pobierz

Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 4, str. 629–638
PRACA POGLĄDOWA – Review Article
EWA STUDNIAK, STANISŁAW ZAJĄCZEK
Rola genu P53 i delecji w obszarze 17p w powstawaniu i przebiegu
białaczek i zespołów mielodysplastycznych
The role of the P53 gene and deletions in 17p region in the pathogenesis
and course of leukemia and myelodysplastic syndrome
Samodzielna Pracownia Cytogenetyki
Zakład Patologii; Pomorski Uniwersytet Medyczny
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Stanisław Zajączek
STRESZCZENIE
Omówiono lokalizację, budowę oraz rolę biologiczną genu P53 i jego białka. Zaburzenia genu P53 odgrywają znaczącą rolę w patomechanizmie białaczek, zwykle polegają na homozygotycznej lub hemizygotycznej inaktywacji genu i mogą być identyfikowane technikami o róŜnej rozdzielczości. Opisywane są zarówno duŜe delecje w zawierającym gen P53 obszarze 17p, jego bardzo częste mutacje punktowe oraz zmiany ekspresji białka. Zmiany takie odnotowywane są we wszystkich rodzajach nowotworów krwi, najczęściej w przewlekłej białaczce limfocytowej. Zaburzenia genu P53 nasilają się zazwyczaj w przebiegu progresji tych chorób, w niektórych białaczkach obserwowane
jest silne powiązanie pomiędzy wysoką częstością zmian genu, a niekorzystnym rokowaniem. Zmiany genu P53 nie
mają jednak znaczenia diagnostycznego dla poszczególnych typów białaczek.
SŁOWA KLUCZOWE: Gen P53 – Białaczki– Delecje – Zmiany Ekspresji.
SUMMARY
We discussed the location, structure and biological role of P53 gene and its protein. Aberrations of P53 gene play
a significant role in pathogenesis of leukemias, usually lead to the homozygous or hemizygous inactivation and can
be identified with a different resolution techniques. Based on previous study, large deletions at region 17p which harbors P53 gene, very frequent point mutations and changes expression of P53 protein are described. These aberrations
are observed in all types of blood cancer, most often in chronic lymphocytic leukemia and they are increased usually
with progression of the disease. In some leukemias observed a strong correlation between the frequency of their occurrence and poor prognosis. However, these changes are not diagnostic for differentiating the various types of leukemias.
KEY WORDS: P53 Gene – Leukemias – Deletions – Alterations of Expression.
Minęło ponad 30 lat od odkrycia genu P53, kluczowego supresora nowotworów, które stało się
kamieniem milowym w rozumieniu procesu nowotworzenia na poziomie molekularnym. Na gen ten
zwrócono uwagę w 1989 r., gdy wyniki badań wskazały na jego liczne nieprawidłowości w róŜnych
postaciach nowotworów u ludzi. Gen P53 stał się bardzo popularnym obiektem badań, otrzymując
w 1993 roku od Science tytuł "molekuły roku". Wiadomo, Ŝe funkcja genu P53 polega na wyzwoleniu
ekspresji wielu dalszych genów, które ostatecznie chronią integralność genetyczną komórek. Gen ten
jest supresorem niewłaściwej proliferacji komórkowej, wpływa na replikację i reperację DNA oraz
indukuje apoptozę komórek nieprawidłowych. Działanie to jest szczególnie istotne w komórkach
progenitorowych, naraŜonych na silne uszkodzenia DNA oraz podczas proliferacji komórek,
spowodowanej aktywacją onkogenów. Aktywność P53 moŜe równieŜ spowodować przejściowe
zatrzymanie cyklu w komórkach naraŜonych na toksyczne działanie na stałym, podprogowym
poziomie. Mała liczba uszkodzeń DNA indukuje stymulację reperacji przez gen P53, natomiast bardzo
630
E. STUDNIAK, S. ZAJĄCZEK
liczne zmiany stymulują wyzwalanie przez niego apoptozy i ostateczną śmierć komórek [1, 2]. Zmiany
genu P53 to najczęściej odnotowywane zaburzenia genetyczne w guzach litych; jego mutacje występują
w ponad połowie z nich. Względnie rzadziej odnajdujemy te nieprawidłowości w chorobach
rozrostowych krwi. Jednoznacznie jednak stwierdzone jest częste współwystępowanie defektów tego
genu z niekorzystnymi czynnikami rokowniczymi, obserwowane w takich zaburzeniach jak np.
we wznowie ostrej białaczki limfoblastycznej, wtórnej ostrej białaczce szpikowej, kryzie blastycznej
przewlekłej białaczki szpikowej oraz podczas ewolucji przewlekłej białaczki limfocytowej do zespołu
Richtera [3]. Omówienie wpływu zaburzeń genu P53 na przebieg poszczególnych typów białaczek
pozwoli na bliŜsze zapoznanie się z tym aspektem jego oddziaływania.
Gen P53 i białko P53
Oficjalna nazwa genu wg HUGO to TP53, obejmuje ona równieŜ dwa aliasy: P53 oraz LFS1 (z ang.
"Li-Fraumeni syndrome"). Gen P53 zlokalizowany jest na chromosomie 17 (17p13.1), składa się z 11
eksonów (22 000 bp), kodujących 2.2 Kb mRNA. Niekodujący ekson 1 od pozostałych 10 eksonów jest
oddzielony duŜym intronem (10kb), dlatego teŜ translacja rozpoczyna sie w eksonie 2 [4]. Produktem
ekspresji genu jest fosfoproteina P53 (Hp53) o masie cząsteczkowej 53 kDa. Budowa białka P53 jest
typowa dla aktywatorów transkrypcji: składa się z domeny N-końcowej, rdzenia i domeny
C-terminalnej; kaŜda z nich spełnia określone funkcje. RóŜnorodne czynniki wpływają na aktywację
P53, która moŜe być modyfikowana poprzez oddziaływanie posttranslacyjne: domena N-terminalna
ulega silnej fosforylacji, podczas gdy domena C-terminalna moŜe być zarówno fosforylowana,
acetylowana oraz ubikwitynowana.
Białko P53 w pewnych sytuacjach uwalnia blokadę cyklu komórkowego, w innych blokuje; bierze
takŜe udział w regulacji transkrypcji róŜnych genów: BCL2, BAX, GADD45, oraz MDM2. W przypadku
niektórych uszkodzeń DNA, białko P53 aktywuje gen P21, zatrzymując cykl komórkowy w fazie G1.
