Nasienie szczupaka (Esox lucius L.)

KOMUNIKATY RYBACKIE
Nr 1 (126)/2012, 7 – 10
Beata Sarosiek1, Beata I. Cejko1, S³awomir Krejszeff3, Jan Glogowski1,2,
Katarzyna Targoñska3, Dariusz Kucharczyk3, Daniel ¯arski3, Rados³aw K. Kowalski1
1
Zak³ad Biologii Gamet i Zarodka, Instytut Rozrodu Zwierz¹t i Badañ ¯ywnoœci PAN w Olsztynie
2
Katedra Ichtiologii, Uniwersytet Warmiñsko-Mazurski w Olsztynie
Katedra Rybactwa Jeziorowego i Rzecznego, Uniwersytet Warmiñsko-Mazurski w Olsztynie
3
Nasienie szczupaka (Esox lucius L.) – mo¿liwoœci
przechowywania plemników w warunkach ch³odniczych
Wstêp
¿noœci od jego biologii rozrodu oraz sk³adu jonowego pla-
W ostatnich latach liczebnoϾ szczupaka w polskich
wodach wyraŸnie siê zmniejszy³a z powodu nieracjonalnej
zmy nasienia.
W przypadku ryb, których plemniki poruszaj¹ siê
gospodarki rybackiej i k³usownictwa oraz bardzo du¿ej
krótko i maj¹ niewiele mitochondriów, nie stosuje siê
presji wêdkarskiej. Szczupak jest gatunkiem niezwykle
dodatków substratów energetycznych. Mo¿na jednak
wartoœciowym, gdy¿ jako drapie¿ca ¿ywi¹cy siê przewa-
s¹dziæ, ¿e w czasie d³ugookresowego przechowywania,
¿nie rybami ma³o cennymi przyczynia siê do poprawy
substraty takie mog³yby stanowiæ dodatkowe Ÿród³o ener-
struktury rybostanu. Rozwijaj¹ca siê w Polsce akwakultura
gii dla plemników. Nascimento i in. (2008) wykazali, ¿e gli-
wymaga
sztucznego
koliza stanowi pierwszorzêdowe Ÿród³o energii w przy-
zap³odnienia. Jedn¹ z technik stosowanych w wylêgar-
padku nasienia cz³owieka. Lahnsteiner i in. (1993) podaj¹,
niach ryb jest krótkookresowe przechowywanie nasienia
¿e glukoza jest wykorzystywana jako Ÿród³o energii pod-
w warunkach ch³odniczych, bez koniecznoœci mro¿enia
czas ruchu plemników pstr¹ga. Dlatego te¿, w niniejszej
(Kowalski i in. 2009). Metoda ta z du¿ym powodzeniem
pracy podjêto próbê zastosowania rozcieñczalników
mo¿e s³u¿yæ do przechowywania plemników w sytuacji,
z dodatkiem cukrów (glukozy i fruktozy) do krótkookreso-
gdy samice dojrzewaj¹ póŸniej ni¿ samce. Jest to metoda
wego przechowywania nasienia szczupaka.
ci¹g³ego
doskonalenia
metod
prosta, mo¿liwa do zastosowania praktycznie wszêdzie,
ponadto nie powoduje tak drastycznej utraty jakoœci nasienia jak kriokonserwacja, je¿eli czas przechowywania nie
Materia³ i metody
jest zbyt d³ugi. W literaturze znaleŸæ mo¿na opisy krótko-
W doœwiadczeniu wykorzystano nasienie pochodz¹ce
okresowego przechowywania plemników pstr¹ga têczowego (McNiven 1993, Kowalski i in. 2008), czy stynki
od szczupaków (n=5), wy³owionych z Jeziora Kortow-
(Kowalski i in. 2010).
