębokością nacieku błony mieśniowej,
3. HE4 odznacza się wyższą czułością diagnostyczną niż
CA 125.
475
Przegląd piśmiennictwa
Według: Kalogera E, Scholler N, Powless C i wsp. Correlation of serum HE4 with tumor size and myometrial invasion
in endometrial cancer. Gynecol Oncol. 2011 Oct 28. [Epub
ahead of print].
Maria Kowalska
Zakład Markerów Nowotworowych,
Centrum Onkologii, Oddział w Warszawie
Mutacja czynnika XII krzepnięcia w rodzinie Hagemana
Anomalia Hagemana jest rzadkim niedoborem XII czynnika
krzepnięcia. Termin ten został zaproponowany przez Oskara
Ratnoffa w roku 1955 po wykryciu tego niedoboru u Johna
Hagemana, u którego stwierdził brak wykrzepiania krwi in
vitro, bez innych anomalii krzepnięcia, nawet po zabiegach
operacyjnych. Później, Earl Davie i Oskar Ratnoff wyizolowali białko, którego niedobór stwierdzili w krwi Hagemana
i nazwali to białko czynnikiem XII (FXII). To, i inne odkrycia
przyczyniły się między innymi do zaproponowania modelu
tzw. kaskady krzepnięcia w 1964 roku przez Macfarlane
oraz Davie’go i Ratnoffa. Sam John Hageman zmarł w 1968
na skutek zatorowości płucnej, która była powikłaniem po
złamaniu. W tamtych czasach techniki klonowania nie były
jeszcze dostępne, stąd defekt genetyczny u Hagemana nigdy nie został oznaczony.
W listopadowym numerze czasopisma Journal of Thrombosis and Haemostasis ukazał się artykuł Xu-Cai Y.O. i współpracowników, którzy dokonali analizy genetycznej żyjących
krewnych Hagemana, i na tej podstawie przeprowadzili dochodzenie genetyczne, które stało się podstawą utworzenia
rodowodu i opisania mutacji, która była prawdopodobnie
przyczyną niedoboru FXII. Sam John Hagemana nigdy się
nie ożenił i nie pozostawił po sobie żadnych zstępnych. Analizie poddano 7 próbek od jego krewnych w III i IV pokoleniu
pochodzących od jego rodziców. Żadna z badanych osób
nie zgłaszała incydentów związanych z zaburzeniami krzepnięcia.
Autorzy zsekwencjonowali wszystkie 14 egzonów genu F12
i nie stwierdzili żadnej delecji, ani wstawienia nukleotydu
w analizowanym genie, które mogłyby doprowadzić do zmiany sensu transkryptu. Wykryli natomiast mutację w obszarze
intronu 11396 G>A F12, będącym regionem splicingowym
dla egzonu 14. Mutacja ta powodowała przesunięcie ramki
odczytu o jedną pozycję nukleotydu, co powodowało możliwą zamianę seryny w katalitycznym obszarze enzymu (FXII)
i zamianę pozostałych aminokwasów białka. Analiza transkryptu wykazała, że mRNA dla homozygot był niestabilny, co
jest prawdopodobnie główną przyczyną braku antygenu FXII
w osoczu osobników homozygotycznych, jakim prawdopodobnie był Hageman.
Co ciekawsze, ta sama mutacja została wykryta u 5 niespo476
krewnionych rodzin w Niemczech i innej niespokrewnionej
rodziny w Szwajcarii. Wszyscy wymienieni nosiciele mutacji byli „bezobjawowi” i zostali zdiagnozowani przypadkowo,
podczas wizyty w szpitalu. Rodzice Hagemana również pochodzili z Niemiec, co może świadczyć o „efekcie założyciela” dla tej mutacji. Autorzy nie wykluczają też możliwości, że
Hageman mógł być nosicielem 2 różnych mutacji genu F12,
których efekt się nakładał i mógł być przyczyną niedoboru.
U krewnych Hagemana, którzy byli nosicielami mutacji,
stwierdzono obniżony o 50% poziom antygenu w porównaniu do innych członków tej rodziny. Interesującym jest, że
„normalny” poziom FXII u członków tej rodziny był 1,8 razy
wyższy niż w spulowanym osoczu zdrowych dawców, dla
nosicieli tej mutacji poziom wynosił 90%.
Doniesienie to jest przykładem, jak można na podstawie
odpowiednio przeprowadzonego badania genetycznego
zaproponować genotyp nieżyjącej już osoby i wnioskować
o możliwych drogach penetracji mutacji w populacji.
Według: Xu-Cai YO, Shen J, Chen S i wsp. Factor XII gene
mutation in the Hageman family. J Thromb Haemost 2011;
9: 2329-2331.
Ewa Stępień
Katedra i Zakład Biochemii Klinicznej CMUJ
w Krakowie
Znaczące różnice między oznaczeniami
aktywności białka C przy użyciu metod
koagulometrycznych w przypadku mutacji Asn2Ile
Białko C (PC) jest bardzo ważnym inhibitorem krzepnięcia.