Czas tej blokady pozwala na naprawę DNA przy udziale enzymów, takich jak PARP, glikozylazy
DNA, endonukleazy. Białko P53 indukuje proces apoptozy dopiero wtedy, gdy naprawa uszkodzonego
DNA okaŜe sie nieskuteczna. Nasila się wówczas ekspresja proapoptycznego białka BAX na błonie
mitochondrialnej, następuje blokada genu BCL-2 oraz stymulacja ekspresji receptora Fas na błonie
komórkowej [2, 5].
Białko P53 posiada liczne izoformy, róŜne jego formy powstają drogą alternatywnego wycinania
podstawowej sekwencji [6, 7]. Obecnie rozróŜnia się przynajmniej 8 wariantów sekwencyjnych genu
P53, ich odrębności funkcjonalne nie są jeszcze do końca poznane [8].
Wpływ białka P53 realizuje się przez transaktywację kaskad innych podległych mu genów jak teŜ
poprzez bezpośrednie działanie białka. Unieczynnienie białka P53 moŜe być wywołane przez jego
mutacje punktowe lub delecje. W komórkach zdrowych białko to moŜe być równieŜ unieczynnione
poprzez połączenie z białkiem genu MDM2, tworząc z nim nieaktywny kompleks. Kompleks MDM2P53 uwalnia białko P53 w przypadku stresu komórkowego, natomiast, gdy komórka nie wykazuje zapotrzebowania na białko P53, ulega degradacji. Uznanymi mechanizmami wpływającymi na ekspresję
P53 jest jego interakcja ze złoŜoną siecią białek komórkowych, w których istotną rolę wydają się
odgrywać właśnie białka genów MDM2 i MDM4 [9, 10]. Innym negatywnym regulatorem ekspresji
P53 mogą być microRNA kodowane na chromosomie 21, jednak ich udział w regulacji ekspresji genu
P53 nie jest jeszcze udowodniony. Wykazano jednak, Ŝe wysoki poziom ekspresji tych microRNA
towarzyszył popularnej fuzji ETV6-RUNX w 4 róŜnych liniach komórkowych ALL, natomiast ekspresji
tej nie towarzyszyła (jak moŜna było się spodziewać) trisomia 21 [11].
Zaburzenia genu P53
Zaburzenia genu P53 mogą mieć charakter konstytucyjny, co wiąŜe się z rzadkim zespołem
Li Fraumeni i zespołem Li Fraumeni podobnym (z ang.Li Fraumeni Like); natomiast mutacje
Rola genu P53 i delecji w obszarze 17p
631
somatyczne pojawiają się w 5% do 80% róŜnych rodzajów nowotworów w zaleŜności od ich typu
i stopnia zaawansowania [12]. Częstość pojawiania się mutacji P53 w nowotworach jest róŜna
w zaleŜności m.in. od lokalizacji narządowej; najczęściej obserwowane są w guzach płuc, natomiast
najrzadziej w białaczkach (przeciętnie ~10% pacjentów, patrz niŜej). Odsetek komórek wykazujących
zmiany P53 równieŜ wykazuje znaczne róŜnice w zaleŜności od ich lokalizacji. Najczęściej takie
zmiany obserwuje się w komórkach raka jajnika (~48%), w około 1/10 róŜnych rodzajów nowotworów
układu hematopoetycznego oraz najrzadziej w raku szyjki macicy. Około 75% mutacji punktowych
odnotowanych w odpowiednich bazach danych, stanowią mutacje typu missens, a skutkiem większości
mutacji jest dysfunkcyjne białko. Około 90% znanych mutacji zmienia poziom ekspresji białka,
natomiast tylko 10% powoduje jego całkowity brak. Najczęściej mutacje stwierdza się w obrębie piątego, szóstego, siódmego i ósmego eksonu i w większości są zlokalizowane w trzech kodonach:
175 (ekson 5), 248 (ekson 7) oraz 273 (ekson 8), stanowiąc tym samym tzw. "hot spots". Istnieją jednak
trudności wpływające na szacowanie liczby mutacji, wynikające z dwuznaczności interpretacji
rozróŜnienia mutacji od wariantów polimorficznych; te ostatnie mogą takŜe róŜnić się w zaleŜności
od rodzaju nowotworu i wykazywać odmienne właściwości biologiczne. Analiza wszystkich mutacji
punktowych w genie P53 wykazała, Ŝe 51% z nich stanowią tranzycje G:C>A:T, wśród nich 59%
dotyczy oligonukleotydów CpG. [8, 9]. Tylko 15% mutacji ma miejsce poza obszarem tzw. gorących
miejsc, i są to mutacje zmiany ramki odczytu lub mutacje typu nonsens [12].
Mutacje punktowe mogą wywołać następujące zmiany funkcjonalne białka P53:
A. Zmianę wydajności transaktywacji innych genów;
B. Modyfikację zdolności do blokowania cyklu komórkowego i/lub indukcji apoptozy;
C. Zdolność do wywierania dominująco- negatywnego efektu (DNE-dominant-negative effect);
D. Zmianę termowraŜliwości białka;
E. Uzyskanie przez białko nowych funkcji, których nie posiada w stanie prawidłowym (tzw. gain
of function-GOF). Najistotniejszym mechanizmem działania białka P53 jest transaktywacja innych
genów, a mutacje typu missens mogą spowodować niŜsze wartości tej transaktywacji zaleŜnych
genów z ich białkami częściowo funkcjonalnymi [9].
Być moŜe, mutacje takie, są czynnościowym odpowiednikiem sytuacji, w której obserwuje się
zwiększenie lub zmniejszenie samej tylko liczby kopii genu P53 w badanych komórkach, widoczne np.
w badaniach FISH. Utrata jednej kopii genu moŜe stanowić odpowiednik mutacji punktowych
w wyniku których, białko P53 utraciło całkowicie lub częściowo zdolność transaktywacji innych
genów. Mutacje z całkowitą utratą funkcji towarzyszą częściej sytuacji wcześniejszego wystąpienia
nowotworu aniŜeli tylko częściowa utrata aktywności genu.
Wpływ na funkcję P53 moŜe mieć równieŜ zjawisko utraty heterozygotyczności genu (ang. loss
of heterozygosity, LOH), gdy stwierdza się utratę jednego, prawidłowego allela przy obecności mutacji
drugiego z nich.
