INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail

ZASADA POSTĘPOWANIA
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail jest sformułowany optymalnie do użycia
z zestawem Ventana ultraView SISH DNP Detection Kit, Ventana ultraView Red ISH DIG
800-4422
Detection Kit i odczynnikami pomocniczymi na automatach do barwienia firmy Ventana.
W procesie wybarwiania hybrydyzacji dualnej in situ (Dual ISH) sondy znakowanej DNP
05899826001
i DIG są współhybrydyzowane do ich odpowiednich swoistych sekwencji docelowych DNA
w jądrach komórkowych. Wykrywanie znakowanej DNP sondy HER2 probe następuje
50
najpierw przy użyciu zestawu ultraView SISH DNP Detection Kit, który zawiera
następujące dozowniki: Rabbit anti-DNP Monoclonal Antibody Multimer w roztworze, który
PRZEZNACZENIE
zawiera przeciwciało goat anti-rabbit secondary antibody sprzężone z enzymem
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail opracowano do ilościowego wykrywania
horseradish peroxidase (HRP), Silver ISH DNP Chromogen A (Silver A), Silver ISH DNP
amplifikacji za pomocą mikroskopii świetlnej genu HER2 przy użyciu dwubarwnej
Chromogen B (Silver B) i Silver ISH DNP Chromogen C (Silver C). Po inkubacji za
chromogenicznej hybrydyzacji in situ (ISH) utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie pomocą pierwszorzędowego przeciwciała Rabbit anti-DNP Antibody, a następnie
tkanki raka sutka i raka żołądka, w tym połączenia żołądkowo-jelitowego na automatach
drugorzędowego przeciwciała goat anti-rabbit HRP, które sprzęgają się, występuje reakcja
do barwienia Ventana.
hybrydyzacji in situ srebra (ang. Silver in situ Hybridization, SISH). Krótko mówiąc, reakcja
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail jest przeznaczony do wspomagania oceny jest sterowana przez sekwencyjne dodawanie odczynników Silver A (octan srebra),
pacjentów z rakiem sutka i rakiem żołądka, u których rozważane jest leczenie preparatem Silver B (hydrochinon) i Silver C (H2O2). W rezultacie hydrochinon powoduje redukcję
HERCEPTIN (trastuzumab), i pacjentów z rakiem sutka, u których rozważane jest leczenie jonów srebra (Ag+) do atomów srebra metalicznego (Ag0). Ta reakcja jest wzmacniana
preparatem KADCYLA (trastuzumab emtansine (T-DM1)).
przez dodanie substratu HRP: nadtlenku wodoru (Silver C). Wytrącone srebro osadza się
Wynik powinien zostać zinterpretowany przez wykwalifikowanego histopatologa w połączeniu w jądrach, a pojedyncza kopia genu HER2 jest widoczna jako czarny sygnał. Rysunek 1
z badaniem histopatologicznym, odpowiednimi danymi klinicznymi i badaniami kontrolnymi.
przedstawia reakcję SISH.
Ten produkt jest przeznaczony do stosowania w diagnostyce in vitro (IVD).
Po detekcji SISH dla HER2 sonda Chromosome 17 probe znakowana DIG jest
wykrywana za pomocą zestawu ultraView Red ISH DIG Detection Kit. Zestaw ten zawiera
STRESZCZENIE I WYJAŚNIENIA
następujące dozowniki: przeciwciało mouse anti-DIG monoclonal antibody, roztwór Red
HER2/neu (HER2) jest członkiem rodziny czterech kinaz tyrozynowych receptora
ISH Multimer, który zawiera przeciwciało goat anti-mouse IgG antibody sprzężone
śródbłonowego, które wpływają na wzrost, różnicowanie i przeżycie komórek1,2. Gen
z enzymem Alkaline Phosphatase (AP), pH Enhancer, Naphthol i Fast Red. Po wywołaniu
HER2 koduje białko HER22,3 i nadekspresja białka HER2, amplifikacja genu HER2 lub
sygnału SISH slajd jest inkubowany z mysimi przeciwciałami anty-DIG, które wiążą się
jedno i drugie występuje u około od 15 do 25 procent przypadków raka sutka oraz wiąże
z haptenem DIG w sondzie Chromosome 17 probe. Przeciwciało anti-hapten primary
się z agresywnym zachowaniem guza4,5. INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail
antibody jest wykrywane za pomocą roztworu Multimer (przeciwciało goat anti-mouse IgG
zawiera sondę HER2 probe (znakowaną haptenem dinitrofenylowym lub DNP) i sondę
conjugated z enzymem AP). Preparat inkubuje się z roztworem pH Enhancer,
Chromosome 17 probe (znakowaną haptenem digoksygeniną lub DIG) formułowane
zapewniającym odpowiednie sole we właściwych stężeniach oraz buforowane pH dla
z ludzkim DNA blokowania łożyskowego w buforze na bazie formamidu. Sondy
optymalnej wydajności enzymu AP. Następnie stosowany jest fosforan naftolu służący
opracowano w celu wykrywania amplifikacji genu HER2 w nowotworach sutka i żołądka.
jako substrat dla enzymu AP (AP defosforyluje naftol). Fast Red dodawany dalej do
HER2 DNA probe obejmuje w przybliżeniu 200 000 par zasad w obszarze genomicznym
preparatu łączy się z defosforylatyzowanym naftolem, tworząc czerwony osad, który jest
zawierającym gen HER2 (znany także jako ERBB2 i NEU), który mieści się na ludzkim
łatwo wizualizowany w mikroskopii optycznej. Rysunek 2 przedstawia reakcję Red ISH.
Chromosome 17 (17q11.2-q21). Sonda Chromosome 17 probe obejmuje sekwencje
Następnie preparat jest wybarwiany kontrastowo za pomocą odczynników Hematoxylin II
alfa-satelitarne w obszarze centromerycznym i służy jako odniesienie dla aneusomii.
w celu interpretacji pod mikroskopem optycznym.
Numery kopii obu sond są numerowane w jądrach nowotworów, zaś wyniki są zgłaszane
jako stosunek HER2/Chromosome 17 (HER2/Chr17) w celu wyznaczenia statusu
amplifikacji HER2 (stosunek HER2/Chr17 ≥ 2,0 jest wzmacniany, natomiast stosunek
< 2,0 nie jest wzmacniany).
Black Signal
Silver A
W wielu badaniach klinicznych amplifikacja i/lub nadmierna ekspresja HER2 jest
wykazywana jako wiążąca się z słabym wynikiem klinicznym u kobiet z inwazyjnym rakiem
Silver B
sutka oraz skorelowana z wieloma negatywnymi zmiennymi prognostycznymi, łącznie
Silver C
z negatywnym statusem receptora estrogenu (ER), wysoką frakcją fazy S, przerzutem do
6,7
węzłów, zmutowanym p53 i wysokim stopniem jądrowym . W wielu badaniach pacjenci
z inwazyjnym rakiem sutka (zarówno z przerzutami do węzłów, jak i bez nich) ze statusem
amplifikacji genu HER2 ujawniali zmniejszoną ogólną przeżywalność i wyższą częstość
Rabbit anti-DNP Antibody
HRP
nawrotów1,8,9,10,11. Wyniki badań klinicznych mierzących nadmierną ekspresję białka
HER2 immunohistochemicznie były podobne do tych, które zostały uzyskane przez
Goat anti-Rabbit Antibody
amplifikację genu HER29,11,12,13. Wiedza o statusie genu HER2 i/lub białka u pacjentów
z inwazyjnym rakiem sutka umożliwia klinicystom podejmowanie bardziej świadomych
NO2
decyzji w celu poprawy opieki ogólnej nad tymi pacjentami.
DNP
Trastuzumab (HERCEPTIN) jest zhumanizowanym przeciwciałem monoklonalnym
HER2 DNA Probe
N
przeciwko domenie zewnątrzkomórkowej HER2 i okazało się być korzystne dla pacjentów
H
(DNP-labeled)
14–19
NO2
z HER2-dodatnim rakiem sutka
. Demonstracja amplifikacji genu HER2 i/lub
17q11.2-q21
nadmiernej ekspresji białka jest zasadnicza dla wyboru pacjentów do terapii lekiem
trastuzumab. Badania kliniczne wykazują, że pacjenci z rakiem sutka o wysokiej
nadmiernej ekspresji białka HER2 i/lub amplifikacji genu przeważnie odnoszą korzyść
z leku trastuzumab20. Wyznaczenie amplifikacji genu HER2 i/lub nadmiernej ekspresji
białka jest niezbędne dla tych pacjentów z inwazyjnym rakiem sutka, dla których terapia
tym lekiem jest rozważana i klinicznie wskazana. Z leczenia preparatem HERCEPTIN
Rysunek 1. Reakcja SISH do wykrywania HER2.
może skorzystać również pewien odsetek pacjentów z rakiem żołądka wykazującym
21
amplifikację genu HER2 . Zalecana procedura wykonania odczynu, wytyczne
rozwiązywania problemów i algorytm oznaczania oznaczenia INFORM HER2 Dual ISH
DNA Probe Cocktail dotyczą zarówno materiałów z rakiem sutka, jak i materiałów z rakiem
żołądka.