Jego funkcja polega na proteolitycznej degradacji aktywowanych czynników V (FVa) i VIII (FVIIIa) po uprzedniej aktywacji PC do APC (ang. activated protein C) przez układ
trombina-trombomodulina. Znane są niedobory funkcjonalne (typ II) i ilościowe (typ i) PC, które są przyczyną zwiększonego ryzyka występowania incydentów zakrzepowych. Mutacja PROC c.131C>T jest podstawieniem nukleotydowym,
które objawia się zamianą aminokwasu asparagina (Asn) na
izoleucynę (Ile) w pozycji 2 domeny Gla białka w ω-pętli odpowiedzialnej za wiązanie PC do receptora białka C (EPCR)
występującego na komórkach śródbłonka oraz odpowiedzialnej wiązanie do fosfolipidów (PL). Substytucja ta obniża
aktywność PC, co przy zmniejszonym stężeniu białka (na
skutek innych towarzyszących polimorfizmów genowych)
objawia się purpura fulminans.
Oznaczanie niedoborów PC polega na badaniu poziomu lub/i
aktywności białka C u chorych podejrzewanych o wrodzoną
predyspozycję do powikłań zakrzepowych (tzw. genetycznie
uwarunkowana postać trombofilii) na tym tle. Pomiary stężenia antygenu wykonuje się zazwyczaj za pomocą metod
Przegląd piśmiennictwa
ELISA (ang. enzyme-linked immunoassay). Aktywność funkcjonalna białka C może być oznaczana przy użyciu metod
opartych o aktywator uzyskany z jadu żmii amerykańskiej
(Agkistrodon contortrix; mokasyn miedziogłowiec) przez enzymatyczną aktywację PC do APC. Alternatywną metodą
jest oznaczanie aktywności APC przez pomiar wydłużenia
czasu aPTT (ang. activated partial thromboplasti time) po
dodaniu częściowej tromboplastyny lub aktywatora z jadu
żmii Rusella (ang. Russel viper venom –RVV).
Autorzy (Cooper i wsp.) w swej pracy dokonali porównania
oznaczeń zarówno stężenia jak i aktywności PC wykonanych
z zastosowaniem różnych metod, dla próbki osocza pozyskanego od 41-letniego nosiciela mutacji PROC c.131C>T
bez objawów klinicznych. Autorzy porównali następujące zestawy do oznaczeń antygenu:
1. ELISA z króliczymi przeciwciałami poliklonalnymi (DAKO,
Glostrup, Dania), zakres referencyjny: 75-131 IU/dl.
metody chromogenne do oznaczeń aktywności:
2. Berichrom PC (Sysmex CA 1500, Siemens, Deerfield, IL,
USA), zakres referencyjny: 70-148 IU/dl.
3. STACHROM PC (Stago Star evolution, Diagnostica Stago, Asnieres-sur-Seine, Francja), zakres referencyjny:
70-130 IU/dl.
4. Metoda własna oparta o substrat chromogenny Protac
i S2366, zakres referencyjny: 79-161 IU/dl.
metody koagulometryczne:
5. CRYO check Clot C zakres referencyjny: 70-130 IU/dl.
6. STACLOT PC (met. manualna, Diagnostica Stago, Asnieres-sur-Seine, Francja), zakres referencyjny: 70-140 IU/
dl.
7. STACLOT PC (Stago Star evolution, Diagnostica Stago,
Asnieres-sur-Seine, Francja), zakres referencyjny: 70130 IU/dl.
8. ProClot PC (met. manualna, Beckman Coulter, Brea, CA,
USA), zakres referencyjny: 70-140 IU/dl.
Oznaczenia były wykonane w 2 pobranych osobno kolejnych próbkach.
W wyniku porównań autorzy wykazali, że opisana przez
nich mutacja (Asn2Ile) genu PROC c.131C>T jest odpowiedzialna za obniżenie aktywności koagulologicznej PC do
poziomu 46-54 IU/dl dla metod 6 i 7, czyli poniżej zakresu
referencyjnego. Wyniki oznaczeń wykonanych metodami
5 i 8 mieściły się natomiast lub były bardzo bliskie zakresom
referencyjnym: 67, 72 i 87, 95 IU/dl, odpowiednio. Dla pozostałych metod, tj. oznaczeń stężenia antygenu i aktywności
metodami chromogennymi, uzyskane wartości mieściły się
w granicach zakresu referencyjnego.
Pomiar stężenia białka C jest metodą zalecaną w oznaczeniach niedoboru PC typu I, czyli niedoborów ilościowych. Do
oceny niedoborów funkcjonalnych (typ IIb) zalecane są pomiary aktywności PC. Różnica pomiędzy metodami koagulometrycznymi a chromogennymi polega głównie na tym, że
w badaniu metodami koagulometrycznymi sprawdza się oddziaływania pomiędzy APC, fosfolipidami, białkiem S, które
jest kofaktorem dla białka C oraz substratami dla APC (FVa
i FVIIIa), niezbędnymi do oceny aktywności APC.
W opinii autorów, pomimo, że do oceny funkcji i aktywności
APC u chorych z niedoborami tego białka dedykowane są
oznaczenia koagulometryczne, to dostępne na rynku zestawy analityczne mogą dawać rozbieżne wyniki, błędnie
oceniające aktywność różnych wariantów białka C. W takich
przypadkach zalecane jest przez autorów wykonanie wielu
oznaczeń różnymi metodami, w celu właściwej oceny niedoboru PC.
Według: Cooper PC, Siddiq S, Morse C i wsp. Marked discrepancy between coagulometric Protein C activity assays
with the pro-thrombotic Protein C Asn2Ile. Int Jnl Lab Hem.
2011; 33: 451-456.
Ewa Stępień
Katedra i Zakład Biochemii Klinicznej CMUJ,
w Krakowie
477