Utrata prawidłowej funkcji białka P53 moŜe wynikać nie tylko z mutacji punktowych genu,
ale równieŜ z delecji homozygotycznej lub hemizygotycznej albo rearanŜacji w samym jego obszarze
lub w całym prąŜku 17p13. Na Fot. 1 przy uŜyciu metody FISH, przedstawiono delecje hemi- oraz
homozygotyczną genu P53 pacjenta z rozpoznaniem ostrej białaczki limfoblastycznej.
W prawidłowych komórkach białko P53 nie kumuluje się w ilościach wykrywalnych, co wiąŜe się
z krótkim okresem połowicznego rozpadu (6–20 min.). Natomiast większość jego zmutowanych form
ma wydłuŜony okres półtrwania (6–12 h), co czyni je moŜliwym do wykrycia. Wewnątrzjądrową
akumulację białka P53, która zazwyczaj towarzyszy jego nieprawidłowościom, a nawet jest uznawana
za ich synonim, ocenia się technikami immunohistochemicznymi, z uŜyciem przeciwciał
monoklonalnych. Być moŜe jednak, istnieją równieŜ inne, niŜ mutacja, mechanizmy zwiększające okres
półtrwania białka P53 i powodujące równieŜ jego wykrywalność tymi technikami. Zjawisko nasilonej
ekspresji i akumulacji białka P53, wiąŜe się z gorszym rokowaniem i agresywniejszym przebiegiem
poszczególnych nowotworów [5, 13].
E. STUDNIAK, S. ZAJĄCZEK
632
A.
B.
C.
Fot. 1. Hybrydyzacja in situ z uŜyciem sondy Vysis LSI P53(17p13.1) A. Obecność obu alleli genu P53- widoczne dwa sygnały czerwone oraz dwa kontrolne sygnały zielone B. Delecja jednego allela (hemizygotyczność genu P53) C. Delecja obu alleli
(homozygotyczność genu P53) (badania własne).
Fot. 1. In situ hybridization using a probe Vysis LSI P53 (17p13.1) A. The presence of both alleles of the gene P53-see two red
signals and two control green signals B. Deletion of one allele (P53 hemizygosity) C. Deletion of both alleles (P53
homozygosity) (own material).
Regulacja zachowania się hematopoetycznych komórek pnia przez białko P53
Oddziaływanie białka P53 okazało się waŜne nie tylko w warunkach stresu komórkowego.
Na terenie hematopoetycznych komórek pnia (HCS) wykazuje ono waŜny wpływ w czasie
niezakłóconej hematopoezy, regulując stan spoczynkowy komórek HSC i ich samoodnowę (wpływ
pośredniczony przez GF1 i netsdin). Stres komórkowy wyzwala aktywację genu ATM, co z kolei
zwiększa aktywność genu P53 poprzez zaleŜne mediatory, min. gen P21. P53 wyzwala: zatrzymanie
cyklu komórkowego, mechanizmy naprawy DNA i apoptozy. Poziom białka P53 wpływa na
zasiedlanie przez komórki HSC poszczególnych obszarów hematopoezy, preferując przeŜycie komórek
z niską aktywnością białka P53. Białko P53 moŜe takŜe wpływać na kompetycję pomiędzy
subpopulacjami komórek zawartymi w HSC; nie wiadomo jednak czy kompetycja ta moŜe spowodować dominację komórek ze zmutowanym białkiem i podwyŜszoną czynnością proliferacyjną nad
subpopulacją komórek o niezmienionym białku P53. Komórki HSC mają dobrze znaną zdolność
samoodnowy oraz róŜnicowania się w poszczególne linie komórek krwi. W stanie spoczynkowym
większość HSC jest nieaktywnych, a tylko określony odsetek wchodzi do cyklu komórkowego. Stres
komórkowy powoduje, Ŝe większa liczba komórek rozpoczyna cykl komórkowy, co umoŜliwia
samoodnowę krwi. HSC podlegające rekrutacji uŜywają rekombinacji homologicznej (moŜe być
źródłem wtórnych do reperacji uszkodzeń pochodnych zmian sekwencji DNA); podczas gdy
spoczynkowe HSC posługują się rekombinacją niehomologiczną. Dynamika i funkcje komórek HSC są
regulowane poprzez liczne czynniki transkrypcyjne, na które z kolei wpływ wywiera poziom
aktywności białka P53, realizujący się zwłaszcza poprzez pośrednicząca subpopulacje komórek LSK.
Wzrost liczebności komórek LSK wpływa na rekrutację znaczącej puli HSC do cyklu komórkowego.
Prawdopodobnie docelowym elementem w regulacji HSC dla białka P53 jest inhibitor cyklinozaleŜnej
kinazy P21. Białko P53 jest równieŜ krytycznym regulatorem apoptozy w HSC, a zahamowanie jego
funkcji prowadzi do oporności tych komórek na apoptozę. Jednocześnie zmutowane formy P53
o zmniejszonej aktywności powodują wcześniejsze starzenie się i obniŜenie zdolności proliferacyjnych
HSC. Wielostronne oddziaływania białka P53 na poziomie komórek HSC, w tym wyraźny wpływ
na ich rekrutację i proliferację, wydaje się istotnym potencjalnym mechanizmem współuczestniczącym
w transformacji nowotworowej [1, 14].
Rola genu P53 i delecji w obszarze 17p
633
Zaburzenia genu P53 w białaczkach
Zaburzenia genu P53 identyfikowane są, jako: delecje róŜnych obszarów 17p widoczne
w kariotypie lub tylko przy uŜyciu techniki FISH, mutacje wykrywane technikami molekularnymi oraz
zmiany ekspresji genu oceniane przy pomocy cytometrii przepływowej lub immunocytochemii.
U pacjentów z białaczkami, zaburzenia te obserwuje się u 10–15% chorych, częściej występują w miarę
progresji choroby, a pojawienie się ich wiąŜe się ze złym rokowaniem [15]. Analizy mutacji
punktowych w białaczkach i chłoniakach wskazują, Ŝe 50% z nich to tranzycje G:C>A:T,
w przewaŜającej liczbie zlokalizowane w oligonukleotydach CpG, podobnie jak w innych nowotworach
[8]. Mutacje te powstają zazwyczaj na skutek spontanicznej deaminacji 5-metylocytozyny i być moŜe
nie muszą być indukowane egzogennymi karcynogenami [16].