poboru nasienia ryby przetrzymywano w basenach o tem-
skiego (Olsztyn, p³n.-wsch. Polska, fot. 1a). Do czasu
Nasienie ryb cechuje wysoka koncentracja plemni-
peraturze wody 10°C, w Katedrze Rybactwa Jeziorowego
ków, co stanowi ograniczenie w mo¿liwoœci d³ugotrwa³ego
i Rzecznego, UWM, Olsztyn. W celu pobrania nasienia ryby
przetrzymywania nasienia w warunkach obni¿onego metabolizmu (temperatura poni¿ej 4°C). Aby zmniejszyæ mo¿li-
uœpiono w roztworze Propiscinu (1 ml l-1, fot. 1b). Nasienie
woœæ grawitacyjnej sedymentacji plemników, a co za tym
idzie uszkodzeñ b³on komórkowych wywo³anych naciskiem masy plemników oraz umo¿liwiæ dostêp jak najwiêkszej liczbie komórek do tlenu, nasienie nierozcieñczone
przechowuje siê w cienkiej warstwie. Aby zwiêkszyæ objêtoœæ przechowywanego nasienia oraz wyd³u¿yæ okres jego
prze¿ywalnoœci w warunkach in vitro stosuje siê odpowiednie dla gatunku bufory immobilizuj¹ce. Maj¹ one na celu
pobrano metod¹ masa¿u pow³ok brzusznych (fot. 1c).
Pobrane nasienie (fot. 1d) przewieziono w temperaturze
+4°C do laboratorium Zak³adu Biologii Gamet i Zarodka,
PAN Olsztyn, gdzie przeprowadzono komputerow¹ analizê ruchu plemników CASA (Image House CRISMAS
Company Ltd). Analizowano nastêpuj¹ce parametry ruchu
plemników: VCL (ca³kowita prêdkoœæ plemników; μm/s),
VSL (prostoliniowoœæ ruchu plemników; μm/s), VAP (œred-
rozrzedzenie plemników oraz zniwelowanie ewentualnego
nia prêdkoœæ plemników; μm/s), LIN (liniowoœæ; %), STR
negatywnego wp³ywu takich zanieczyszczeñ nasienia jak
(kierunkowoœæ; %), WOB (wskaŸnik drgañ plemników; %),
mocz (Cabrita i in. 2008). Sk³ad buforów immobilizuj¹cych
ALH (amplituda bocznych wychyleñ g³ówki; μm), BCF
dobierany jest indywidualnie do ka¿dego gatunku, w zale-
(czêstotliwoœæ zmiany pracy witki; Hz), MOT (odsetek
1/2012
KOMUNIKATY RYBACKIE
7
Fot. 1. Szczupak od³owiony z Jeziora Kortowskiego (a), usypianie ryb (b), pobieranie nasienia szczupaka (c, d).
plemników ruchliwych; %), PRG (odsetek plemników
pogorszenie wartoœci takich parametrów jak VCL, VSL,
o ruchu postêpowym; %).
VAP, czy spadek odsetka ruchliwych plemników (MOT)
Do aktywacji ruchu plemników wykorzystano roztwór
40 mM NaHCO3, z dodatkiem 20 mM Tris i 0,5% albuminy,
z 79% do zaledwie 32% (rys. 1). Dodatek buforu immobili-
pH 8,5 (Kowalski i in. 2010). Do krótkookresowego przecho-
eksperymentalnej, gdzie mlecz rozcieñczono buforem
wywania pos³u¿y³ p³yn immobilizuj¹cy (A) o nastêpuj¹cym
sk³adzie: 130 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 40 mM KCl,
immobilizuj¹cym z dodatkiem glukozy, ruchliwoœæ plemni-
20mM Tris, 2 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2 x 6 H2O (Kobayashi
godzinach – 48%, podczas gdy w grupie kontrolnej po 96
i in. 2004). Ponadto do jednej czêœci p³ynu immobilizuj¹cego dodano 10 mM glukozê (B), do drugiej czêœci 10
godzinach nie obserwowano ju¿ ruchliwych plemników. Nie
mM fruktozê (C). Parametry ruchu oraz ca³kowity czas
pomiêdzy poszczególnymi wariantami doœwiadczalnymi, tj.
ruchu plemników analizowano w czasie „0” – bezpoœrednio
miêdzy nasieniem rozcieñczonym buforem immobili-
po pobraniu i przywiezieniu do laboratorium, po 24 oraz po
zuj¹cym bez dodatków (A) oraz buforem z dodatkiem
96 godzinach przechowywania w temperaturze +4°C.
