oznaczanie stężenia glukozy we krwi metodą enzymatyczną

OZNACZANIE STĘŻENIA GLUKOZY WE KRWI
METODĄ ENZYMATYCZNĄ-OXY
ZASADA OZNACZENIA
Glukoza pod wpływem oksydazy glukozowej utlenia się do kwasu glukonowego z
wytworzeniem nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru w obecności peroksydazy ulega
rozłożeniu do wody i tlenu, a ten utlenia chromogen (ABTS, sól sodowa kwasu 2,2’-azyno-di(3-etylo-benzotiazolidyno-6-sulfonowego), czego efektem jest zmiana barwy. Natężenie
powstałego zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia glukozy w badanej próbce i mierzy
się je spektrofotometrycznie. Metoda ta jest specyficzna dla D-glukozy i pozwala na
oznaczanie jej stężenia w surowicy, krwi, moczu i płynie mózgowo-rdzeniowym.
WYKONANIE ĆWICZENIA
Materiał badany:
- surowica
Odczynniki:
- bufor fosforanowy, pH 7
- roztwór roboczy enzymów (oksydazy glukozowej i peroksydazy)
- roztwór wzorcowy glukozy I o stężeniu 5 mmol/l
- roztwór wzorcowy glukozy II o stężeniu15 mmol/l
- roztwór odbiałczający (kwas nadchlorowy 0,33 mmol/l)
Przygotowanie próby badanej:
Do próbówki wirówkowej odmierzyć roztwór odbiałczający i materiał badany (surowicę) w
stosunku 10:1 (1ml roztworu odbiałczającego: 100µl surowicy). Zawartość próbówki
wymieszać. Próbkę ustawić na wadze szalkowej i zrównoważyć umieszczając na drugiej
szalce pustą probówkę wirnikową i dopełniając ją wodą destylowaną. Obie probówki
umieścić naprzeciwlegle w wirówce. Wirować 15 minut przy 3000 obrotów.
Przygotowanie rozcieńczeń do krzywej wzorcowej:
W oznaczonych próbówkach przygotować roztwory wzorcowe według poniższej tabeli.
Stężenie roztworu
wzorcowego
[mmol/l]
Wzorzec I
Wzorzec II
Roztwór
odbiałczający
[ml]
Woda
destylowana
[ml]
[ml]
W1
5
0,1
-
0,5
0,5
W2
10
0,2
-
0,4
0,5
W3
15
-
0,1
0,5
0,5
W4
20
0,4
-
0,2
0,5
Numer
próbówki
1
Wykonanie oznaczenia:
Do czystych i oznaczonych próbówek laboratoryjnych odmierzyć składniki wg tabeli
przedstawionej poniżej. Objętości w tabeli zostały podane w ml:
Roztwór
wzorcowy
Supernatant z
próby badanej
Roztwór
odbiałczający
Roztwór
roboczy
Próba odczynnikowa
-
-
0,2
1
W1
0,2
-
-
1
W2
0,2
-
-
1
W3
0,2
-
-
1
W4
0,2
-
-
1
Próba badana
-
0,2
-
1
Podane składniki wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po tym
czasie zmierzyć absorbancję prób wzorcowych i próby badanej względem próby
odczynnikowej przy długości fali  = 500 nm. Pomiar powinien być przeprowadzony w
czasie przed upływem 50 minut od dodania roztworu roboczego.
Opracowanie wyników:
Na podstawie absorbancję dla prób wzorcowych należy wykreślić na papierze milimetrowym
krzywą wzorcową, odznaczając na osi odciętych (X) stężenia roztworów wzorcowych, a na
osi rzędnych (Y) odpowiadającą im absorbancję. Stężenie glukozy należy odczytać ze
sporządzonej krzywej kalibracyjnej. Zakres prostoliniowości mieści się w granicach od 0 – 20
mmol/l. Określić, czy stężenia w badanej próbce mieściło się w granicach wartości
prawidłowych.
