streszczenie pracy

17-10-2016
Rozprawa doktorska: Optymalizacja strategii proteomicznych w analizie
materiału biologicznego w oparciu o technikę MALDI TOF/TOF MS
STRESZCZENIE
Zainteresowanie analizą proteomiczną w badaniach biologicznych i klinicznych
w oparciu o techniki spektrometrii mas nieustanie wzrasta. Wykorzystując różne platformy
analityczne, dziedzina ta zyskała szeroką akceptacje w środowisku naukowym. Jednakże,
poszczególne strategie proteomiczne wymagają standaryzacji protokołów pobrania materiału
biologicznego i jego przygotowania, optymalizacji analizy w oparciu o techniki spektrometrii
mas oraz interpretacji danych. Brak jednolitych wytycznych w przypadku analizy wybranych
materiałów biologicznych, prowadzi do dowolności metodycznej
i często braku
odtwarzalności wyników pomiędzy laboratoriami.
Celem niniejszej rozprawy doktorskiej zatytułowanej „Optymalizacja strategii
proteomicznych w analizie materiału biologicznego w oparciu o technikę MALDI TOF/TOF
MS” jest sprawdzenie metod przygotowania próbek biologicznych oraz zastosowanie
odpowiednich strategii proteomicznych w oparciu o technikę MALDI-TOF/TOF MS
(UltrafleXtreme, Bruker Daltonics). Do analiz wytypowano trzy rodzaje próbek: krew i płyn
mózgowo-rdzeniowy, jako matryce o odmiennych funkcjach biologicznych i różnej
dostępności, oraz jad pszczeli, jako złożona matryca biologiczna pochodzenia zwierzęcego..
Zaproponowano strategie proteomiczne do analizy próbek: profilowanie białkowo-peptydowe
oraz identyfikację peptydów w oparciu o strategię bottom-up z zastosowaniem elektroforezy
żelowej i techniki shotgun. Ponadto, wykorzystano różne techniki przygotowania materiału
biologicznego do badań proteomicznych, w tym ekstrakcję do fazy stałej, kombinatoryczną
bibliotekę ligandów heksapeptydów oraz ogniskowanie izoelektryczne w roztworze. Do
badań w ujęciu proteomiki klinicznej wytypowano próbki pochodzące od osób z cukrzycą
ciężarnych oraz krwawieniem podpajęczynówkowym. Zaproponowano również analizę
matrycy pochodzenia zwierzęcego na przykładzie jadu pszczelego, jako potencjalne źródło
nowych związków o właściwościach terapeutycznych.
W strategii profilowania białkowo-peptydowego osocza krwi od kobiet z cukrzycą
ciężarnych porównano trzy zestawy przygotowania próbek w oparciu o ekstrakcję do fazy
stałej. Przetestowano mikro końcówki do pipet z wypełnieniem C18 (OMIX oraz ZipTip)
oraz kulki magnetyczne w oparciu o chromatografię jonowymienną (MB-WCX). Widma MS
zostały wygenerowane w zakresie mas od 1000 do 10 000 Da w liniowym trybie dodatnio
naładowanych jonów z wykorzystaniem techniki MALDI-TOF MS. Do manualnej obróbki
widm, doboru zmiennych i klasyfikacji zbiorów danych użyto program MATLAB.
Zaproponowano interpretację widm MS pochodzących z grup o niewielkiej liczebności
próbek, od kobiet z cukrzycą ciężarnych, w oparciu o nowe bioinformatyczne podejście
z wykorzystania logiki rozmytej. Uzyskane dane zostały również przeanalizowane przy
pomocy komercyjnego programu ClinProTools oraz programu MALDIquant, STATISTICA
oraz platformy MetaboAnalyst. Dodatkowo, do pełnej charakterystyki cukrzycy ciężarnych
zastosowano łączone podejście proteomiczne i metabolomiczne w celu określenia zmian
zachodzących w tej jednostce chorobowej na poziomie proteomu i metabolomu osocza krwi.
Do analizy aminokwasów wykorzystano zestaw HPLC-ESI-QqQ-MS/MS pracujący w trybie
monitorowania reakcji wielokrotnych, co pozwoliło na oznaczenie 42 analitów w próbce
biologicznej. Badania wykazały, że sposób przygotowania próbki ma istotne znaczenie
w proteomicznej analizie profilowania białkowo-peptydowego. Widma MS, uzyskane
w wyniku analizy osocza krwi kobiet z cukrzycą ciężarnych, przygotowane w oparciu
o ekstrakcję do fazy stałej typu ZipTip charakteryzuje najniższy współczynnik zmienności:
6.50% dla analiz wykonywanych w kolejnych dniach oraz 4.87% dla analiz wykonywanych
w ciągu tego samego dnia. Ponadto, widma te otrzymały najwyższą wartość poprawności
zakwalifikowania dla zbudowanego modelu (0.7333 DA i 0.8065 FIS) oraz czułości metody
(83.10% DA i 88.89% FIS), w porównaniu z techniką OMIX czy MB-WCX. Ponadto,
połączenie danych proteomicznych i metabolomicznych pozwoliło uzyskać model
o najwyższej
mocy
dyskryminacyjnej
zbudowany
z
następujących
metabolitów:
etanoloamina, L-cytrulina, asparagina oraz peptydów o m/z 1488.59, 4111.89 i 2913.15.