2016-10-05
FT0700-415g
1 / 10
1008041PL Rev C
pH Enhancer
Naphthol
Fast Red
Red Signal
Goat anti-Mouse Antibody
AP
Mouse anti-DIG Antibody
DIG
Chromosome 17
Centromere Region
Chr17 DNA Probe
(DIG-labeled)
Rysunek 2. Reakcja Red ISH do wykrywania Chromosome 17.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
VENTANA Hematoxylin II (REF 790-2208)*
VENTANA Bluing Reagent (REF 760-2037)*
VENTANA Reaction Buffer Concentrate (10X) (REF 950-300)
VENTANA 10X SSC (REF 950-110)
VENTANA EZ Prep Concentrate (10X) (REF 950-102)
VENTANA Cell Conditioning Solution (CC2) (REF 950-123)
VENTANA ULTRA Cell Conditioning Solution (ULTRA CC2) (REF 950-223)
VENTANA LCS (Predilute) (REF 650-010)
VENTANA ULTRA LCS (Predilute) (REF 650-210)
Automat firmy VENTANA do barwienia preparatów z rodziny BenchMark
Etykiety z kodami kreskowymi
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus (VWR REF 48311-703 lub odpowiednik)
Ksylen (klasy histologicznej)
Woda dejonizowana lub destylowana
Środek do trwałego nakrywania preparatów (Permount Fisher Cat. No. SP15-500
lub odpowiednik)
22. Szkiełka nakrywkowe (o wielkości wystarczającej do pokrycia tkanki, jak np.
VWR Cat. No. 48393-60 lub odpowiednik)
23. Aparat do nakrywania szkiełkami nakrywkowymi (taki jak TissueTek SCA)
24. Naczynia lub kąpiele do barwienia
25. Zegar
26. Mikroskop świetlny
27. VENTANA HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides (REF 783-4422) może być użyty
do wykrywania i usuwania usterek – w razie potrzeby.
* Zależnie od potrzeb w konkretnym zastosowaniu.
**Kompatybilne media montażowe do tej próby, patrz Tabela 11.
Każdy etap w zautomatyzowanym protokole wybarwiania obejmuje inkubację preparatu za
pomocą określonych odczynników, gdzie wymagany jest precyzyjny czas i temperatura.
Na koniec każdego etapu inkubacji wycinki są przemywane przez automat do wybarwiania
preparatów Ventana, aby zatrzymać reakcję i usunąć materiał niezwiązany. Aby
zminimalizować efekt odparowywania ze szkiełka odczynników na bazie wody,
w automacie podczas każdego kroku na preparat nanoszony jest roztwór nakrywający.
Więcej informacji na temat działania aparatu zawiera odpowiednia Instrukcja obsługi
automatu do barwienia Ventana.
PRZECHOWYWANIE
DOSTARCZANY ODCZYNNIK
PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
Dozownik INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail zawiera odczynnik w ilości
wystarczającej na 50 testów.
Pierwszy dozownik 10 ml INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail zawiera około
12 µg/ml sondy HER2 probe znakowanej za pomocą dinitrofenylu (DNP) i 1 µg/ml sondy
Chromosome 17 probe znakowanej za pomocą digoksygeniny (DIG) sformułowanej za
pomocą ludzkiego DNA blokującego łożyskowo w buforze hybrydyzacyjnym na bazie
formamidu. Obie sondy są używane do wyznaczania statusu genu HER2 (tj. stosunku
HER2/Chr17).
Należy zapoznać się z treścią właściwej ulotki firmy VENTANA, dołączonej
do opakowania zestawu do detekcji, aby uzyskać szczegółowy opis następujących
kwestii: (1) Zasady przeprowadzania procedury, (2) Potrzebne materiały i odczynniki
niedołączone do zestawu, (3) Pobranie próbki i przygotowanie do analizy, (4) Procedury
kontroli jakości, (5) Rozwiązywanie problemów, (6) Interpretacja wyników i (7) Ogólne
ograniczenia.
MATERIAŁY WYMAGANE, ALE NIEDOSTARCZANE
FT0700-415g
Do stosowania z tą sondą nadają się rutynowo przygotowane tkanki, utrwalone
w formalinie i zatopione w parafinie, pod warunkiem stosowania automatów do barwienia
BenchMark IHC/ISH. Tkanki należy pociąć na skrawki o odpowiedniej grubości (około
4 μm) i umieścić na szkiełkach Superfrost Plus (lub odpowiednikach). Zalecanym
środkiem do utrwalania tkanek jest 10% obojętna, zbuforowana formalina (NBF)22.
Tabela 1 zawiera listę zalecanych środków utrwalających oraz środków utrwalających
niekompatybilnych z tą sondą. Z pytaniami dotyczącymi zalecanych środków
utrwalających należy zwracać się do lokalnego przedstawiciela serwisu.
Tabela 1. Zalecane i niekompatybilne środki utrwalające.
Zalecane środki utrwalające
Niekompatybilne środki utrwalające
Neutral Buffered Formalin (NBF)
Płyn Bouina
Formalina z cynkiem
Mieszanina alkoholu, kwasu octowego
i formaliny (AFA)
Alkoholowy roztwór formaliny
Utrwalacz PREFER
Razem z zestawem nie są dostarczane takie odczynniki jak zestawy detekcyjne
VENTANA i składniki pomocnicze.
Nie wszystkie produkty przedstawione w ulotce dołączonej do opakowania są dostępne
we wszystkich rejonach geograficznych. Należy skonsultować się z lokalnym
przedstawicielem odpowiedzialnym za wsparcie techniczne.
1.
VENTANA ultraView SISH DNP Detection Kit (REF 800-098)
2.
VENTANA ultraView Red ISH DIG Detection Kit (REF 800-505)
3.
VENTANA HybReady Solution (REF 780-4409)
4.
VENTANA ultraView Silver Wash II (REF 780-003 lub odpowiednik)
5.
VENTANA ISH Protease 2 (REF 780-4148)*
6.
VENTANA ISH Protease 3 (REF 780-4149)*
2016-10-05
Po otrzymaniu preparat nieużywany przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie zamrażać.
W celu zapewnienia właściwego podawania i stabilności sondy, po każdym użyciu należy
założyć zatyczkę i niezwłocznie umieścić dozownik w lodówce w pozycji pionowej.
Na każdym dozowniku sondy podana jest data ważności. Prawidłowo przechowywany
odczynnik zachowuje trwałość do daty określonej na etykiecie. Nie należy stosować
odczynnika po upływie terminu ważności.
2 / 10
Preparaty utrwalane > 6 godzin za pomocą środków utrwalających AFA lub Bouin’s
powodują słabe wybarwianie lub jego brak23. Oprócz oznaczeń Ventana najnowsze
nadania wykazały, że większość nieprawdopodobnych wyników genu HER2 wynika wg
FISH z czynników przedanalitycznych łącznie z niedostatecznym i nadmiernym
utrwaleniem24, jak też utrwaleniem opóźnionym25. Ścisłe wdrożenie procedur utrwalania
(np. procesor dedykowany w celu zapewnienia minimum 6 godzin utrwalania)
spowodowało 64% redukcję przypadków nieprawdopodobnych od 10,8% niepowodzeń do
3,4%. Preparaty utrwalane w formalinie przez czas < 6 godzin mogą prowadzić do utraty
sygnału i nadmiernego trawienia jądrowego, czego objawem jest blade/słabe barwienie
hematoksyliną.
1008041PL Rev C
Skrawki grubsze niż 4 µm mogą wymagać silniejszego traktowania proteazą niż
w warunkach zalecanych i mogą przejawiać większe pęcherzenie jądrowe niż skrawki
cieńsze ze względu na nadmiar parafiny w tkance. Pęcherzyki jądrowe mają postać
dużych lub małych pęcherzyków lub przegrody w jądrze. Często, gdy występuje
pęcherzenie jądrowe, następuje wpływ przegrody na sygnały SISH i Red ISH
charakteryzujące się 1) jądrami z pęcherzykami jądrowymi, w których sygnały SISH
i Red ISH są ogólnie nadal zlokalizowane w jądrze, oraz 2) jądrami z pęcherzami
jądrowymi, które wpychają sygnały SISH i Red ISH do obwodu. Często w obu
przypadkach, jeżeli sygnały SISH i Red ISH są wyraźnie rozróżniane i nie są w inny
sposób zniekształcone i nadal możliwe do policzenia, przypadek można ocenić punktowo.
Jednak ciężkie pęcherzenie jądrowe może zakłócać sygnały SISH i Red ISH lub sprawić,
że będą nieodróżnialne, wskutek czego nie jest możliwe dokładne policzenie. Występuje
to częściej, gdy sygnały SISH i Red ISH są wypychane do obwodu jądra. W takich
przypadkach często możliwe jest znalezienie w innym miejscu próbki jąder dających się
policzyć, a tym samym możliwe jest określenie wyniku próbki. Jeżeli pęcherzenie jądrowe
jest poważne, do takiego stopnia, że nie można znaleźć wystarczających jąder, gdzie nie
można dokładnie policzyć sygnałów SISH i Red ISH, przypadek nie powinien być
oceniany punktowo. Próbki takie mogą wymagać odparafinowania w łaźniach
ksylenowych i alkoholowych, a następnie powtórzenia odczynu w urządzeniu.
Alternatywnie użytkownik może wybrać opcję przedłużonego odparafinowania
w procedurze barwienia (patrz Rozwiązywanie problemów). Pęcherzyki jądrowe mogą
również występować w przypadku niedostatecznego utrwalenia (1–3 godziny
w formalinie), z mniej skoncentrowanym występowaniem pęcherzyków jądrowych. Można
to rozwiązać przy 3-godzinnym utrwalaniu przez zmienione warunki kondycjonowania /
obróbkę proteazą, jednak przy 1 godzinie prawdopodobnie próbki nie da się naprawić.
Oznaczenie INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail zostało przygotowane
z dodatkowymi opcjami preparatyki wstępnej, które mogą ułatwić wykonywanie oznaczenia
w różnych laboratoriach, a także rozwiązywanie problemów dotyczących konkretnych
tkanek/preparatów z suboptymalnymi wynikami barwienia. Firma Ventana zaleca
przeprowadzenie w każdym laboratorium wstępnych barwień na reprezentatywnych
próbkach tkanki kontrolnej, które zostały przygotowane w takich samych warunkach jak
preparaty kliniczne przeznaczone do testów. Pomoże to w optymalizacji określonych
warunków barwienia dla laboratorium, które może stosować różne procedury przygotowania
próbek. Możliwe jest uzyskanie zmiennych wyników przy zastosowaniu czynników przed
analizą innych niż zalecane. Preparaty przygotowywane przedanalitycznie w warunkach,
które nie są zalecane przez firmę Ventana, mogą nigdy nie wybarwić się odpowiednio
do próby.