2
OZNACZANIE STĘŻENIA GLUKOZY WE KRWI
METODĄ ENZYMATYCZNĄ-HEXO
ZASADA OZNACZENIA
Glukoza pod wpływem heksokinazy ulega fosforylacji przy udziale ATP do glukozo6-fosforanu i ADP. Glukozo-6fosforan jest utleniany do 6-fosfoglukonianu przy jednoczesnej
redukcji NAD do NADH. Powstaniu NADH towarzyszy wzrost absorbancji przy długości fali
340nm, który jest proporcjonalny do stężenia glukozy w badanej próbce. Metoda pozwala na
oznaczanie jej stężenia w surowicy krwi, osoczu i moczu.
Glukoza +ATP
G-6-P +ADP
G-6-PDH (Dehydrogenaza G-6-P)
6-PG +NADH + H+
G-6-P +NAD
WYKONANIE ĆWICZENIA
Materiał badany:
- surowica, osocze, mocz
Odczynniki:
- trójetanoloamina 20 mmol/l
- ATP 1 mmol/l
- NAD 0,69 mmol/l
- heksokinaza > 1,500 U/l
- dehydrogenaza G-6-P > 1,500 U/l
pH 7,3 temp. 20oC
Wykonanie oznaczenia:
Przygotować i oznakować probówki laboratoryjne.
Właściwą ilość odczynnika ogrzać do temperatury reakcji 37oC co najmniej przez 5 minut.
Dodać pozostałych składników mieszaniny reakcyjnej (wg tabeli poniżej)
próba ślepa
próba badana
próba
wzorcowa
Odczynnik
1 ml
1 ml
1 ml
Surowica lub
standard
-
10 l
10 l
Woda destylowana
10 l
-
-
Inkubować 3 minuty w temperaturze 37oC.
Zmierzyć absorbancję próby badanej oraz standardu względem próby ślepej przy długości fali
340 nm. Absorbancja jest stabilna przez 15 minut.
3
Opracowanie wyników:
Obliczyć wyniki wg następującego wzoru:
NORMY:
Surowica/osocze- 70-105 mg/dl (3,89-5,83 mmol/l)
Mocz- 5-15 mg/dl (0,28-0,83 mmol/l)
Do diagnozowania cukrzycy i lub osłabionej tolerancji glukozy (GT) WHO zaleca
następujące kryteria:
Krew żylna Cukrzyca na czczo =lub> 140 mg/dl
2 godz. po jedzeniu 200 mg/dl
Krew kapilarna Cukrzyca na czczo =lub> 140 mg/dl
2 godz. po jedzeniu 220 mg/dl
Krew żylna GT na czczo < 140 mg/dl
2 godz. po jedzeniu 140-200 mg/dl
Krew kapilarna GT na czczo < 140 mg/dl
2 godz. po jedzeniu 160-220 mg/dl
4
Oznaczanie stężenia glukozy w surowicy
metodą o-toluidynową
O-toluidyna (o-metyloanilina) w środowisku bezwodnym w temperaturze
100 C reaguje z furfuralowymi pochodnymi aldoz. W tych warunkach powstaje
barwny kompleks o zabarwieniu niebieskim. Natężenie barwy, proporcjonalne do
stężenia glukozy, mierzy się kolorymetrycznie. Metodą tą oznacza się także galaktozę
i mannozę. Fruktoza reaguje słabo w tych warunkach. Wpływ fruktozy i pentoz
pozostaje wyeliminowany przez dokonanie pomiaru przy długości fali 630 nm. W
metodzie tej przeszkadzają także leki zawierające grupę aldehydową. Znacznie
zawyżone wyniki uzyskuje się u pacjentów otrzymujących dekstran.
o
WYKONANIE ĆWICZENIA:
Materiał badany: Surowica
Odczynniki: 1. Odczynnik o-toluidynowy
2. Odczynnik odbiałczajacy – 10% kwas trójchlorooctowy (TCA)
3. Wzorcowe roztwory glukozy o stężeniach: 50, 100, 250, 500 i 1000 mg/dl
Uwaga
Odczynnik o-toluidynowy jest szkodliwy dla zdrowia (kancerogenny i żrący). Należy odmierzyć
go dozownikiem strzykawkowym, biuretą lub mikropipetą dozującą (wykonuje prowadzący
ćwiczenie). Od momentu dodania odczynnika o-toluidynowego należy zachować szczególną
ostrożność, w szczególności unikać wdychania par
1.
