Ćwiczenie 5 Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS

Ćwiczenie 5
Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) oczyszczonego
białka
Przed ćwiczeniem proszę zapoznać się z następującymi zagadnieniami:
-
elektroforeza białek w warunkach denaturujących (SDS-PAGE);
-
metody barwienia żeli elektroforetycznych.
A. SDS-PAGE
1. Przygotować aparat do elektroforezy (Mini-Protean 3 Cell, Bio-Rad)
2. Przygotować roztwór 15% żelu rozdzielającego:
H20
2.35 ml
1.5 M Tris-HCl pH 8.8
2.50 ml
10% SDS
0.10 ml
30% akrylamid/bisakrylamid
5.00 ml
10% nadsiarczan amonu (APS)
0.05 ml
TEMED
0.005 ml
APS i TEMED dodać bezpośrednio przed wylaniem żelu.
3. Na żel nawarstwić ok. 1 ml wody na płytkę i pozostawić do polimeryzacji na ok.
40-45 min.
4. W trakcie polimeryzacji żelu rozdzielającego przygotować roztwór 4% żelu
zagęszczającego:
H20
3.10 ml
0.5 M Tris-HCl pH 6.8
1.25 ml
10% SDS
0.05 ml
30% akrylamid/bisakrylamid
0.65 ml
10% nadsiarczan amonu (APS)
0.025 ml
TEMED
0.005 ml
APS i TEMED dodać bezpośrednio przed wylaniem żelu.
Tuż przed nałożeniem żelu zagęszczającego usunąć nawarstwioną na powierzchnię żelu
rozdzielającego wodę i dokładnie osuszyć powierzchnię żelu bibułą.
5. Po wylaniu żelu zagęszczającego umieścić w nim grzebień i uzupełnić roztworem żelu
do maksymalnego wypełnienia przestrzeni między płytkami. Pozostawić na ok.
30 min. do spolimeryzowania.
6. W tym czasie przygotować próbki białkowe, mieszając je w stosunku 1:5 z buforem
obciążającym (0.5 M Tris-HCl pH 6.8, 10% glicerol, 2% SDS, 5% β-merkaptoetanol,
1
0,05% błekit bromofenolowy), a następnie wstawić do termobloku o temp. 95˚C na
5 min.
7. Płytki z gotowymi spolimeryzowanymi żelami zamontować w aparacie do
elektroforezy.
8. Aparat wypełnić buforem elektrodowym (0.192 M glicyna, 0.025 M Tris-HCl,
0.1% SDS, pH 8.3) i wyciągnąć delikatnie grzebienie spomiędzy płytek.
9. Do studzienek nałożyć po 15 µl próbek, jako marker zastosować PageRuler
Unstained Protein Ladder (5 µl) (nr kat. SM0661, Fermentas) lub oczyszczoną βlaktoglobulinę.
10. Aparat podłączyć do zasilacza, wybierając na początek napięcie 80 V (do czasu, aż
białka nie opuszczą studzienek), później 120 V (do momentu, aż białka dotrą do
granicy żeli), a następnie 180 V. Elektroforezę prowadzić do czasu, aż barwnik
(błękit bromofenolowy) dojdzie do końca płytek.
11. Po zakończeniu elektroforezy jeden z żeli będzie barwiony barwnikiem Coomassie
Brilliant Blue, a drugi przy wykorzystaniu azotanu srebra.
12. Po barwieniu zidentyfikować frakcje zawierające białko BLG B, przenieść je do
woreczka dializacyjnego (nieprzepuszczającego białek o masie cząsteczkowej ≥12
kDa) i przeprowadzić dializę względem 50 mM buforu fosforanowego pH 7.5 przez
noc z mieszaniem w 4˚C (bufor C przygotowany na ćw. 4). Ciąg dalszy oczyszczania
na ćw. 6.
B. Protokół barwienia Coomassie Brilliant Blue (na jeden żel o wymiarach
80mmx75mmx0.75mm wystarcza ok. 100 ml roztworu)
Przygotowane roztwory mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej.