Parametry procedur zautomatyzowanych mogą być wyświetlane, drukowane i edytowane
zgodnie z procedurą opisaną w Instrukcji obsługi automatu. Pozostałe parametry działania
automatów do barwienia zostały wstępnie zaprogramowane fabrycznie. Zalecane
procedury wybarwiania dla każdego analizatora zawiera Tabela 2. Więcej informacji na
temat procedury hybrydyzacji in situ (ISH) znajduje się w ulotce dołączonej do
opakowania odpowiedniego zestawu do detekcji firmy VENTANA.
Tabela 2. Zalecane protokoły wybarwianie dla INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe
Cocktail na automacie do wybarwiania VENTANA serii BenchMark.
OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Do stosowania w diagnostyce in vitro (IVD).
Wyłącznie do zastosowania profesjonalnego.
Ostrzeżenie, produkt zawiera formamid. Formamid jest toksyczny w przypadku
inhalacji i umiarkowanie toksyczny w przypadku połknięcia. Jest drażniący dla
skóry, oczu i błon śluzowych oraz jest wchłaniany przez skórę. Może być szkodliwy
dla płodu. Podczas pracy z odczynnikami należy zachować środki ostrożności.
W razie kontaktu z materiałami podejrzewanymi o rakotwórczość lub toksyczność
należy nosić jednorazowe rękawice i odpowiednią odzież ochronną.
Przed rozpoczęciem pomiarów w urządzeniu należy upewnić się, że pojemnik na
zlewki jest pusty. W razie zaniedbania tego środka ostrożności pojemnik na zlewki
może przepełnić się, stwarzając dla użytkownika ryzyko poślizgnięcia się i upadku.
Materiały pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego należy traktować jak materiały
potencjalnie niebezpieczne biologicznie i utylizować z zachowaniem właściwych
środków ostrożności.
Unikać kontaktu odczynników z oczami, skórą i błonami śluzowymi. W przypadku
kontaktu odczynników z wrażliwymi miejscami spłukiwać obfitą ilością wody. Unikać
wdychania odczynników.
Unikać skażenia mikrobiologicznego odczynników, ponieważ w takim przypadku
można uzyskać nieprawidłowe wyniki.
Aby uzyskać informacje na temat zalecanej metody pozbywania się produktu,
należy skontaktować się z władzami lokalnymi i/lub wojewódzkimi.
Dodatkowe informacje na temat bezpieczeństwa można znaleźć w Karcie
charakterystyki produktu oraz w Przewodniku po symbolach i zwrotach dotyczących
zagrożeń na stronie www.ventana.com.
PROCEDURA BARWIENIA
Sondy firmy VENTANA zostały przygotowane do stosowania w automatach do barwienia
preparatów firmy VENTANA, razem z zestawami detekcyjnymi i akcesoriami firmy VENTANA.
2016-10-05
FT0700-415g
3 / 10
Wybierany etap
procedury
Zalecany protokół wybarwiania
dla BenchMark i BenchMark XT
Zalecany protokół
wybarwiania dla BenchMark
ULTRA
Temperatura suszenia
Nie dotyczy
Wybierz 63ºC
Czas suszenia
Nie dotyczy
20 min
Odparafinowanie
Wybrana
Wybierz 72ºC
Extended Depar*
Nie wybrano
Nie wybrano
Cell Conditioning
Wybrana
Cell Conditioning CC2
Łagodne CC2 – 8 min
Standard CC2 – 12 min
Przedłużone CC2 – 8 min
Wybrana
Cell Conditioning CC2
86ºC
Łagodne CC2 – 8 min
Standard CC2 – 12 min
Przedłużone CC2 – 8 min
ISH-Protease 3
16 min (tkanka)
8 min (Xenografts)
16 min (tkanka)
8 min (Xenografts)
Denaturacja
20 min
20 min
Hybrydyzacja
6 godzin
6 godzin
Głębokie płukanie
72°C (tkanka ludzka)
76°C (Xenografts)
72°C (tkanka ludzka)
76°C (Xenografts)
SISH Multimer
16 min
32 min
Silver Chromogen
4 min
4 min
Red ISH Multimer
24 min
24 min
Red Chromogen
8 min
8 min
Hematoxylin II – 8 min
Hematoxylin II – 8 min
Bluing Reagent – 4 min
Bluing Reagent – 4 min
Barwienie
kontrastowe
Po barwieniu
kontrastowym
* Opcja wydłużonego odparafinowania ma służyć do złagodzenia objawów
pęcherzyków jądrowych powstałych z powodu nadmiaru parafiny.
Ze względu na zmienność utrwalania i obróbki tkanek, a także ze względu na warunki
środowiskowe i ogólne wyposażenie laboratoryjne, konieczne może być zwiększenie lub
zmniejszenie hybrydyzacji sondy i kondycjonowania komórek lub wstępna obróbka proteazą dla
poszczególnych próbek, w zależności od zastosowanej metody detekcji i preferencji badacza.
Uruchamianie serii odczynów na automatach BenchMark Series
Automated Slide Stainers
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Nałożyć etykietę z kodem kreskowym odpowiadającym protokołowi detekcji, który
ma być przeprowadzony. Wyśrodkować etykietę preparatu bez wystawania. Unikać
podwójnego etykietowania lub ponownego nakładania etykiety. Należy zastosować
wyraźne nałożenie z etykietami przebiegu pracy VENTANA VANTAGE.
Załadować INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, odczynniki z ultraView
ISH DIG i ultraView SISH DNP Detection Kits oraz wymagane odczynniki
pomocnicze do tacki (tacek). Umieścić tacę (tace) w automacie do barwienia
preparatów. Sprawdzić płyny i zbiornik na zlewki.
Butelki z buforem reakcyjnym muszą być pełne.
Pojemnik na zlewki musi być opróżniony przed rozpoczęciem pomiaru.
Załadować preparaty do automatu do barwienia.
Rozpocząć barwienie.
Po zakończeniu barwienia wyjąć preparaty z automatu.
Przejść do procedury odwadniania.
1008041PL Rev C
INTERPRETACJA WYNIKÓW
Procedura odwadniania
Przed przystąpieniem do interpretacji właściwych wyników kontrole powinny zostać
zweryfikowane przez wykwalifikowanego specjalistę z doświadczeniem w mikroskopowej
interpretacji próbek patologii anatomicznych, procedurach ISH i rozpoznawaniu genu
HER2 oraz jego amplifikacji (co wymaga badania mikroskopowego z zastosowaniem
obiektywów 20X, 40X i/lub 60X).
Uwaga: Nie zaleca się stosowania obiektywu 100X. Wszystkie weryfikacje projektu i testy
walidacyjne przeprowadzono z zastosowaniem obiektywów 20X, 40X i/lub 60X.
Następujące części opisują, w jaki sposób interpretować i oceniać punktowo preparaty.
Tabela 3 pokazuje, w jaki sposób liczyć odrębne sygnały.
Definicje
1.
Status genu HER2. Status genu HER2 to odwzorowanie stosunku średniej liczby
kopii genu HER2 do średniej liczby kopii Chromosome 17 (Chr17), na komórkę,
w inwazyjnym raku sutka lub żołądka. Status genu HER2 jest klasyfikowany przy
wykorzystaniu poniższych wytycznych:
a.
Stosunek HER2/Chr17 ≥ 2,0 oznacza amplifikację
b.
Stosunek HER2/Chr17 < 2,0 oznacza brak amplifikacji
PROCEDURY KONTROLI JAKOŚCI
2.
Właściwe przygotowanie preparatu. Aby możliwe było zliczanie na danym
preparacie barwionym odczynnikiem INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail,
Próbka kontroli dodatniej
musi on spełniać dwa kryteria; jeśli preparat nie spełnia kryteriów, zliczanie nie jest
Sekwencje HER2 i Chromosome 17 występują we wszystkich komórkach ludzkiego ciała.
możliwe, a wynik będzie niezadowalający.
Tym samym pełnią one funkcję pozytywnej kontroli dodatniej w każdej próbce tkanki
a.
Wewnętrzna kontrola dodatnia. Normalne sygnały HER2 (SISH) lub Chr17
i muszą być widoczne (1 do 2 sygnałów na komórkę) w komórkach prawidłowych
(Red ISH) (1 do 2 kopii na komórkę) działają jako wewnętrzne kontrole
(nienowotworowych) w rejonie docelowego nowotworu i wokół niego. Jednak ze względu
dodatnie i muszą być widoczne w próbce. Odczyn jądrowy może wystąpić
na heterogeniczność biologiczną i wycinek tkanki nie wszystkie komórki wykazują jedną
między innymi w następujących komórkach nienowotworowych: fibroblasty
kopię genu. Swoisty odczyn jądrowy może wystąpić między innymi w następujących
podścieliska, komórki śródbłonka, limfocyty i inne komórki nienowotworowe.
typach komórek: fibroblasty podścieliska, komórki śródbłonka, limfocyty i komórki
Nie wszystkie komórki w preparacie wybarwią się dla obu sond, jednak
nienowotworowe. Jeżeli kontrole dodatnie nie wykażą dodatniego barwienia, może to
komórki prawidłowe w celu i/lub wokół niego muszą być właściwie
wskazywać na problem z odczynnikiem lub aparatem. Ponieważ każda próbka ma
wybarwione.
wewnętrzną kontrolę dodatnią (tj. odpowiednie barwienie SISH w komórkach
b.
Komórki nowotworowe. Przy zastosowaniu obiektywów 20X, 40X i/lub 60X
prawidłowych), działa to jako prawdziwa „kontrola dodatnia”.
komórki docelowe raka muszą wykazywać sygnały SISH i Red ISH, które
Każda wykonywana procedura barwienia może w razie potrzeby uwzględniać badanie
można policzyć.
swoistych dla laboratorium dodatnich preparatów kontrolnych. Próbkami kontrolnymi mogą
3.