ALL
Izochromosom (17)(q10) jako zmiana pierwotna, z utratą ramion krótkich i obu kopii genu P53,
opisano u ponad stu pacjentów z ALL i były to zwykle izolowane zmiany kariotypowe. Jako zmiana
wtórna, izochromosom ten najczęściej pojawia się u pacjentów Ph’ dodatnich, co moŜe wpływać
na rzadkość jego występowania, jest jednak spotykany zwłaszcza w kariotypach wysoko hiperdiploidalnych [17]. Immamura i wsp. donoszą, Ŝe mutacje P53 pojawiają się w typie „common” i pre-B
u 2–3% chorych, w typie L3 (Chłoniak Burkitt’a) i T-ALL częstość sięga juŜ 50% (bez określenia,
na jakim etapie choroby) [18]. W danych zbiorczych wielu autorów, średnia liczebność pacjentów
z mutacjami P53 na początku choroby wynosi 5% w B-ALL oraz 5% z T-ALL. Odsetek mutacji rośnie
podczas wznowy: obserwowano je u 7% do 30% pacjentów z T-ALL. Jednak analiza Gumpa i wsp.
była zaskakująco odmienna; sekwencjonowanie nie ujawniło mutacji P53 u Ŝadnego z 17 badanych
pacjentów z ALL, w tym tylko dwóch chorych z T-ALL [18,19, 20, 21, 21]. W przebadanych liniach
komórkowych prowadzonych in vitro, pochodzących od pacjentów z B-ALL, mutację w eksonach 4 i 8
znaleziono w ok. 30% (3/10) [22]. LOH P53 Krieger i wsp. opisali u zaledwie1/109 pacjentów z T-ALL
[23].
Ekspresja mierzona poziomem białka P53 jest niŜsza w chwili rozpoznania niŜ podczas progresji
białaczki; początkowo wykryto ją u 17% pacjentów z ALL (nie podając immunofenotypu) oraz u 14%
pacjentów z pre-T ALL. NajwyŜszy poziom tego białka stwierdzono podczas wznowy (87%; 7/8
pacjentów) [3, 24]. PoniewaŜ wykrywalna cytochemicznie ekspresja dotyczy zmutowanej formy białka
narastającej w przebiegu choroby liczby mutacji. Czynniki modyfikujące ekspresję P53 wpływają na
przebieg kliniczny białaczek limfoblastycznych. Przykładem moŜe być dziecięca ALL, w której
czynnikami modyfikującymi ryzyko pojawiania się choroby, zwłaszcza u dziewczynek i wpływająca na
wcześniejszy jej wiek pojawiania się, są polimorfizmy genu MDM2, uznanego jako czynnik regulujący
ekspresję P53 (średnia wieku 36 msc. u dziewczynek i 60 msc. u chłopców). MoŜe to sugerować
pojawiającą się prenatalnie predyspozycję do zachorowania na ALL [25].
AML
Podobnie jak w ALL, utratę 17p występującą w postaci izochromosomu (17)(q10) jako zmianę
izolowaną kariotypowo, zarejestrowano równieŜ u więcej niŜ 100 przypadków AML, natomiast jako
aberracja wtórna pojawia się rzadko [26]. Utraty te występują zwykle u pacjentów po 60 r.Ŝ.
z kariotypem złoŜonym, którzy mają znacznie gorszą prognozę, w porównaniu do chorych bez zmian
w kariotypie. Wyjątkowo niekorzystne rokowanie wykazują chorzy z towarzyszącą utracie 17p, amplifikacją lub utratą genu MLL, oraz monosomią/delecją 5q. JednakŜe juŜ sama tylko delecja 17p jest
niezaleŜnym czynnikiem złego rokowania w AML, wpływającym na ryzyko wznowy i całkowity czas
przeŜycia [27]. Delecję 17p opisywano u 5% (105/2272) chorych z AML, u 1/4 z nich była to zmiana
izolowana lub występująca tylko z jedną zmianą dodatkową, a u 3/4 z nich była widoczna w kariotypie
634
E. STUDNIAK, S. ZAJĄCZEK
złoŜonym, jako aberracja wysokiego ryzyka wymagająca agresywniejszego leczenia [28]. MoŜliwe jest
równieŜ współwystępowanie delecji 17p i mutacji punktowej homologicznego allela genu P53; Wattel
i wsp. delecję 17p wykryli metodami prąŜkowymi u 10/16 chorych z jednoczesną mutacją missens drugiej kopii genu. RównieŜ 3 pacjentów bez delecji 17p, z mutacją punktową, utraciło niezmutowany
drugi allel P53 [15]. Wśród pacjentów z delecją 17p wykrytą cytogenetycznie w kariotypie złoŜonym,
współwystępowanie utraty drugiego allela P53 lub jego mutacji punktowych obserwowano u 87%
chorych (50/57); w przeciwieństwie do pacjentów bez delecji, mutacja punktowa występowała u 66%
pacjentów. Obserwacje te oceniane łącznie wskazują, Ŝe zjawiska współwystępowania delecji i mutacji
punktowych obu homologicznych alleli, chociaŜ częste, nie są ze sobą bezwzględnie powiązane [29,
30]. W duŜej części dostępnego piśmiennictwa, delecje genu P53 oceniano metodami cytogenetyki
klasycznej i/lub molekularnych analiz DNA. Podobne dane weryfikowane technikami FISH są
zaskakująco ubogie dla ostrych białaczek; jedynie Marques i wsp. delecje P53 potwierdzili w 30%
ocenianych komórek szpiku u dziecka z AMKL (z ang. Acute Megakaryoblastic Leukemia) [31].
Mutacje P53 pojawiają się wg Immamury u 15% pacjentów z AML [18]. Zespół Downa jest
uznanym czynnikiem predysponującym do białaczek, dodatkowym czynnikiem modyfikującym tę
predyspozycję mogą okazać się współistniejące mutacje P53 – znaleziono je u 2/3 dzieci z zespołem
Downa i białaczką AMKL [32].