cukrów, glukozy (B) i fruktozy (C).
zuj¹cego znacz¹co poprawi³ ¿ywotnoœæ nasienia. W grupie
ków (MOT) po 24 godzinach wynosi³a 64%, natomiast po 96
stwierdzono natomiast ró¿nic statystycznie istotnych
Wyniki opracowano w programie GraphPadPrism sto-
Ciereszko i in. (1999) stwierdzili, ¿e nierozrzedzone
suj¹c dwuczynnikow¹ analizê wariancji ANOVA. Ró¿nice
nasienie szczupaka amerykañskiego (Esox masquinongy
miêdzy poszczególnymi wariantami doœwiadczalnymi okreœlono stosuj¹c Bonferroni post-test.
Mitchill) przechowywane przez 5 h na lodzie, znacz¹co
obni¿a
swoje
parametry
ruchu
oraz
zdolnoϾ
zap³adniaj¹c¹. W naszej pracy zastosowaliœmy wybrany
Wyniki i dyskusja
w badaniach wstêpnych bufor immobilizuj¹cy, który
W przypadku nasienia szczupaka stwierdzono, ¿e rozcieñczenie buforem immobilizuj¹cym poprawia jego prze¿ycie w warunkach in vitro (Erdahl i Graham 1987). Równie¿
pozwala na przechowywanie nasienia szczupaka 4 dni, bez
i w naszych badaniach, nasienie rozrzedzone buforem
szczupaka w warunkach ch³odniczych, dalsza jego
immobilizuj¹cym zachowywa³o ruchliwoœæ znacznie d³u¿ej
poprawa wydaje siê mo¿liwa. Zastosowanie cukrów
od nasienia nierozrzedzonego. Po 24 godzinach przechowywania nasienia nierozcieñczonego stwierdzono istotne
w osi¹gniêciu tego celu okaza³o siê jednak niemo¿liwe.
8
koniecznoœci jego kriokonserwacji. Pomimo ¿e jest to
najd³u¿szy znany nam czas przechowywania nasienia
Konieczne s¹ dalsze prace zmierzaj¹ce do optymalizacji
KOMUNIKATY RYBACKIE
1/2012
250
A
B
B
B
150
A
B
B
AB
VSL (µm/s)
VCL (µm/s)
200
150
A
A
A
100
100
B
A
A
B
A
A
A
A
0 24 96
0 24 96
A B
A
50
50
0
A
0 24 96
0 24 96
A
A
200
100
B
B
B
60
AB
AB
A
50
0 24 96
0 24 96
80
A
A
B
A A
B
A A
80
20
2,5
AHL (µm/s)
2,0
0
0 24 96
40
0
40
A
A B
A
B
B
A
A A
A A
0 24 96
0 24 96
0 24 96
A
0 24 96
100
A B
A
0 24 96
WOB (%)
STR (%)
60
0 24 96
20
A
A
A
A
A B
A A
B
A A
B
60
40
20
A
0 24 96
A
1,5
0 24 96
A
15
A
A B
B
0
0 24 96
A
A
A
A
0 24 96
B
1,0
BCF (Hz)
0
A
0 24 96
80
B
A
A
0
0 24 96
LIN (%)
VAP (µm/s)
150
0 24 96
A
0 24 96
0 24 96
0 24 96
0 24 96
A
A
A
A
10
A
AB
AB
B
B
B
B
5
0,5
100
A
0 24 96
A
MOT (%)
A
0 24 96
A
B
AB
60
0 24 96
A
A
80
40
0 24 96
0
B
0 24 96 0 24 96
Czas (h)
0 24 96
B
0 24 96
kontrola
20
A
A
10
A
A
0 24 96
0 24 96
B
20
0
0 24 96
30
B
B
A
0 24 96
B
PRG (%)
0,0
0
B
A
AB
A
AB
B
A
B
C
A
0 24 96
0 24 96
0 24 96
0 24 96
Czas (h)
Rys. 1. Wp³yw rozcieñczalników na parametry ruchu plemników w trakcie krótkookresowego przechowywania. Istotne ró¿nice wartoœci pomiêdzy zastosowanymi rozcieñczalnikami oznaczono ró¿nymi literami (p< 0,01).