Obszary docelowe i zliczanie sygnałów. W obrębie akceptowalnego obszaru
być próbki przygotowane w identyczny sposób jak próbki pochodzące od pacjenta.
docelowego w komórkach inwazyjnego raka muszą być widoczne sygnały SISH
Kontrole takie są przydatne do monitorowania wszystkich etapów procedury, od
i Red ISH, które można policzyć. Zliczania sygnałów nie należy przeprowadzać
przygotowania do barwienia.
w obszarach, które zawierają słaby sygnał SISH i/lub Red ISH , w ściśniętych lub
Próbka ksenograftowa
nachodzących na siebie jądrach ani w obszarach martwicy. Nie należy zliczać jąder
HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides są stosowane do walidacji pierwotnej i czynności
z nadmiernym tłem SISH lub Red ISH, interferującym z możliwością zliczania
związanych z wykrywaniem usterek dotyczących INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe
swoistych sygnałów. Jeżeli jeden z obszarów docelowych jest uznany za
Cocktail. Zawierają one trzy odrębne skrawki ksenograftowe utrwalone w formalinie
nieadekwatny do zliczania, często możliwe jest odnalezienie w tym samym
i zatopione w jednym bloczku parafinowym. Skrawki ksenograftowe zostały wybrane ze
preparacie innych obszarów docelowych, które są adekwatne. Można to określić
względu na dobre scharakteryzowanie w literaturze pod względem poziomu białek HER2
poprzez obecność w obszarze docelowym lub w jego sąsiedztwie prawidłowych
oraz liczby kopii genu.
komórek wykazujących odpowiednie barwienie SISH lub Red ISH.
Odczynnik do kontroli dodatniej
Dodatkowe spostrzeżenia dotyczące HER2 i Chromosome 17
Do weryfikacji testu i przy rozwiązywaniu problemów powinien być używany odczynnik do
Inne obserwacje można zanotować jako komentarze na raporcie patologa.
kontroli dodatniej, ponieważ dostępność DNA może zależeć od metody utrwalania
1.
Heterogeniczność: W niektórych przypadkach tkanka może zawierać obszary objęte
i sposobu obróbki wstępnej preparatu. INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail
rakiem, które są heterogeniczne pod względem liczby kopii HER2 (tj. mogą
może być użyty jako kontrola pozytywna dla tej próby, ponieważ każda prawidłowa
zawierać jądra, w których doszło do amplifikacji, oraz takie, w których amplifikacja
komórka organizmu ludzkiego zawiera od jednej do dwóch kopii HER2 i Chromosome 17.
nie wystąpiła; lub mogą zawierać jądra, w których doszło do amplifikacji, ale
Odczynnik do kontroli ujemnej nie jest wymagany, ponieważ wystarczające są
zawierające różne kopie genu HER2). Może to być widoczne w obszarze
wewnętrzne kontrole dodatnie.
docelowym raka lub przy porównaniu różnych obszarów docelowych.
Niewyjaśnione rozbieżności
2.
Aneusomia to stan, w którym w organizmie znajduje się więcej lub mniej kopii
Niewyjaśnione rozbieżności w wynikach kontroli należy niezwłocznie zgłaszać do lokalnego
określonych chromosomów, tj. liczba kopii określonego chromosomu (w tym
przedstawiciela serwisu. Jeśli wyniki kontroli jakości nie są zgodne ze specyfikacją, wyniki
przypadku Chromosome 17) nie wynosi dwa. W polisomii występują trzy lub więcej
uzyskane dla próbek pochodzących od pacjentów są nieważne. Zob. sekcja Rozwiązywanie
kopie chromosomu zamiast oczekiwanych dwóch. W monosomii komórki guza
problemów w niniejszej ulotce. Należy zidentyfikować i wyeliminować problem, a następnie
mogą wykazywać tylko jedną kopię Chromosome 17. Zgłaszano pozorną
powtórzyć badanie próbek pochodzących od pacjenta.
„amplifikację” – skupiska lub polisomię Chromosome 17 (wraz ze skupiskami HER2
Weryfikacja oznaczenia
SISH lub bez nich)26. W przypadkach występowania skupisk HER2 i Chromosome
17 należy zachować ostrożność, by nie uznać ich za stosunek ~1,0. W takich
Przed pierwszym użyciem odczynnika w procedurze diagnostycznej należy zweryfikować
przypadkach osoba odczytująca powinna zapoznać się z analizami nadmiernej
jego działanie w drodze testów na szeregu preparatów kontrolnych o znanej
ekspresji białek IHC dla HER2, ponieważ większość wykazuje stosunek 3+.
charakterystyce w badaniach ISH takich jak VENTANA HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft
Slides (zob. Procedury kontroli jakości opisane wcześniej w tej sekcji ulotki). Procedury
3.
Delecja jednego allelu: Delecja genu HER2 z Chromosome 17 w komórkach
kontroli jakości należy powtarzać dla każdej nowej partii odczynników lub każdorazowo po
nowotworowych daje efekt w postaci stosunku HER2/Chr17 < 1,0.
zmianie parametrów testu.
Uwaga: Chromogen Fast Red jest rozpuszczalny w alkoholu i acetonie. Nie używać do
odwadniania preparatów łaźni alkoholowych ani acetonowych, ponieważ wpłynie to na
sygnał czerwieni.
1.
Aby usunąć płynne szkiełko, opłukać preparaty w 2 zmianach łagodnego roztworu
detergentu do mycia naczyń (nie używać detergentów przeznaczonych do
zmywarek automatycznych).
2.
Dokładnie przepłukać preparaty wodą destylowaną. Płukać przez około 1 minutę.
Strząsnąć nadmiar wody.
3.
Umieścić preparaty w suszarce (45–60°C) do wysuszenia lub wysuszyć na
powietrzu w temperaturze pokojowej. Czas suszenia w suszarce waha się od
10 minut do godziny. Zadbać o to, by preparaty były całkowicie suche przed
przykryciem szkiełkiem.
4.
Przenieść preparaty do kąpieli ksylenowej na około 30 sekund.
5.
Umieścić szkiełka nakrywkowe na preparatach. Zwrócić uwagę, że niektóre środki
do zatapiania preparatów nie są zgodne z oznaczeniem (patrz sekcje Ograniczenia
i Rozwiązywanie problemów).
2016-10-05
FT0700-415g
4 / 10
1008041PL Rev C
Tabela 3. Wizualizacja sygnału dla INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail.
Wizualizacja sygnałów i adekwatność preparatu
Sygnały SISH i Red ISH są wizualizowane jako:
1.
Pojedyncza kopia. Wyodrębniony pojedynczy czarny (SISH) lub czerwony (Red
ISH) sygnał jest zliczany odpowiednio jako jedna kopia genu HER2 lub Chr17.
Nie liczyć, jeśli jądra się nakładają.
Wyodrębnione pojedyncze sygnały SISH (czarne) zobrazowane w jądrze preparatu
wewnętrznej, fizjologicznej kontroli dodatniej (nie nowotworowym), odzwierciedlają
rozmiar pojedynczej kopii w komórkach raka inwazyjnego. Dla sygnałów Red ISH
każdy oddzielny sygnał jest zliczany jako jedna kopia. Należy zwrócić uwagę, że
sygnał Red ISH z sondy DIG Chromosome 17 probe mogą być większe niż sygnały
Nie liczyć, jeżeli nie ma sygnału.
SISH, a niekiedy mogą mieć wydłużony kształt i mogą mieć różny rozmiar w ramach
obszaru docelowego i próbki. Sygnały SISH mogą wydawać się znacząco mniejsze
niż sygnały Red ISH. Nie ma jednak ograniczenia minimalnej wielkości sygnału
i należy zliczyć wszystkie wyodrębnione sygnały. Możliwe jest wystąpienie plamki
SISH lub czerwonej mgiełki, czego nie należy pomylić z sygnałem. Czerwone
Nie liczyć, jeśli obecny jest sygnał tylko jednego koloru.
sygnały o bardzo jasnej barwie w porównaniu z jądrami wewnętrznej kontroli
dodatniej oraz ogólny wzór wybarwienia nie powinny być zliczane, gdyż są
nieswoiste. Zalecenia w przypadku zaobserwowania plamki SISH, patrz część
Rozwiązywanie problemów.
Nie liczyć, jeśli sygnały występują poza jądrem.
2.
Wiele kopii. Wyodrębnione pojedyncze sygnały SISH w jądrach wewnętrznej
kontroli dodatniej reprezentują rozmiar pojedynczej kopii HER2 w komórkach raka
inwazyjnego. Rozmiar pojedynczych sygnałów SISH jest używany w charakterze
wartości odniesienia w celu określenia amplifikowanych kopii w jądrach komórek
nowotworowych. W przypadku Red ISH każdy oddzielny sygnał jest zliczany jako
Zliczyć jako 1 sygnał czarny (HER2) i 1 sygnał czerwony (Chr17).
jedna kopia.
3.
Skupiska. Skupisko jest definiowane jako liczne, nakładające się sygnały SISH
w jądrach, których nie da się dostrzec indywidualnie. Skupiska HER2 mogą być
wyłącznie ocenione przez osobą odczytującą. Przykładowo duże skupisko sygnałów
SISH można ocenić na 12 kopii, natomiast skupiska mniejsze – na 6 kopii. Ocena
Zliczyć jako 2 sygnały czarne (HER2) i 2 sygnały czerwone (Chr17).
jest dokonywana za pomocą pojedynczych kopii SISH obecnych w komórkach
wewnętrznej kontroli dodatniej jako odniesieniu. Obecność skupisk HER2 notuje się
na arkuszu wyników.
Zliczać jako 1 sygnał czarny (HER2) i 2 czerwone (Chr17). Czarny
4.
Nie należy zliczać jąder nakładających się, jąder, w których występuje tylko jeden
sygnał to „dublet”. Dwa sygnały sąsiednie tego samego koloru
zliczać tylko wtedy, jeżeli odległość między nimi jest równa lub
kolor, i próbek z odczynem nieswoistym. Jądra z nakładającymi się sygnałami Red
większa niż średnica sygnału pojedynczego.
ISH i SISH, których nie da się dostrzec, powinny być wizualizowane przy większym
powiększeniu w celu rozróżnienia, czy te dwa sygnały powinny być zliczane czy nie.