Przygotowanie prób wzorcowych.
W sześciu oznaczonych probówkach przygotować próby wzorcowe. Zawartość
probówki W1 traktować jako próbę odczynnikową. Odmierzyć składniki według poniższej
tabeli (objętości w ml):
Roztwory wzorcowe glukozy
Nr probówki
W1
W2
W3
W4
W5
W6
Woda
destylowana
0,6
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Odczynnik
odbiałczający
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
50 mg/dl
100 mg/dl
250 mg/dl
500 mg/dl
1000 mg/dl
0,1
-
0,1
-
0,1
-
0,1
-
0,1
5
Przygotowanie próby badanej.
2.
Do probówki wirówkowej odmierzyć następujące odczynniki (w ml):
woda destylowana
0,5
odczynnik odbiałczający 0,5
surowica
0,1
Zawartość probówki wymieszać. Próbkę ustawić na wadze szalkowej i zrównoważyć,
umieszczając na drugiej szalce pustą probówkę wirówkową i dopełniając ją wodą
destylowaną. Obie probówki umieścić naprzeciwlegle w wirówce. Wirować 10 min. przy
2000 obr/min. (wykonuje prowadzący ćwiczenie).
2.
Przygotowanie reakcji z odczynnikiem o-toluidynowym.
Do siedmiu czystych probówek odmierzyć składniki wg tabeli (objętości w ml):
Zawartość probówek z pkt. 1.
Numer
probówki
odczynnik
o-toluidynowy
1
2
3
4
5
6
B
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
supernatant
z próby
badanej
0,2
W1
W2
W3
W4
W5
W6
0,2
-
0,2
-
0,2
-
0,2
-
0,2
-
0,2
-
Wymieszać, probówki przykryć luźno folią aluminiową i wstawić do wrzącej łaźni wodnej
dokładnie na 8 minut. Po tym czasie próby ochłodzić w zimnej wodzie. Do każdej próbówki
dodać po 1 ml wody destylowanej, delikatnie wymieszać. Zmierzyć absorbancję prób
wzorcowych (probówki nr 2-6) i próby badanej (probówka B) względem próby
odczynnikowej (probówka nr 1) przy długości fali 630 nm.
3.
Wykonanie krzywej standardowej.
absorbancja
50
100
250
500
1000
stężenie glukozy
[mg/dl]
Na podstawie absorbancji dla prób wzorcowych (probówki nr 2-6) wykreślić krzywą
standardową i na tej podstawie określić stężenie glukozy w próbie badanej (probówka B).
6
ZAGADNIENIA DO ĆWICZENIA:
1. Hipoglikemia - definicja, przyczyny.
2. Hiperglikemia - definicja, przyczyny.
3. Cukrzyca: definicja, rodzaje. Leczenie.
3. Hormony regulujące stężenie glukozy we krwi.
4. Metody oznaczania glukozy (metody enzymatyczne, metoda kondensacyjna o-toluidynowa,
polarymetryczna, fermentacyjna, redukcyjna Nelsona).
LITERATURA:
1. Ćwiczenia z biochemii” Leokadia Kłyszejko-Stefanowicz,
Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003
2. ”Biochemia Harpera” Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, Victor
W. Rodwell, [(red.)] Franciszek Kokot
Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2002, wyd. 5
3. „Wybrane zagadnienia z biochemii ogólnej z ćwiczeniami” Teresa Kędryna, Maria
Gałka-Walczak, Barbara Ostrowska
Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 2001, wyd. 1
7