Akumulacja białka P53 oceniana cytometrią przepływową, osiągała najniŜszy poziom na początku
choroby (33%) i rosła wraz ze wznową (67–71%) [3, 33]. Interesujące wyniki opublikowali Pluta i wsp.
oceniając równoczesność ekspresji białka P53 oraz białka P73, które są strukturalnymi
i funkcjonalnymi homologami (białko P73, podobnie jak P53, ulega aktywacji na skutek uszkodzeń
DNA indukowanych m.in. przez chemioterapeutyki i wiąŜe się do grupy tych samych sekwencji
promotorowych). U 50 badanych z AML stwierdzono ekspresję P53 w 91%, a ekspresję P73 w 86%
komórek blastycznych. Nie stwierdzono zaleŜności pomiędzy ekspresją obu tych białek, a całkowitą
odpowiedzią na leczenie. Chorzy z wyŜszymi poziomami obu białek wykazywali tendencję do
wydłuŜania się czasu przeŜycia [34]. Porównując do poprzednio cytowanych danych dotyczących ALL,
sugeruje to inne znaczenie prognostyczne ekspresji P53 w AML.
Analizując współzaleŜności białek P53 i P73 w komórkach AML, Chakraborty i wsp. wykazali,
Ŝe w przypadku zmutowanego genu P53 wykorzystywana jest alternatywna droga indukcji apoptozy,
w której bierze udział właśnie białko P73. JeŜeli więc funkcja głównego induktora apoptozy, P53,
ulegnie zablokowaniu, zostanie uruchomiony alternatywny gen P73 [35, 36]. Mutacje genu P53
korelują w AML równieŜ z aktywnością genów PML oraz PTEN. Haupt i wsp. wykazali,
Ŝe prawidłowa kopia genu PML zwiększa aktywność transkrypcyjną zmutowanego genu P53, mimo Ŝe
ten ostatni uległ mutacji, co ma miejsce w proliferacji komórek nowotworowych. Spadek ekspresji
PML blokuje wzrost komórek nowotworowych niosących mutacje P53 poprzez zatrzymanie cyklu
komórkowego. Ekspresja białka PTEN hamuje degradację zmutowanego białka P53 oddziałując na
białko regulacyjne MDM2, a prawdopodobnie takŜe na samo białko P53 [37, 38].
Metody immunohistochemiczne wykazały ekspresję białka P53 u 27% badanych wg Kanavaros
i wsp. oraz u 29% badanych z róŜnymi postaciami AML wg Paydas i wsp.; natomiast Kitagawa i wsp.
przedstawili znacząco niŜszy odsetek, bo tylko u 5% badanych [39, 40, 41].
MDS
Utrata krótkiego ramienia chromosomu 17p, będąca skutkiem roŜnych wydarzeń cytogenetycznych,
pojawia się u około 5% pacjentów z MDS [42]. Delecja w obszarze 17p występuje u około 1/3 chorych
z wtórnym MDS; charakterystyczne dla tego zespołu są anomalie neutrofilów w postaci nieprawidłowej
konglomeracji chromatyny, pseudoanomalii Pelger-Heuta i mikrowakuolizacji jąder. Postać tę cechuje
ostry przebieg choroby, powikłania infekcyjne i krwotoczne, zła odpowiedź na leczenie i krótki czas
przeŜycia [43]. Dysgranulopoeza i zła prognoza występuje szczególnie wtedy, gdy delecja w obszarze
17p w MDS współwystępuje z anomaliami genu MLL i delecją/monosomią 5q. Jednak, gdy delecja 17p
Rola genu P53 i delecji w obszarze 17p
635
pojawia się wraz zaburzeniami chromosomu 3(q21q26), trisomią 8 i 9 oraz translokacjami w regionie
11q, rokowanie jest juŜ nieco lepsze [44]. Współwystępowanie delecji 17p i jednoczesnej mutacji
homologicznego allela genu P53 obserwuje się u większości pacjentów.
Wyłącznie mutacje punktowe genu P53 w pierwotnym MDS obserwuje się u 5–10% pacjentów,
ich częstość jest niŜsza niŜ we wtórnym MDS (25–30%) (18). Mutacje missens znacznie częściej pojawiają się w dwóch typach MDS: RAEB (z ang. Refractory Anemia with Excess Blasts) oraz RAEB-T
(z ang. Refractory Anemia with Excess Blasts in Transformation), częściej towarzyszy im teŜ kariotyp
złoŜony. Obserwowano je u 7% (3/44), 11% (20/18), 14%(16/118), 24% (25/89) chorych [45, 15, 46,
47].
Talwalkar i wsp. u jednego z dwojga chorych z MDS i z mutacjami P53, stwierdzili zespół Li-Fraumeni
[12]. Najczęstsze w MDS mutacje typu missens w eksonach 4-8 pojawiają się zarówno jako zdarzenia
wczesne i późne, wiąŜą się z gwałtownym przebiegiem choroby i złym rokowaniem. Średnia przeŜycia
u pacjentów z mutacją P53 i MDS jest krótsza w porównaniu do pacjentów bez mutacji (2.5 msc vs
13.5 msc) [27].
Odrębnym czynnikiem prognostycznym w MDS, moŜe być równieŜ poziom metylacji genu P53;
analiza 44 pacjentów wykazała hipometylację znacznych obszarów tego genu, która jest uwaŜana
za przyczynę zmian prowadzających do ostrej białaczki szpikowej (48).
Dane dotyczące ekspresji genu P53 są nieliczne; nadekspresja jest rzadziej spotykana u pacjentów
z pierwotnym MDS, częsta natomiast we wtórnym MDS i MDS powstałym na skutek autologicznego
przeszczepu szpiku kostnego (75%) (39, 49). MDS u wszystkich pacjentów z nadekspresją białka P53
ewoluował do ostrej białaczki [41].
CML
Izochromosom (17)(q10) z utratą ramienia 17p pojawia się często w CML jako zmiana wtórna;
w kryzie blastycznej stwierdza się u ~30% chorych, a u 40% z nich pojawia się mutacja w pozostałym
allelu [18, 42].
Progresja CML przebiega takŜe ze wzrostem ekspresji białka P53, a jego poziom, który w fazie
przewlekłej wynosił ~9%, wzrastał w fazie akceleracji do ~57%, a najwyŜszy był w kryzie blastycznej,
bo aŜ 73% [3]. Wykazano, Ŝe nabyta utrata funkcji P53 przyczynia się do transformacji do blastów
hematopoetycznych komórek wykazujących ekspresję p210 (BCR/ABL) [50].