Małe skupiska SISH można ocenić tylko przez użycie rozmiaru
Jądra, w których występują pęcherzyki mające istotny wpływ na interpretację
pojedynczego sygnału jako odniesienia; użyć komórki zrębowej
sygnału, nie powinny być zliczane.
oceny rozmiaru sygnału (mała komórka po lewej). Przykładowo to
skupisko można ocenić jako 6 sygnałów SISH – dodanie 2 innych,
Zliczanie sygnałów SISH i Red ISH w celu wyznaczenia statusu genu HER2
pojedynczych sygnałów daje łączną liczbę zliczeń 8. Zliczać jako
Przed zliczaniem sygnałów HER2 i Chromosome 17 do wyznaczenia statusu genu HER2
2 czerwone sygnały. Na arkuszu wyników zapisać obecność
kluczowe znaczenie ma ustalenie, czy inwazyjny obszar docelowy (tkanka ze zmianą)
skupisk dla HER2.
jest odpowiednio wybarwiony i spełnia kryteria opisane dla właściwego przygotowania
Ocena dużego skupiska. Tutaj skupisko można oszacować jako
preparatu (patrz część Definicje powyżej, 2. Właściwe przygotowanie preparatu).
12 czarnych sygnałów; dodanie pozostałych 4 pojedynczych
Firma Ventana opracowała algorytm zliczania dla testu, który maksymalizuje precyzję
sygnałów daje całkowitą liczbę 16. Liczyć czerwone sygnały jako
i skuteczność zliczania. Należy policzyć dwadzieścia jąder, każde zawierające sygnały
2 kopie Chromosome 17. Na arkuszu wyników zapisać obecność
czerwone (Red ISH) i czarne (SISH). Końcowe wyniki dla statusu HER2 są zgłaszane na
skupisk dla HER2.
podstawie stosunku uzyskanego przez podzielenie sumy sygnałów HER2 dla wszystkich
Czerwony sygnał w pobliżu czarnego powinien być liczony jako
20 jąder przez sumę sygnałów Chromosome 17 dla wszystkich 20 jąder. Status
jeden czerwony i jeden czarny. W celu rozpoznania może być
amplifikacji jest definiowany jako Amplifikacja, jeżeli stosunek HER2/Chr17 jest ≥ 2,0
konieczne zliczanie pod obiektywem 60x. Dlatego liczyć jako
i Brak amplifikacji, jeżeli stosunek HER2/Chr17 < 2,0. Jeżeli stosunek HER2/Chr17
4 sygnały czarne i 2 czerwone. Jeżeli sygnałów nakładających się
wypada między 1,8 i 2,2 (włącznie), należy policzyć dodatkowe 20 jąder. Następnie należy
nie można rozróżnić, nie liczyć tego jądra.
utworzyć nowy stosunek na podstawie 40 jąder i zgłosić status amplifikacji zgodnie z już
Skupisko czarnych sygnałów zasłaniających czerwony(-e) sygnał(y).
przedstawionym opisem.
Można wykorzystać większe powiększenie (60x) w celu potwierdzenia
Kryteria wyboru komórek
obecności lub nieobecności czerwonego(-ych) sygnału(-ów);
Należy zliczać wyłącznie jądra o średnicach reprezentatywnych na tle jąder w komórkach
w przeciwnym razie nie liczyć: zawsze zliczać jądra z wyraźnymi
czerwonymi sygnałami. Obecność skupisk SISH notuje się na
raka inwazyjnego w obszarze docelowym. Nie należy zliczać sygnałów w jądrach, których:
arkuszu wyników. Jądra o widocznych czerwonych sygnałach
1.
Średnica jest znacznie większa niż przeciętna średnica jąder komórek
i w większej liczbie należy zliczać w jądrach o skupiskach SISH.
nowotworowych
2.
Średnica jest znacznie mniejsza niż przeciętna średnica jąder komórek
Jeżeli występuje „pył” SISH w tle jądra, zliczać tylko wtedy,
gdy swoiste sygnały SISH są wyraźnie odróżnialne od tła.
nowotworowych
W obszarach docelowych, które są heterogeniczne pod względem liczby kopii HER2,
należy zliczać wyłącznie te jądra, które są reprezentatywne dla populacji komórek raka
inwazyjnego z najwyższą średnią liczbą sygnałów. W arkuszu wyników należy zapisać
Może wystąpić czerwone zamglenie i nie należy go mylić
występowanie heterogeniczności.
z sygnałem. Czerwony sygnał może mieć różne natężenie,
ale zawsze jest wyodrębniony. Rysunek przedstawia 2 odrębne
sygnały czerwone (Chr17) i 2 czarne (HER2).
2016-10-05
FT0700-415g
5 / 10
1008041PL Rev C
Status genu HER2: Algorytm zliczania dla HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail
Należy policzyć dwadzieścia jąder, każde zawierające sygnały czerwone (Chr17) i czarne
(HER2). Końcowe wyniki dla statusu HER2 są zgłaszane na podstawie stosunku
uzyskanego przez podzielenie sumy sygnałów HER2 dla wszystkich 20 jąder przez sumę
sygnałów Chromosome 17 dla wszystkich 20 jąder. Status amplifikacji jest definiowany
jako Amplifikacja, jeżeli stosunek HER2/Chr17 jest ≥ 2,0 i Brak amplifikacji, jeżeli
stosunek HER2/Chr17 < 2,0. Jeżeli stosunek HER2/Chr17 wypada między 1,8 i 2,2,
należy policzyć dodatkowe 20 jąder. Następnie należy utworzyć nowy stosunek na
podstawie 40 jąder i zgłosić status amplifikacji zgodnie z już przedstawionym opisem.
3.
4.
5.
Preparat
wybarwiony
HER2/Chr17
Początek
Preparat
adekwatny?
Nie
Nieadekwatny
6.
Tak
Zidentyfikować i wybrać obszar docelowy
7.
Zliczyć sygnały HER2 i Chromosome 17 w 20 jądrach
Obliczyć stosunek ilości HER2/Chr17, dzieląc
sumaryczną liczbę sygnałów HER2 z obszaru
docelowego 1 przez sumaryczną liczbę sygnałów
Chr17 obszaru docelowego 1.
Czy
1,8 ≤ HER2/Chr17 ≤ 2,2
?
Ograniczenia swoiste
1.
Zliczyć dodatkowe 20 jąder
2.
Tak
Nie
Zgłaszanie wyników
Brak amplifikacji
HER2/Chr17 < 2,0
Amplifikacja
HER2/Chr17 ≥ 2,0
3.
Obliczyć stosunek ilości HER2/Chr17,
dzieląc sumaryczną liczbę sygnałów HER2
z obszarów docelowych 1 i 2 przez
sumaryczną liczbę sygnałów Chr17
obszarów docelowych 1 i 2.
Kontrole
Obecność sygnałów srebra i czerwieni w obrębie jądra komórki prawidłowej wskazuje na
reaktywność dodatnią. Prawidłowe jądra komórkowe powinny zawierać średnio 1–2
oddzielne sygnały SISH i Red ISH wskazując, że sondy HER2 DNA i centromerycznego
Chromosome 17 probe zostały hybrydyzowane – odpowiednio – do genu i jego
chromosomu. Brak sygnału kopii genów w prawidłowych komórkach oznacza, że
barwienie nie powiodło się, a wyniki należy uznać za nieważne. Stosowanie preparatów
ksenograftowych pomoże w rozwiązywaniu potencjalnych problemów z analizatorem i/lub
odczynnikiem.
Próbka pacjenta
Dane morfologiczne pacjenta i odpowiednie dane kliniczne powinien interpretować
doświadczony patolog.
OGRANICZENIA
Ograniczenia ogólne
1.
2.
Wykonywanie barwień ISH jest wieloetapowym procesem diagnostycznym
wymagającym specjalistycznego przeszkolenia w doborze odpowiednich
odczynników, przygotowaniu materiału, obróbce i przygotowaniu preparatów
ISH oraz interpretacji wyników barwienia.
Wybarwienie tkanek zależy od traktowania i przygotowania tkanek przed
barwieniem. Nieprawidłowe utrwalanie, zamrażanie, rozmrażanie, przemywanie,
suszenie, ogrzewanie, wykonywanie skrawków lub ich zanieczyszczenie domieszką
innych tkanek lub płynów może powodować artefakty. Przyczyną sprzecznych
wyników może być stosowanie zmiennych metod utrwalania i zatapiania lub
właściwości zależne od tkanek.
2016-10-05
FT0700-415g
Nadmierne lub niecałkowite barwienie kontrastowe może utrudniać prawidłową
interpretację wyników.
Interpretacja kliniczna barwienia musi być prowadzona w kontekście historii klinicznej,
morfologii i innych kryteriów histopatologicznych. Odpowiedzialność związana
z interpretacją wybarwionego preparatu spoczywa na wykwalifikowanym histopatologu,
dysponującym doświadczeniem obejmującym stosowane odczynniki i metody
przygotowania preparatu. Barwienie należy wykonać w akredytowanej pracowni
histopatologicznej, pod nadzorem histopatologa odpowiedzialnego za przeglądanie
i ocenę wybarwionych preparatów i właściwe wykonanie prób kontrolnych.
Firma Ventana udostępnia odczynniki optymalnie rozcieńczone pod kątem procedur
opisywanych w instrukcjach. Zwiększanie rozcieńczenia może powodować utratę
odczynu; użytkownik musi zweryfikować wszelkie zmiany tego typu. Wszelkie
odstępstwa od zalecanych procedur wykonywania testów mogą spowodować
unieważnienie oczekiwanych wyników. Użytkownicy stosujący procedury
odbiegające od zalecanych odpowiadają za interpretację wyników badania próbek
pochodzących od pacjenta.
Ze względu na różnice w metodach obróbki materiału może zajść konieczność
wydłużenia lub skrócenia czasu trawienia proteazą ISH albo użycia innej proteazy ISH
w poszczególnych preparatach. Każda taka zmiana musi być zweryfikowana przez
użytkownika. Użytkownicy stosujący procedury odbiegające od zalecanych są
odpowiedzialni za interpretację wyników pacjenta w zmienionych warunkach badania.