metody przechowywania nasienia szczupaka, w celu lep-
ników zanotowano w wariancie z dodatkiem glukozy – 46 s,
szego poznania jego fizjologii oraz opracowania doskonal-
w pozosta³ych wariantach doœwiadczalnych czas trwania
szej metody przechowywania plemników.
ruchu plemników wynosi³ ok. 40 s, podczas gdy w grupie
Ca³kowity czas ruchu plemników by³ najwy¿szy w cza-
kontrolnej nie obserwowano ju¿ ruchu. Wyniki Ziêtara i in.
sie „0”, wynosi³ 69 s (rys. 2). Po 24 godzinach inkubacji nie
(2009) wskazuj¹, ¿e dodatek glukozy poprawia ¿ywotnoœæ
stwierdzono ró¿nic miêdzy grup¹ kontroln¹ i poszczegól-
plemników suma, choæ lepsze rezultaty uzyskano stosuj¹c
nymi wariantami doœwiadczenia (54 s w grupie kontrolnej,
dodatek mleczanu. Z kolei wyniki uzyskane dla medaki
55 s, 50 s i 48 s kolejno w grupie A, B i C). Po 4 dniach prze-
wykaza³y, ¿e dodatek glukozy jako egzogennego Ÿród³a
chowywania nasienia, najd³u¿szy czas trwania ruchu plem-
energii, nie spowodowa³ wyd³u¿enia czasu ruchu plemni-
1/2012
KOMUNIKATY RYBACKIE
9
100
Czas trwania ruchu plemników (s)
A
A
A
A
80
60
A
A
A
B
B
A
B
40
kontrola
A
B
20
0
C
A
0 24 96
0 24 96
0 24 96
0 24 96
Rys. 2. Wp³yw rozcieñczalników na czas trwania ruchu plemników.
Istotne ró¿nice wartoœci pomiêdzy rozcieñczalnikami oznaczono ró¿nymi literami (p< 0,01).
ków (Yang i Tiersch 2009). Podobnie i nasze wyniki nie
potwierdzi³y skutecznoœci glukozy i fruktozy w wyd³u¿eniu
czasu przechowywania nasienia szczupaka.
Powy¿sze wyniki wskazuj¹, ¿e zastosowanie rozcieñczalnika zdecydowanie poprawia prze¿ywalnoœæ plemników
szczupaka podczas krótkookresowego przechowywania.
Bufor immobilizuj¹cy wykorzystany w niniejszym doœwiadczeniu niew¹tpliwie poprawi³ ¿ywotnoœæ plemników, jednak¿e czas, w jakim mo¿liwe jest utrzymanie 50% ruchliwych
plemników w warunkach in vitro nie jest satysfakcjonuj¹cy,
gdy porównamy go do wyników uzyskanych dla innych
gatunków (Kowalski i in. 2009). Z uwagi na to, ¿e istniej¹ ró¿nice w przemianach energetycznych plemników pomiêdzy
gatunkami (Ziêtara i in. 2009), a sk³ad buforów do przechowywania nasienia odgrywa kluczow¹ rolê, konieczne bêdzie
przeprowadzenie kolejnych eksperymentów nad krótkookresowym przechowywaniem nasienia szczupaka.
Literatura
cies. Cabrita E., Robles V., Herráez M.P. (Eds). CRC Press, Boca
Raton, pp. 93-147.
Ciereszko A., Dabrowski K., Lin F., Christ S.A., Toth G.P. 1999 – Effects of
extenders and time of storage before freezing on motility and fertilization of cryopreserved Muskellunge spermatozoa – Trans. Am. Fish.
Soc. 128: 542- 548.
Erdahl, A.W., Graham, E.F. 1987 – Fertility of teleost semen as affected by
dilution and storage in a seminal plasma-mimicking medium – Aquaculture 60: 311-321.
Kobayashi T., Fushiki S., Ueno K. 2004 – Improvement of sperm motility of
sex-reversed male rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, by incubation in high pH artificial seminal plasma – Environmental Biology of
Fishes 69: 419-425.