CLL
W badaniach pacjentów z CLL najczęściej rozpoznawana jest B-CLL, nie wszystkie publikacje
róŜnicują jednak te dwa typy białaczki, zatem w większości z nich naleŜy domniemywać, Ŝe
rozpoznanie CLL będzie równoznaczne z B-CLL.
RóŜne zmiany w genie P53 pojawiają się w chwili rozpoznania CLL u 5–15% pacjentów,
zwłaszcza tych z kariotypem złoŜonym; podczas progresji choroby częstość pojawiania się zmian
znacznie wzrasta [18].
Pośród wszystkich rodzajów białaczek wykrywanie delecji 17p prowadzone jest w CLL najczęściej
techniką FISH; delecję hemizygotyczną obserwuje się zwykle u 5–12% pacjentów, przy czym
pozostały allel często ulega mutacji punktowej [51, 52]. W trakcie przebiegu choroby u 132 chorych
kolejne analizy wykazały delecje P53 oraz mutacje w pozostałym allelu u ~11% pacjentów, izolowana
mutacja missens w P53 pojawiła się u ~6%, natomiast tylko delecja bez towarzyszącej jej mutacji
w drugim allelu, była niezmiernie rzadka, bo tylko u ~1% pacjentów [53].
Podobny odsetek mutacji punktowych, jak zmian wykrywanych technikami FISH, stwierdzili
równieŜ inni autorzy: mutacje znaleźli u 11% (9/81 chorych, metoda SSCP); przy czym 4 z nich
z mutacją punktową jednego allela, wykazało równieŜ monosomię homologicznego chromosomu 17
[29]. Równoczesna identyfikacja mutacji punktowych (sekwencjonowanie DHLPC) i badanie techniką
636
E. STUDNIAK, S. ZAJĄCZEK
FISH przeprowadzili Dicker i wsp. analizując 193 pacjentów i u ~13% (26/193) znaleziono mutacje,
natomiast delecje tylko u ~9% badanych [54]. RównieŜ w analizie 99 pacjentów z CLL opornych na
fludarabinę mutacje punktowe stwierdzono u 37%, natomiast delecje 17p u 11% badanych; pacjenci
z zarówno delecją jak i mutację genu P53 wykazywali równieŜ niską ekspresję miR-34 [55]. Znacznie
krótszy czas przeŜycia i gorsze rokowanie obserwuje się w całej grupie chorych ze wszystkimi znanymi
anomaliami genu P53.
Delecja 17p zwykle nie pojawia się równocześnie wraz częstymi w CLL mutacjami w genie IGVH,
natomiast częściej występuje w B-CLL opornej na leczenie, predysponując do krótszego czasu
przeŜycia i agresywniejszego przebiegu choroby. Pacjenci z delecją 17p nie odpowiadają na leczenie
rituximabem i jego alternatywą moŜe być leczenie alemtuzumabem. Gorsze rokowanie mają równieŜ
pacjenci z delecją 17p w przebiegu B-PLL (B-prolymphocytic leukemia), a delecja występuje u około
połowy z nich [52]. Obecność mutacji P53 uwaŜa się obecnie za jeden z waŜniejszych, niekorzystnych
rokowniczo czynników u chorych z CLL [54].
Poziom ekspresji białka P53 w CLL zaleŜy od zaawansowania choroby, najniŜszy stwierdza się
w chwili rozpoznania (6%, 2/34 chorych), rośnie u pacjentów juŜ leczonych (19%, 4/21 pacjentów),
a najwyŜsze wartości osiąga w transformacji do zespołu Richtera (89%, 8/9 chorych) [3]. Chang i wsp.
stosując immunocytochemię, podwyŜszony poziom białka P53 zidentyfikowali u 14/110 pacjentów
z CLL (~13%) [16].
PODSUMOWANIE
Gen P53 odgrywa kluczową rolę w patomechanizmie rozrostu nowotworowego zarówno guzów
litych jak i białaczek. Delecje obejmujące gen P53, mutacje i zaburzenia ekspresji tego genu są
obserwowane we wszystkich rodzajach białaczek i zespołach mielodysplastycznych. Pojawiają się
jednak z róŜną częstotliwością w zaleŜności od rodzaju choroby i jej zaawansowania klinicznego;
najczęściej obserwowane są w CLL.
W znacznym odsetku przypadków wszystkich typów białaczek, delecji jednej kopii genu towarzyszą
mutacje punktowe homologicznego allela, co jest odpowiednikiem zjawiska utraty
heterozygotyczności - powszechnie uznanego mechanizmu działania genów supresorowych nowotworów.
We wszystkich badanych typach rozrostów krwi, częstość pojawiania się delecji jak i mutacji punktowych wzrastała wraz z rozwojem choroby, zwłaszcza we wznowie. Sugeruje się, Ŝe pojawianie się
tych zmian, moŜe mieć znaczenie prognostyczne.
Oceniane równieŜ technikami immunocytochemicznymi i cytometrią przepływową zmiany ekspresji
białka P53, pojawiają się relatywnie często i równieŜ wykazują związek z progresją choroby.
Mimo szerokiego stosowania technik FISH w praktycznej diagnostyce hematoonkologicznej, analiza
piśmiennictwa świadczy, Ŝe techniki FISH z sondami swoistymi dla genu P53 (poza CLL) stosowane
są zaskakująco rzadko, a dane uzyskane tą metodą są nieliczne i fragmentaryczne.
Poza przewlekłą białaczką limfocytową, w której zmiany genu P53 są uznanym czynnikiem
diagnostycznym i prognostycznym, w pozostałych białaczkach gen ten wciąŜ pozostaje poza zasięgiem
rutynowej diagnostyki.
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
Asai T, Liu Y, Bae N, Nimer S. The p53 Tumor Suppressor protein Regulates Hematopoietic Stem Cell Fate. J Cell Physiol. 2010; Mini review: 2215-2221.
Hainaut P, Wiman K.G. 30 years and long way into p53 research. Lancet Oncol 2009; 10: 913-919.
Cavalcanti B, Scheiner M, Magluta E, Vasconcelos F, Klumb C, Maia R.C.: p53 flow cytometry evaluation in leukemias:
correlation to factors affecting clinical outcome. Cytometry B Clin Cytom 2010; 78: 253-259.
http://www.genenames.org/data/hgnc_data.php?hgnc_id=11998.