W tkankach, które nie zostały uprzednio przetestowane, odczynniki mogą
wykazywać nieoczekiwane reakcje. Nie można wykluczyć wystąpienia
nieoczekiwanych reakcji w przetestowanych tkankach z uwagi na zmienność
biologiczną tkanek. Udokumentowane nieoczekiwane reakcje należy zgłaszać
lokalnemu przedstawicielowi serwisu.
6 / 10
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail został opracowany do barwienia
wycinków tkanek utrwalonych w 10% NBF i ciętych na grubość ~4 μm27. Test barwi
także próbki utrwalone w formalinie alkoholowej, formalinie cynkowej i utrwalaczu
PREFER. Nie jest zalecane utrwalanie w Bouin’s ani AFA.
Aby zapobiec rozmyciu sygnału Red ISH, wybarwionych preparatów nie wolno
zanurzać w kąpielach alkoholowych ani acetonowych w celu odwodnienia. Zaleca
się suszenie na powietrzu lub suszenie w suszarce.
Znany jest fakt blednięcia sygnału SISH po ekspozycji na niektóre media
montażowe. Lista niekompatybilnych mediów montażowych – patrz Tabela 11
w części Rozwiązywanie problemów.
CHARAKTERYSTYKA ROBOCZA
1.
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail oceniono przy użyciu HER2 Dual ISH
3-in-1 Xenograft Slides, które były wcześniej scharakteryzowane pod względem
liczby kopii genu HER2 przez Abbott/Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit dla
fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i oznaczone jako mające podobne
stosunki HER2/Chr17. Ponadto około 90 próbek ludzkich (mieszanka przypadków
amplifikowanych i nieamplifikowanych) było wybarwionych za pomocą INFORM
HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail i zliczanych przez dwóch wykwalifikowanych
diagnostów. Tę samą grupę wybarwiono za pomocą oznaczenia PathVysion FISH
i została zliczona przez jedną wykwalifikowaną osobę odczytującą. Dla testu
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail udział pomyślnego barwienia dla
pierwszego przebiegu wyniósł > 93%. Wyniki opisujące szczegółowo stosunki
zgodności ujemne, dodatnie i ogólne dla około 60 prób klinicznych tego zestawu,
które zostały zliczone dla FISH i dla INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail,
przedstawia Tabela 4 i Tabela 5.
Tabela 4. Zgodność między INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail i FISH
w zestawie próbek ludzkiego raka sutka między 2 diagnostami.
Diagnosta HER2
Dual ISH
Diagnosta A
Diagnosta B
Status amplifikacji
HER2 Dual ISH
Status amplifikacji FISH
Ampl.
Bez ampl.
Ampl.
21
2
Bez ampl.
1
40
Ampl.
17
1
Bez ampl.
2
41
1008041PL Rev C
Tabela 5. Podsumowanie ujemnych, dodatnich i ogólnych wskaźników zgodności dla
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail i FISH w próbkach ludzkiego raka sutka.
Diagnosta
HER2 Dual
ISH
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Stosunek zgodności
Stosunek zgodności
Stosunek zgodności
ujemnej
dodatniej
ogólnej
Dane
Procent
Dane
Procent
Dane
Procent
surowe /
(95%
surowe / (95% zliczeń surowe / (95% zliczeń
Liczba
zliczeń CI)
Liczba
CI)
Liczba
CI)
przypadków
przypadków
przypadków
Diagnosta A
40/42
95,2
(84,2–98,7)
21/22
95,5
(78,2–99,2)
61/64
95,3
(87,1–98,4)
Diagnosta B
41/42
97,6
(87,7–99,6)
17/19
89,5
(68,6–97,1)
58/61
95,1
(86,5–98,3)
Swoistość analityczna (skuteczność hybrydyzacji) INFORM HER2 Dual ISH DNA
Probe Cocktail została wyznaczona przez barwienie prawidłowej ludzkiej metafazy
podziału za pomocą HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail na urządzeniu
BenchMark XT. Ze 100 analizowanych metafaz podziału 100% wyrażało swoistą
współlokalizację sond HER2 probe i Chromosome 17 probe.
Powtarzalność testu INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail była badana
między pięcioma przypadkami raka sutka u ludzi (reprezentującymi zakres
dynamiczny statusu genu HER2) oraz HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides
w ciągu pięciu nienastępujących kolejno po sobie dni na sześciu urządzeniach
(2 BenchMark, 2 BenchMark XT, 2 BenchMark ULTRA). Średnia liczba kopii HER2
i Chromosome 17 została uzyskana z każdego urządzenia (przez 3 platformy) na
każdym z pięciu przebiegów. Ponad 98% wszystkich preparatów wybarwionych
i ocenionych w badaniu (łącznie 360) spełniało kryteria adekwatności i pozwoliło na
uzyskanie powtarzalnych wyników liczby kopii HER2 i Chromosome 17 z %CV < 10%
dla wszystkich dni, urządzeń i testowanych platform.
Powtarzalność między partiami testu INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail
była wyznaczona przez badanie każdej z 3 partii INFORM HER2 Dual ISH DNA
Probe Cocktail z 3 zestawami do detekcji ultraView SISH DNP i ultraView Red ISH
DIG Detection Kits na podwojonych preparatach 3 przypadków raka sutka u ludzi
i HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides. Wszystkie preparaty (100%) spełniły
kryterium odpowiedniości i były zliczane przez wykwalifikowanego diagnostę pod
względem surowej liczby HER2 i Chromosome 17 w 20 jądrach/próbkę. Dane
poddano analizie zmienności składników w oparciu o model skutków losowych,
a wyniki wykazały, że w badaniu zostały spełnione wszystkie kryteria
akceptowalności. Procentowe kowariancje (%CVs) dla partii próbek, partii zestawu
do detekcji i w ramach pomiaru miały wartość < 11%, wskazując doskonałą precyzję
oznaczenia.
Porównywalność testu na próbkach sutka wyznaczono przez studium porównawcze
testu INFORM HER2 DNA Probe, gdzie liczby kopii HER2 i Chromosome 17
wyznaczono na indywidualnych preparatach za pomocą pojedynczego zestawu
SISH wobec testu INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, gdzie liczby kopii
HER2 i Chromosome 17 wyznaczono na pojedynczym preparacie za pomocą
detekcji SISH i Red ISH. Zestaw 213 przypadków raka sutka zawierający
mieszaninę ~50/50 statusu genu nieamplifikowanego i amplifikowanego był badany
dwoma testami na automatach BenchMark XT (Tabela 6). Stosunek zgodności
ogólnej w próbkach klinicznych INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail
z testem INFORM HER2 DNA Probe przedstawia Tabela 7.
Powtarzalność testu INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail była badana
między czterema przypadkami raka żołądka u ludzi (reprezentującymi zakres
dynamiczny statusu genu HER2) w ciągu pięciu nienastępujących kolejno po sobie
dni na sześciu urządzeniach (2 BenchMark, 2 BenchMark XT, 2 BenchMark
ULTRA). Średnia liczba kopii HER2 i Chromosome 17 została uzyskana z każdego
urządzenia (przez 3 platformy) na każdym z pięciu przebiegów. Ponad 98%
wszystkich preparatów wybarwionych i ocenionych w badaniu (łącznie 240)
spełniało kryteria adekwatności i pozwoliło na uzyskanie powtarzalnych wyników
liczby kopii HER2 i Chromosome 17 z %CV < 10% dla wszystkich dni, urządzeń
i testowanych platform.
Porównywalność oznaczenia na próbkach żołądkowych określono przez
porównanie wyników barwienia z pomiaru testu INFORM HER2 Dual ISH DNA
Probe Cocktail na BenchMark XT z Dako HER2 FISH pharmDx Kit (Tabela 8).
Stosunek zgodności ogólnej w próbkach klinicznych INFORM HER2 Dual ISH DNA
Probe Cocktail z zestawem Dako HER2 FISH pharmDx Kit przedstawia Tabela 9.
2016-10-05
FT0700-415g
7 / 10
8.
Użyteczność kliniczną w doborze pacjentów dla KADCYLA wykazano w badaniu
MARIANNE. MARIANNE to randomizowane, prowadzone w trzech grupach,
wieloośrodkowe badanie fazy III opracowane w celu oceny skuteczności
i bezpieczeństwa trastuzumab emtansine (T-DM1) skojarzonego z pertuzumabem
oraz T-DM1 skojarzonego z placebo w porównaniu z terapią skojarzoną preparatem
trastuzumab plus taxane w leczeniu HER2-dodatniego (zgodnie z definicją według
IHC 3+ w teście PATHWAY HER2 (4B5) i/lub ISH amplifikowanego za pomocą
testu INFORM HER2 Dual ISH) progresywnego lub nawracającego, miejscowo
zaawansowanego raka sutka (ang. Locally Advanced Breast Cancer, LABC) lub
przerzutowego raka sutka (ang. Metastatic Breast Cancer, MBC) u pacjentów,
którzy nie otrzymywali wcześniej chemioterapii swojej choroby przerzutowej.
Łącznie 1629 uczestników poddano badaniu przesiewowemu pod kątem rekrutacji
do badania MARIANNE, z czego 1563 badano przy użyciu testów PATHWAY HER2
(4B5) i/lub INFORM HER2 Dual ISH. Ogółem do badania fazy III włączono 1093
pacjentów HER2-dodatnich i 2 HER2-ujemnych według kryteriów rekrutacji do
badania MARIANNE, z czego 983 miało dodatni pod względem HER2 test próbki
uzyskany przy pomocy testu INFORM HER2 Dual ISH.
Pierwszorzędowym punktem końcowym skuteczności dla badania MARIANNE było
przeżycie bez progresji (ang. progression free survival, PFS) oparte na ocenie przez
niezależny ośrodek diagnostyczny (ang. independent review facility, IRF)
u pacjentów z HER2-dodatnim progresywnym lub nawracającym LABC lub
wcześniej nieleczonym MBC. Mediana PFS wynosiła 13,7 miesiąca dla skojarzenia
trastuzumab + taxane, 14,1 miesiąca dla T-DM1 + placebo i 15,2 miesiąca dla
T-DM1 + pertuzumab.