Czułość (94.44%), swoistość (84.62%), jak również ogólna poprawność klasyfikacji
(90.32%), wyznaczona w oparciu o macierz klasyfikacji post-hoc potwierdziła najwyższą
istotność dla modelu łączącego zintegrowane dane „omiczne” do identyfikacji cukrzycy
ciężarnych, w porównaniu do modeli zbudowanych wyłącznie z danych proteomicznych lub
metabolomicznych. Analiza MALDI-TOF/TOF-MS/MS pozwoliła na identyfikację białka
apolipoproteiny A-IV jako potencjalnego markera cukrzycy ciężarnych.
W proteomicznej analizie jadu pszczelego, jako matrycy pochodzenia zwierzęcego,
zaproponowano identyfikację nowych białek i peptydów o potencjalnej aktywności
terapeutycznej.
W
tym
celu,
jako
metodę
przygotowania
próbki,
wykorzystano
kombinatoryczną bibliotekę ligandów heksapeptydów (ProteoMiner) z gradientową elucją,
w wyniku, której otrzymano cztery różne frakcje jadu. Identyfikację białek i peptydów
przeprowadzono w oparciu o łączone techniki spektrometrii mas nanoLC-MALDI-TOF/TOFMS i nanoLC-ESI-MS-QTOF. W sumie wykryto 269 białek, w tym 49 pszczelich toksyn
należących do klas enzymów takich jak: esterazy, proteazy, peptydazy, hydrolazy, inhibitory
proteaz i główne białka mleczka pszczelego. Wykazano, że zastosowanie kombinatorycznej
biblioteki ligandów heksapeptydów pozwoliło zidentyfikować dodatkowo 75 białek w przy
użyciu techniki nanoLC-MALDI MS oraz 79 białek w oparciu o technikę nanoLC-ESI MS,
w porównaniu z analizą próbki pierwotnej jadu pszczelego. Dodatkowo, wykryto 5 nowych
białek o potencjalnym działaniu toksycznym, wykazujących wysoką homologię do białek
toksycznych innych gatunków z rzędu Hymenoptera.
Analizę białek w płynie mózgowo-rdzeniowym, pochodzącym od pacjenta
z krwotokiem podpajęczynówkowym oraz próby kontrolnej, zaproponowano w oparciu
o proteomiczną strategię bottom-up z uwzględnieniem elektroforezy żelowej i techniki
shotgun. Wstępnie, złożoną próbkę białkową poddano frakcjonowaniu przy wykorzystaniu
zestawu MicroRotofor, który przeprowadza rozdział białka w roztworze, według jego punktu
izoelektrycznego. Kolejno, uzyskane frakcje poddano trawieniu enzymatycznemu oraz
automatycznej analizie MS/MS, w której najbardziej intensywne sygnały m/z poddane zostały
dalszej fragmentacji. Łącznie zidentyfikowano 1664 i 2187 unikalnych peptydów, które
umożliwiły detekcję 134 i 271 białek, odpowiednio w próbie kontrolnej oraz pochodzącej od
pacjenta
z
krwotokiem
podpajęczynówkowym.
Rozpoznano
następujące
białka:
proenkephalinę A, peroksyredoksynę 6, trombospondynę 1, kwaśne białko włókienkowe oraz
α-spektrynę, jako potencjalne markery krwotoku podpajęczynówkowego, również opisywane
w dostępnym w piśmiennictwie. Do oceny efektywności rodziału złożonych próbek
biologicznych
w oparciu
o
metodę
ogniskowania
izoelektrycznego
w
roztworze,
przeprowadzono analizę intersekcji wszystkich zarejestrowanych sygnałów m/z we frakcjach
od 1 do 10. Interpretując intersekcję 45 powstałych elementów w wyniku kombinacji
dwuelementowej zauważono dużą ilość powtarzających się związków w sąsiadujących
frakcjach. Najwyższe stężenie białek stwierdzono w środkowych frakcjach, natomiast ich
stopniowe rozcieńczanie zauważono w kierunku frakcji skrajnych.
Autor: Joanna Hajduk