Rola genu P53 i delecji w obszarze 17p
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
637
Kopaczewski B, Kopaczewska M. Apoptoza-podstawy molekularne patogenezy guzów mózgu. Neuroskop 2004; 6: 132135.
Matlashewski G, Pim D, Banks L, Crawford L.: Alternative splicing of human p53 transcripts. Oncogene Res. 1987; 1:
77-85.
Flaman J, Waridel F, Estreicher A, Vannier A, Limacher J, Gilbert D, Iggo R, Frebourg T. The human tumour suppressor
gene p53 is alternatively spliced in normal cells. Oncogene 1996; 12: 813-8.
http://p53.free.fr/index.html.
Petitjean A, Mathe E, Kato S. Impact of mutant p53 functional properties on TP53 mutation patterns and tumor phenotype: lessons from recent development In the IARC TP53 database. Hum Mutat 2007; 28: 622-629.
Dworakowska D. Rola białka p53, pRb, p21WAF1/CIP1, PCNA, mdm2 oraz cykliny D1 w regulacji cyklu komórkowego
oraz apoptozy. Onkol. Pol.2005; 4: 223-228.
Gefen N, Binder V, Zaliova M, Linka Y, Morrow M, Novosel A. Has-mir-125b-2 is highly expressed in childhood
ETV6/RUNX1 (TEL/AML1) leukemias and confers survival advantage to growth inhibitory signals independent of p53.
Leukemia 2010; 24: 89-96.
Talwalkar S, Yin C, Rizwan C, Hicks J, Strong L, Abruzzo L. Myelodysplastic syndromes arising in patients with germline TP53 mutation and Li-Fraumeni syndrome. Arch Pathol Lab Med 2010; 134: 1010-1015.
Chang H, Jiang A, Connie X. Aberrant nuclear p53 expression predicts hemizygous 17p (TP53) deletion
in chronic lymphocytic leukemia. An J Clin Pathol 2010; 133: 70-74.
Akala O, Park I, Qian D, Pihalja M, Becker M, Clarke M. Long-term haematopoietic reconstitution by Trp53-/-p16Ink4a/-p19Arf-/- multipotent progenitors. Nature 2008; 453: 228-232.
Wattel E, Preudhomme C, Hecquest B, Vanrumbeka M, Quesnel B, Dervite I. p53 mutations are associated with resistance to chemotherapy and short survival in hematologic malignancies. Blood 1994; 84: 3148-3157.
Tornaletti S., Pfeifer G.P.: Complete and tissue-independent methylation of CpG sites in the p53 gene: implications for
mutations in human cancer. Oncogene 1995; 10: 1493-1499.
Pui C, Carroll A, Raimondi S, Schell M, Head D, Shuster J. Isochromosomes in childhood acute lymphoblastic leukemia:
a collaborative study of 83 cases. Blood 1992; 79: 2384-91.
Imamura J, Miyoshi I, Koeffler P. p53 in hematologic malignancies. Blood 1994; 8: 2412-2421.
Gump J., McGavran L., Wei Q., Hunger S.: analysis of TP53 mutations in relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia. J Pediatr Hematol Oncol 2001; 23: 416-419.
Kawamura M., Ohnishi H., Guo S., Sheng X., Minegishi M., Hanada R.: Alterations of the p53, p21, p16, p15 and RAS
genes in childhood T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leuk Res. 1999; 23: 115-26.
Marks D., Kurz B., Link M., Jonathan E., Shuster J.: High incidence of potential p53 inactivation in poor outcome childhood acute lyphoblastic leukemia at diagnosis. Blood 1996; 87: 1155-1161.
Lam V, McPherson P, Salmena L, Lees J, Chu W, Sexsmith E. p53 gene status and chemosensitivity of childhood acute
lymphoblastic leukemia cells to adriamycin. Leuk Res 1999; 23: 871-880.
Krieger D, Moericke A, Oschlies I, Zimmermann M, Schrappe M, Reiter A. Frequency and clinical relevance of DNA
microsatellite alterations of the CDKN2A/B, ATM and p53 gene loci: a comparison between pediatric precursor T-cell
lymphoblastic lymphoma and T-cell lymphoblastic leukemia. Haematologica 2010; 95: 158-162.
Smock K, Nelson M, Tripp S, Sanger W, Abromowitch M, Cairo M, Perkins S. Characterization of childhood precursor of
T-lymphoblastic lymphoma by immunophenotypic and fluorescent in situ hybridization: a report from the Children’s Oncology Group. Pediatr Blood Cancer 2008; 51: 489-494.
Do T, Ucisik- Akkaya E, Davis C, Morrison B, Dorak M. TP53 R72P and MDM2 SNP309 polymorphisms in modification of childhood acute lymphoblastic leukemia susceptibility. Cancer Genet Cytogenet 2009; 195: 31-36.
Mertens F, Johansson B, Mitelman F. Isochromosomes in neoplasia. Genes Chromosomes Cancer 1994; 10: 221-230.
Christiansen D, Andersen M, Pedersen-Bjergaard J. Mutations with loss of heterozygosity of p53 are common in therapyrelated myelodysplasia and acute myeloid leukemia after exposure to alkylating agents and significantly associated with
deletion or loss of 5q, a complex karyotype, and a poor prognosis. J Clin Oncol 2001; 19: 1405-1413.
Van der Holt B, Breems D, Berna Baverloo H, van den Berg E, Burnett A, Sonneveld P. Various distinctive cytogenetic
abnormalities in patients with acute myeloid leukemia aged 60 years and older express adverse prognostic value: results
from a prospective clinical trial. Br J Haematol 2007; 136: 96-105.
Seifert H., Mohr B., Thiede C.: The prognostic impact of 17p (p53) deletion in 2272 adults with acute myeloid leukemia.
Leukemia 2009; 23: 656-663.
Haferlach C, Dicker F, Herholz H, Schnittger S, Kern W, Haferlach T. Mutations of the TP53 gene in acute myeloid
leukemia are strongly associated with a complex aberrant karyotype. Leukemia 2008; 22: 1539–1541.
Marques-Salles T, Mkrtchyan H, Leite E, Soares-Ventura E, Muniz M, Silva E. Complex karyotype defined by molecular
cytogenetic FISH and M-FISH in an infant with acute megakaryoblastic leukemia and neurofibromatosis. Cancer Genet
Cytogenet 2010; 200: 167-169.