Badanie wykazało równoważność PFS dla obu schematów zawierających T-DM1
w porównaniu ze skojarzeniem trastuzumab + taxane (stratyfikowane wartości HR
były poniżej wstępnie określonego marginesu równoważności HR=1,1765). Jednak
żaden ze schematów zawierających T-DM1 nie wykazał istotnej statystycznie
wyższości PFS w porównaniu ze skojarzeniem trastuzumab + taxane. W przypadku
T-DM1 + placebo: HR=0,91 (95% CI: 0,73, 1,13); W przypadku T-DM1 +
pertuzumabu: HR=0,87 (95% CI: 0,69, 1,08).
Ponadto dodatek pertuzumabu do T-DM1 nie powodował istotnego statystycznie
wzrostu wartości PFS (HR=0,91, 95% CI: 0,73, 1,13).
Tabela 6. Zgodność między INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail z użyciem
Dual SISH i Red ISH Detection i INFORM HER2 DNA Probe z użyciem pojedynczej
detekcji SISH na zestawie próbek inwazyjnego raka sutka.
Status amplifikacji
HER2 Dual ISH
Status amplifikacji FISH
Amplifikowany
Nieamplifikowany
Ogółem
Amplifikowany
101
7
108
Nieamplifikowany
13
92
105
Ogółem
114
99
213
Tabela 7. Podsumowanie współczynnika zgodności całkowitej w przypadku INFORM
HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail przy użyciu Dual SISH i Red ISH Detection
w porównaniu do INFORM HER2 DNA Probe przy użyciu pojedynczej detekcji SISH na
próbkach inwazyjnego raka sutka. Przedstawiono również 95% przedziały ufności.
Stosunek zgodności ogólnej
Dane surowe /
liczba przypadków
Procent
(95% zliczeń CI)
193/213
90,6 (85,9–93,8)
Tabela 8. Zgodność między testem INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail
i testem Dako FISH pharmDx w próbkach raka żołądka.
Status amplifikacji
HER2 Dual ISH
Status amplifikacji Dako FISH
Amplifikowany
Nieamplifikowany
Ogółem
Amplifikowany
15
2
17
Nieamplifikowany
6
123
129
1008041PL Rev C
2.
Status amplifikacji Dako FISH
Status amplifikacji
HER2 Dual ISH
Amplifikowany
Nieamplifikowany
Ogółem
21
125
146
Ogółem
Tabela 9. Podsumowanie współczynnika zgodności całkowitej testu INFORM HER2 Dual
ISH DNA Probe Cocktail i Dako FISH dla statusu genu HER2 na próbkach raka żołądka.
Przedstawiono również 95% przedziały ufności.
Stosunek zgodności ogólnej
Dane surowe /
liczba przypadków
Procent
(95% zliczeń CI)
138/146
94,5 (89,6–97,2)
Tabela 10. Czas trwania PFS według oceny IRF.
Trastuzumab +
Taxane (N=365)
T-DM1 + Placebo
(N=367)
T-DM1 +
Pertuzumab
(N=363)
Pacjenci ze zdarzeniem (%)
231 (63,3%)
236 (64,3%)
217 (59,8%)
Pacjenci bez zdarzenia (%)
134 (36,7%)
131 (35,7%)
146 (40,2%)
13,7
(12,4, 14,9)
14,1
(10,9, 16,8)
15,2
(12,5, 18,8)
Czas trwania PFS (miesiące)
Mediana (95% CI)
T-DM1 + Pertuzumab i T-DM1 + Placebo wobec Trastuzumab + Taxane
Analiza stratyfikowana*
wartość p (log-rank)
Współczynnik ryzyka (95% CI)
Nie dotyczy
0,3125
0,1407
Nie dotyczy
0,91
(0,73, 1,13)
0,87
(0,69, 1,08)
Nie dotyczy
0,5142
0,0972
Nie dotyczy
0,94
(0,76, 1,16)
0,85
(0,69, 1,06)
Analiza niestratyfikowana
wartość p (log-rank)
Współczynnik ryzyka (95% CI)
T-DM1 + Pertuzumab wobec T-DM1 + Placebo
Analiza stratyfikowana*
wartość p (log-rank)
Nie dotyczy
Nie dotyczy
0,3075
Współczynnik ryzyka (95% CI)
Nie dotyczy
Nie dotyczy
0,91
(0,73, 1,13)
wartość p (log-rank)
Nie dotyczy
Nie dotyczy
0,2949
Współczynnik ryzyka (95% CI)
Nie dotyczy
Nie dotyczy
0,91
(0,73, 1,12)
Analiza niestratyfikowana
*Stratyfikacja według regionu świata (USA; Europa Zachodnia, Kanada i Australia-Pacyfik;
Europa Wschodnia; Azja; pozostałe), wcześniejsza terapia adiuwantowa/neoadiuwantowa
(nie; tak-trastuzumab i/lub lapatynib; tak-nie trastuzumab i/lub lapatynib) i choroba trzewna
(występująca; brak).
ROZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW
1.
Kluczowa jest ocena obecności odpowiedniego sygnału w jądrach Wewnętrznej
Kontroli Dodatniej. Sygnały prawidłowego HER2 i Chromosome 17 (1 do 2 kopii na
komórkę) działają jako wewnętrzne kontrole dodatnie i ich obecność potwierdza
czułość testu oraz swoistość wobec pojedynczych preparatów. Odczyn jądrowy może
wystąpić między innymi w następujących komórkach nienowotworowych: fibroblasty
podścieliska, komórki śródbłonka, limfocyty i inne komórki nienowotworowe.
2016-10-05
FT0700-415g
8 / 10
Słabe wybarwienie preparatów lub jego brak podczas próby mogą wskazywać
problem z odczynnikami lub urządzeniem. Sprawdzić, czy przestrzegane są warunki
przedanalityczne (patrz Przygotowanie próbki). Upewnić się, czy wszystkie
dozowniki działają prawidłowo. Można posłużyć się HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft
Slides w celu kontroli w razie podejrzeń wobec odczynnika lub urządzenia.
3.
Jeśli sygnał SISH jest odpowiedni, ale sygnał Red ISH jest słaby lub go brakuje,
upewnić się, że preparaty nie zostały odwodnione w alkoholu lub acetonie oraz że
nie były przez dłuższy czas pod działaniem kąpieli ksylenowej. Jeżeli sygnał Red
ISH jest odpowiedni, ale SISH jest słaby lub go brak (bądź blednie albo przechodzi
w brązowy/pomarańczowy), może występować utlenienie sygnału. Upewnić się, czy
używane jest prawidłowe medium montażowe (patrz Tabela 11).
4.
Próbki, które były nieprawidłowo pobierane, utrwalane lub przechowywane, mogą
wykazywać nieodpowiednie barwienie (patrz Przygotowanie próbki).
5.
Jeżeli sygnał dla jednej lub obu sond jest słaby lub go brak, zaś jądra nowotworowe
pojawiają się nienaruszone i/lub o barwie niebieskiej, zalecane jest wydłużenie
czasów obróbki wstępnej. Mówiąc ściślej, może być zastosowane użycie
ISH Protease 3 przez więcej niż 16 minut (tj. 24 minuty) lub ISH Protease 2 przez
4 minuty lub dłużej. Skuteczne jest także wydłużenie czasów kondycjonowania
komórek (16 minut na cykl dla 3 cykli). Firma Ventana ustaliła, że manipulacja
etapami obróbki wstępnej jest najskuteczniejsza w poprawie słabego wybarwiania.
6.
Jeśli sygnał uzyskany w zalecanych warunkach jest słaby lub nie występuje
w komórkach nowotworu, a komórki te sprawiają wrażenie nadmiernie strawionych
(tj. barwienie kontrastowe blade lub nieobecne), może to wynikać z niedostatecznego
utrwalenia (patrz Przygotowanie próbki). Zalecane jest skrócenie czasu ISH
Protease 3 do 8 lub 12 minut. Ponadto skutecznym działaniem zapobiegającym
słabemu wybarwieniu jest wydłużenie czasów inkubacji SISH HRP Multimer, Silver C,
AP Multimer i Fast Red Chromogen.
7.
Jeżeli preparaty ujawniają nieswoiste wybarwienie tła SISH („pył”) w jądrach, które
może zakłócać zliczanie sygnałów specyficznych SISH, można wykonać skrócenie
czasu Proteazy 3 z 16 minut do 4, 8 lub 12 minut.
8.
Jeżeli nieswoiste wybarwienie Red ISH w jądrach zakłóca zliczanie, należy
wybarwić ponownie preparat w wyższych temperaturach kąpieli surowej (tj. 76°C).
9.
Aby wdrożyć działania korekcyjne, należy zapoznać się z rozdziałem Procedura
postępowania w instrukcji obsługi automatu do barwienia preparatów lub
skontaktować się z lokalnym przedstawicielem wsparcia.
10. Skrawki grubsze niż 4 μm mogą wymagać silniejszego kondycjonowania proteazą
w celu odmaskowania docelowego DNA. Cieńsze skrawki mogą wymagać
łagodniejszego traktowania proteazą. Ponadto grube skrawki mogą wykazywać
obecność większej ilości pęcherzyków jądrowych niż cieńsze skrawki na skutek
nadmiaru parafiny w tkance (patrz Przygotowanie próbki). Próbki takie mogą
wymagać odparafinowania w łaźniach alkoholowych i ksylenowych, a następnie
powtórzenia wybarwienia w urządzeniu. Użytkownik może także wybrać opcję
„przedłużonego odparafinowania” w celu złagodzenia występowania pęcherzyków
jądrowych z powodu nadmiaru parafiny.