Kowalski R.K., Yoshida M., Yoshida K., Morisawa M., Cejko B.I., Glogowski
J. 2008 – Effect of albumin, casein and hemoglobin on short-term preservation of rainbow trout sperm – W: Resource Management. Natural, human and material for the sustainable development of aquaculture. Aquaculture Europe 2008 (Eds.) E. Kamler, K. Dabrowski, IFI,
Olsztyn: 354-355.
Kowalski R.K., Cejko B.I., Sarosiek B., Demianowicz W., Glogowski J. 2009 –
Przechowywanie nasienia ryb ³ososiowatych – przegl¹d metod i ich
praktyczne zastosowanie w wylêgarniach – W: Rozród, podchów, profilaktyka ryb ³ososiowatych i innych gatunków (Red.) Z. Zakêœ, K. Demska-Zakêœ, A. Kowalska, D. Ulikowski, Wyd. IRS, Olsztyn: 105-117.
Kowalski R.K., Hliwa P., Cejko B.I., Król J., Dietrich G.J., Stabiñski R., Ciereszko A. 2010 – Sztuczny rozród stynki (Osmerus eperlanus) z zastosowaniem nasienia przechowywanego w warunkach ch³odniczych –
W: Rozród, podchów, profilaktyka ryb rzadkich i chronionych oraz
innych gatunków (Red.) Z. Zakêœ, K. Demska-Zakêœ, A. Kowalska,
Wyd. IRS, Olsztyn: 121-129.
Lahnsteiner F., Patzner R.A., Weismann T. 1993 – Energy resources of spermatozoa of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) (Pices, teleostei) – Reproduction Nutrition Dev. 33: 349-360.
McNiven M.A., Gallant R.K., Richardson G.F. 1993 – Fresh storage of rainbow trout (Oncorchynchus mykiss) semen using a non-aqueous
medium – Aquaculture 109: 71-82.
Nascimento J.M., Shi L.Z., Tam J., Chandsawangbhuwana C., Durrant B.,
Botvinick E.L., Berns M.W. 2008 – Comparison of glycolysis and oxidative phosphorylation as energy sources for mammalian sperm
motility, using the combination of fluorescence imaging, laser tweezers, and real-time automated tracking and trapping – J. Cell Physiol
217(3): 745-751.
Yang H., Tiersch T.R. 2009 – Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes) – Theriogenology 72(3): 386-392.
Ziêtara M.S., Biegieniewska A., Rurangwa E., Œwierczyñski J., Ollevier F.,
Skorkowski E.F. 2009 – Bioenergetics of fish spermatozoa during
semen storage – Fish Physiol. Biochem. 35: 607-614.
Cabrita E., Robles V., Herráez P. 2008 – Sperm quality assessment – W:
Methods in Reproductive Aquaculture: Marine and Freshwater Spe-
Przyjêto po recenzji 03.02.2012 r.
PIKE (ESOX LUCIUS L.) SEMEN – POSSIBILITIES FOR STORING SPERM UNDER REFRIGERATED CONDITIONS
Beata Sarosiek, Beata I. Cejko, S³awomir Krejszeff, Jan Glogowski, Katarzyna Targoñska, Dariusz Kucharczyk,
Daniel ¯arski, Rados³aw K. Kowalski
ABSTRACT. One of the ways to improve methods for the artificial reproduction of fish is the possibility of storing sperm for short
periods under refrigerated conditions (+4ºC) without the necessity of freezing. In the experiment semen extenders with and without
sugars (glucose and fructose) were applied during the storage of pike semen. The analysis of sperm motility parameters indicated
that semen that had not been diluted with an immobilization buffer decreased in quality very quickly. After 24 hours of storage
significant differences were noted in parameters measured with CASA, and after the subsequent two days no motile sperm were
noted. The semen that was diluted with the immobilization buffer that included glucose retained 48% motile sperm after four days of
the experiment. The results indicate that diluting the semen with an immobilization buffer lengthens the storage period of pike semen
under refrigerated conditions.
Keywords: pike, semen, sperm, storage, CASA
10
KOMUNIKATY RYBACKIE
1/2012