ETAP
SUBSTANCJE
ILOŚĆ
CZAS
TRWANIA
1. BARWIENIE
błękit Coomassiego G-250
0.2 g/l
20 min.-1 godz.
błękitu Coomassiego R-250
2.0 g/l
40% metanol
400 ml
10% kwas octowy
125 ml (80% kwas)
dopełnić wodą do
1000 ml.
Dokładnie
wymieszać
(np.
przez noc).
2
2. OBARWIANIE
40% metanol
400 ml
30
min.-kilka
10% kwas octowy
125 ml (80% kwas)
godz.
dopełnić wodą do
1000 ml,
wymieszać.
Barwienie i odbarwianie prowadzić z energicznym wytrząsaniem.
C. Protokół barwienia srebrem (na jeden żel o wymiarach 80mmx75mmx0.75mm
wystarcza 100 ml roztworu)
Do sporządzania roztworów wykorzystywać tylko wodę z Millipore.
Roztwory sporządzać bezpośrednio przed użyciem!
ETAP
SUBSTANCJE
ILOŚĆ
1.FIX
50% metanol
12% kwas octowy
50 ml
15 ml (80% kwas)
dopełnić wodą do 100 ml,
wymieszać
formalina
25% metanol
0.029 ml
50 ml
dopełnić wodą do 200 ml
wymieszać
woda
30% metanol
6.8% octan sodu
0.02% tiosiarczan sodu
200 ml
30 ml
6.8 g
0.02 g
dopełnić wodą do 100 ml
wymieszać
formalina
woda
0.032 ml
300 ml
2. WASH
3. PRETREAT
4. RINSE
5. IMPREGNATE
6. RINSE
7. DEVELOP
0.2% azotan srebra
0.2 g
Roztwór może być
dopełnić wodą do 100 ml
schłodzony do 4°C i
wymieszać
przechowywany w
ciemności przez kilka
min. do momentu użycia.
formalina
woda
6% węglan sodu
0.0004% tiosiarczan
sodu (kryształek)
0.032 ml
200 ml
6g
0.0004 g
dopełnić wodą do 100 ml
wymieszać
formalina
0.024 ml
CZAS
TRWANIA
≥ 1 godz.
2 x 5 min.
2 x 5 min.
20 min.
3 x 20 s
20 min.
2 x 20 s
ok.5 min.
Prążki
pojawiają
się po ok. 1
min.
3
8. WASH
woda
200 ml
2 x 30 s
9. STOP
8% kwas octowy
10 ml (80% kwas)
dopełnić wodą do 100 ml
wymieszać
10 min.
Wszystkie etapy barwienia przeprowadzać z energicznym wytrząsaniem.
Wybarwione żele powinny być przechowywane w 7% kwasie octowym.
Zagadnienia do sprawozdania (sprawozdanie obejmuje materiał z ćw. 4, 5, 6):
A. Proszę zamieścić obrazy elektroforetyczne uzyskane w wyniku SDS-PAGE, opisać,
co zostało nałożone do poszczególnych studzienek oraz zaznaczyć frakcje, w których
znajduje się białko BLG B.
B. Proszę
porównać
zastosowane
na
ćwiczeniach
metody
barwienia
żeli
elektroforetycznych.
C. Proszę krótko opisać, jaka jest funkcja poniższych odczynników w SDS-PAGE:
o nadsiarczan amonu,
o bisakrylamid,
o glicerol.
D. Proszę krótko opisać, jaka jest funkcja poniższych odczynników w trakcie barwienia
żeli srebrem:
o formalina,
o azotan srebra,
o węglan sodu.
A. Szybkość migracji białka w trakcie SDS-PAGE jest odwrotnie proporcjonalna do
logarytmu z jego masy cząsteczkowej. Dlaczego białka zasadowe i glikoproteiny
wykazują odstępstwo w rozdziale elektroforetycznym od powyższej zasady?
4