11. W przypadku wybarwienia niemożliwego do interpretacji, z brązowym, czarnym lub
ciemnoczerwonym tłem przez tkankę, preparat należy powtórzyć. Jeśli wybarwienie
w dalszym ciągu jest nie do zaakceptowania, upewnić się, czy szkiełka to
SuperFrost Plus. Jeśli na preparacie odkłada się nadmiar srebra lub czerwieni,
utrudniając zliczenie wyraźnego sygnału na skutek plamek w tkance, preparat
również należy wybarwić ponownie. Zazwyczaj nie więcej niż 5–6% przypadków
powinno wymagać powtórzenia na skutek artefaktów barwienia/suszenia.
Tabela 11. Porównywalność mediów montażowych z testami opartymi na SISH.
Środek do
zatapiania
preparatu
Producent
Typ (ksylen,
alkohol, wodny)
Zgodność
z SISH
Eukitt
EMS
Ksylen
N
Entellan New
Merck
Ksylen
N
Entellan
Merck
Ksylen
N
HSR
Sysmex
Ksylen
N
Malinol
Muto Chemical
Ksylen
N
Cytoseal XYL
Richard Allan Scientific
Ksylen
T
Softmount
WAKO
LEMASOL A
T
Paramount
Protaqs Quartett: Dako
Ksylen
T
1008041PL Rev C
Środek do
zatapiania
preparatu
Producent
Typ (ksylen,
alkohol, wodny)
Zgodność
z SISH
DPX
BDH: Raymond Lamb
Ksylen
T
Cytoseal 60
Richard Allan Scientific
Ksylen
T
Permount
Fisher
Ksylen
T
13.
14.
15.
Histomount
Raymond Lamb
Ksylen
T
Ultramount
Dako
Ksylen
T
Thermo EZ Mount
Thermo Scientific
Ksylen
T
SureMount
Triangle Biomedical
Sciences
Ksylen
T
Flo-Texx
Lerner Labs
Ksylen
T
Mountex
Histolab
Ksylen
T
Shandon Consul
mount
Thermo Scientific
Ksylen
T
18.
MM24
SurgiPath
Ksylen
T
19.
Pertex
Cell Path
Ksylen
T
MicroMount
SurgiPath
Ksylen
T
Diamount
Diapath
Ksylen
T
Alcolmount
Diapath
Alkohol
T
BioMount 2
BBInternational
Ksylen
T
Acrytol
SurgiPath
Ksylen
T
Gel Mount
Biomeda
Wodne
T
Mount-Quick
Daido Sangyo Co.
Wodne
T
16.
17.
20.
21.
22.
23.
24.
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Gschwind A, Fischer OM, Ullrich A. The discovery of receptor tyrosine kinases:
target for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2004;4(5);361-370.
Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian
erythroblastic leukemic viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome
band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 1997;76(1-2):34-35.
Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive
homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene.
Science. 1985;230(4730):1132-1139.
Slamon DJ, Godolphin W, Jones LA, et al. Studies of the HER-2/neu protooncogene in human breast and ovarian cancer. Science. 1989;244(4905):707-712.
Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, et al. Human breast cancer: correlation of relapse
and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science.
1987;235(4785):177-182.
Narita M, Nakao K, Ogino N, et al. Independent prognostic factors in breast cancer
patients. Am J Surg. 1998;175(1):73-75.
O’Reilly SM, Barnes DM, Camplejohn RS, et al. The relationship between c-erbB-2
expression, S-phase fraction, and prognosis in breast cancer. Br J Cancer.
1991;63(3):444-446.
Pegram MD, Finn RS, Arzoo K, et al. The effect of HER-2/neu overexpression on
chemotherapeutic drug sensitivity in human breast and ovarian cancer cells.
Oncogene. 1997;15(5):537-547.
Press MF, Pike MC, Chazin VR, et al. Her-2/neu expression in node-negative breast
cancer: Direct tissue quantitation by computerized image analysis and association
of overexpression with increased risk of recurrent disease. Cancer Res.
1993;53(20):4960-4970.
Press MF, Bernstein L, Thomas PA, et al. HER-2/neu gene amplification
characterized by fluorescence in situ hybridization: Poor prognosis in node-negative
breast carcinomas. J Clin Oncol. 1997;15(8):2894-2904.
Gusterson BA, Gelber RD, Goldhirsch A, et al. Prognostic importance of c-erbB-2
expression in breast cancer. J Clin Oncol. 1992;10:1049-1056.
Bianchi S, Paglierani M, Zampi G, et al. Prognostic significance of c-erbB-2
expression in node negative breast cancer. Br J Cancer. 1993;67(3):625-629.
2016-10-05
FT0700-415g
9 / 10
25.
26.
27.
Kallioniemi OP, Holli K, Visakorpi T, et al. Association of c-erB-2 protein expression
with high rate of cell proliferation, increased risk of visceral metastasis and poor
long-term survival in breast cancer. Int J Cancer. 1991;49(5):650-655.
Vogel CL, Cobleigh MA, Tripathy D, et al. Efficacy and safety of trastuzumab as
a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast
cancer. J Clin Oncol. 2002;20(3):719-726.
Baselga J, Carbonell X, Castañeda-Soto NJ, et al. Phase II study of efficacy, safety,
and pharmacokinetics of trastuzumab monotherapy administered on a 3-weekly
schedule. J Clin Oncol. 2005;23(10):2162-2171.
Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. Concurrent administration of anti-HER2
monoclonal antibody and first-line chemotherapy for HER2-overexpressing
metastatic breast cancer: A phase III, multinational, randomized, controlled trial.
N Engl J Med. 2001;344:783-792.
Marty M, Cognetti F, Maraninchi D, et al. Randomized phase II trial of the efficacy and
safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal
growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line
treatment: the M77001 study group. J Clin Oncol. 2005;23(19):4265-4274.
Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland-Jones B, et al. Trastuzumab after adjuvant
chemotherapy in HER2-positive breast cancer. N Engl J Med. 2005;353(16):1659-1672.
Romond EH, Perez EA, Bryant J, et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy
for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med. 2005;353(16):1673-1684.
Bilous M, Dowsett M, Hanna W, et al. Current perspectives on HER2 testing:
a review of national testing guidelines. Mod Pathol. 2003;16(2):173-182.
Hofmann M, Stoss O, Shi D, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric
cancer: results from a validation study. Histopathology. 2008;52(7):797-805.
Wolff AC, Hammond ME, Schwartz, JN, et al. American Society of Clinical
Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human
epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med.
2007;131(1):18-43.
Baloglu G, Haholu A, Kucukodaci Z, et al. The effects of tissue fixation alternatives
on DNA content: a study on normal colon tissue. Appl Immunohistochem Mol
Morphol. 2008;16(5):485-492.
Middleton LP, Price KM, Puig P, et al. Implementation of American Society of
Clinical Oncology/College of American Pathologists HER2 Guideline
Recommendations in a tertiary care facility increases HER2 immunohistochemistry
and fluorescence in situ hybridization concordance and decreases the number of
inconclusive cases. Arch Pathol Lab Med. 2009;133(5):775-780.
Khoury T, Sait S, Hwang H, et al. Delay to formalin fixation effect on breast
biomarkers. Mod Pathol. 2009;22(11):1457-1467.
Reinholz MM, Bruzek AK, Visscher DW, et al. Breast cancer and aneusomy 17:
implications for carcinogenesis and therapeutic response. Lancet Oncol.
2009;10(3):267-277.
Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and Practice of Histotechnology, 2nd Edition.
The C.V. Mosby Company, St. Louis, 1980.
WŁASNOŚĆ INTELEKTUALNA
INFORM, ultraView, BENCHMARK, VENTANA oraz logo VENTANA są znakami
towarowymi firmy Roche.
Wszystkie pozostałe znaki towarowe stanowią własność odpowiednich właścicieli.
© 2010–2016 Ventana Medical Systems, Inc.
DANE KONTAKTOWE
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Strasse 116
D-68305 Mannheim
Germany
www.ventana.com
1008041PL Rev C
Załącznik A: Interpretacja Rejestru Wyników
Należy zliczać 20 jąder. Jeżeli stosunek HER2/Chr17 wypada między 1,8 i 2,2:
Należy zliczyć 20 dodatkowych jąder.
1. obszar docelowy
2. obszar docelowy, jeżeli stosunek 1,8 ≤ HER2/Chr17 ≤ 2,2
☐ Czy obecna jest heterogeniczność? (Zaznaczyć, jeżeli tak)
☐ Czy obecna jest heterogeniczność? (Zaznaczyć, jeżeli tak)
Komórka
Komórka
Liczba HER2
Komórka
Liczba Chr17
Liczba HER2
Komórka
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
4
5
5
5
5
6
6
6
6
7
7
7
7
8
8
8
8
9
9
9
9
10
10
10
10
11
11
11
11
12
12
12
12
13
13
13
13
14
14
14
14
15
15
15
15
16
16
16
16
17
17
17
17
18
18
18
18
19
19
19
19
20
20
20
20
☐ Czy obecne są skupiska?
(Zaznaczyć, jeżeli tak)
Sumaryczna liczba sygnałów
HER2 w 1. obszarze
docelowym.
☐ Czy obecne są skupiska?
(Zaznaczyć, jeżeli tak)
☐ Czy obecne są skupiska?
(Zaznaczyć, jeżeli tak)
Sumaryczna liczba sygnałów
Chr17 w 1. obszarze
docelowym
a
Sumaryczna liczba sygnałów
HER2 w 2. obszarze
docelowym.
b
☐ Czy obecne są skupiska?
(Zaznaczyć, jeżeli tak)
Sumaryczna liczba sygnałów
Chr17 w 2. obszarze
docelowym
d
c = a/b
f = (a+d)/(b+e)
☐ Brak amplifikacji: HER2/Chr17 < 2,0
☐ Brak amplifikacji: HER2/Chr17 < 2,0
☐ Amplifikacja: HER2/Chr17 ≥ 2,0
☐ Amplifikacja: HER2/Chr17 ≥ 2,0
FT0700-415g
e
Stosunek HER2/Chr17 w 1. i 2. obszarze docelowym
Stosunek HER2/Chr17 w 1. obszarze docelowym
2016-10-05
Liczba Chr17
10 / 10
1008041PL Rev C