Malkin D, Brown E, Zipursky A. The role of p53 in megakaryocyte differentiation and the megakaryocytic leukemias of
Down syndrome. Cancer Genet Cytogenet 2000; 116: 1-5.
638
E. STUDNIAK, S. ZAJĄCZEK
33. Cavalcanti G, Vasconcelos F, Pinto de Faria G, Scheiner M, Almeida Dobbin J, Klumb C.: Coexpression of p53 protein
and MDR functional phenotype in leukemias: the predominant association in chronic myeloid leukemia. Cytometry B
Clin Cytom 2004; 61B: 1-8.
34. Pluta A, Smolewski P, Cebula B, Jamroziak K, Wierzbowska A, Wrzesień-Kuś A. Ekspresja białek p73 i p53 w komórkach białaczkowych a całkowite przeŜycie chorych na ostrą białaczkę szpikową. Acta Haematol Pol 37: 581-591.
35. Chakraborty J, Banerjee S, Ray P, Hossain D, Bhattacharyya S, Adhikary A. Gain of cellular adaptation due to prolonged
p53 impairment leads to functional switchover from p53 to p73 during DNA damage in acute myeloid leukemia cells. J
Biol Chem 2010; 285: 33104-33112.
36. Zawacka-Pankau J., Maleńczyk K., Sznarkowska A.: Struktura i regulacja białka p73 w komórce – implikacja w terapii
przeciwnowotworowej. Postepy Hig Med Dosw 2010; 64: 78-86.
37. Haupt S, Agostino S, Mizrahi I, Alsheich-Bartok O, Voorhoeve M., Damalas A.: Promyelocytic Leukemia Protein is
Required for Gain of function by mutant p53. Cancer Res 2009; 69: 4818-4826.
38. Li Y, Guessous F, Kwon S, Kumar M, Ibidapo O, Fuller L. PTEN has tumor-promoting properties in the setting of gainof-function p53 mutations Cancer Res. 2008; 68: 1723-31.
39. Kanavaros P, Stefanaki K, Rontogianni D., Darivianaki K., Vlychou M., Papadaki E.: Immunohistochemical detection of
p53, mdm2, waf1/p21, and Ki67 proteins in bone marrow biopsies in myelodysplastic syndroms, acute myelogenous leukaemias and chronic myeloproliferative disorders. Clin Exp Pathol 1999; 47: 231-8.
40. Paydas S.: p53 protein expression in leukemias. Acta Oncol 1995; 34: 23-6.
41. Kitagawa M, Yoshida S, Kuwata T, Tanizawa T., Kamiyama R.: p53 expression in myeloid cells of myelodysplastic
syndromes. Association with evolution of overt leukemia. Am J Pathol 1994; 145: 338-44.
42. Johansson B, Mertens F, Mitelman F.: Cytogenetic deletion maps of hematologic neoplasms: circumstantial evidence for
tumor suppressor loci. Genes Chromosomes Cancer 1993; 8: 205-18.
43. Szymała K., Komarnicki M.: Zespoły mielodysplastyczne. Współcz Onkol 2003; 9: 692-701.
44. Sole F, Luno E, Sanzo C, Espinet B, Sanz G, Cervera J. Identification of novel cytogenetic markers with prognostic significance in a series of 968 patients with primary myelodysplastic syndromes. Haematologica 2005; 90: 1168-78.
45. Sugimoto K, Hirano N, Toyoshima H, Chiba S, Hiryuki M, Takaku F. Mutations of the p53 gene in myelodysplastic
syndrome (MDS) and MDS- derived leukemia. Blood 1993; 81: 3022-3026.
46. Horiike S, Kita-Sasai Y, Nakao M, Taniwaki M. Configuration of the TP53 gene as independent prognostic parameter of
myelodysplastic syndrome. Leuk Lymphoma 2003; 44: 915-922.
47. Pedersen- Bjergaard J, Andersen M.K, Andersen M.T, Christiansen D. Genetics of therapy-related myelodysplasia and
acute myeloid leukemia. Leukemia 2008; 22: 240-248.
48. Papaggeli P, Kortsaris A, Matsouka P. Aberrant methylation of c-myc and c-fos protooncogenes and p53 tumor suppressor gene in myelodysplastic syndromes and acute non-lymphocytic leukemia. J BUON 2003; 8: 341-50.
49. Brynes R, Wilson C, Kim A, McCourty A. Expression of p53, MDM2, p21waf1, bcl-2, and retinoblastoma gene proteins
in myelodysplastic syndrome after autologous bone marrow transplantation for lymphoma. Mod Pathol 1997; 10: 1120-7.
50. Lanza F, Bi S. Role of p53 in leukemogenesis of chronic myeloid leukemia. Stem Cells 1995; 13: 445-452.
51. Döhner H, Stilgenbauer S, Benner A, Leupolt E, Kröber A, Bullinger L. Genomic aberration and survival in chronic
lymphocytic leukemia. N Engl J Med 2000; 343: 1910-1916.
52. Xu W, Li J, Pan L, Qiu H, Shen Y, Li L. Interphase fluorescence in situ hybridization detection of cytogenetic abnormalities in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Int J Hematol 2007; 85: 430-6.
53. Malcikova J, Smardova J, Rocnova L, Tichy B, Kuglik P, Vranova V. Monoallelic and biallelic inactivation of TP53 gene
in chronic lymphocytic leukemia: selection, impact on survival, and response to DNA damage. Blood 2009; 114: 53075314.
54. Dicker F, Herholz H, Schnittger S, Nakao A, Patten N, Wu L. The detection of TP53 mutations in chronic lymphocytic
leukemia independently predicts rapid disease progression and is highly correlated with a complex aberrant karyotype.
Leukemia 2009; 23: 117-24.
55. Zenz T, Häbe S., Denzel T, Mohr J, Winkler D, Bühler A, Sarno A. Detailed analysis of p53 pathway defects in fludarabine-refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL):dissecting the contribution of 17p deletion, TP53 mutation, p53-p21
dysfunction, and miR34a in a prospective clinical trial. Blood 2009; 114: 2589-97.
Praca wpłynęła do Redakcji 05.03.2011 r. i została zakwalifikowana do druku 22.09.2011 r.
Adres Autora:
Ewa Studniak
Samodzielna Pracownia Cytogenetyki PUM
Ul. Połabska 4
70-115 Szczecin
Tel. 91-466-15-45
e-mail: [email protected]