(Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS644
Transkrypt
(Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS644
FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human MUM1 Protein Klon MUM1p Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS644 Przeznaczenie Do badań diagnostycznych in vitro. Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human MUM1, klon MUM1p, Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus) jest przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Dako Autostainer/Autostainer Plus. Przeciwciało znakuje białko MUM1, które wykazuje ekspresję w podzbiorze limfocytów B w jasnej strefie ośrodka rozmnaŜania (odpowiadającym późnej fazie róŜnicowania limfocytów B), komórkach plazmatycznych, aktywowanych limfocytach T oraz w całej gamie pokrewnych nowotworów z tkanek chłonnych i krwiotwórczych. Spośród nowotworów niepochodzących z tkanek chłonnych i krwiotwórczych dodatni odczyn dają tylko niektóre czerniaki. Przeciwiciało jest przydatne np. do szczegółowej klasyfikacji złośliwości nowotworów z tkanki limfoidalnej (1, 2). Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych. Synonimy antygenu IRF4 (czynnik regulujący interferon 4), ICSAT (białko wiąŜące zgodną sekwencję interferonu w aktywowanych limfocytach T) i PIP (partner oddziaływania PU.1) (3). Podsumowanie i wyjaśnienie Białko MUM1 (onkogen szpiczaka mnogiego-1) to białko o masie cząsteczkowej 50 kD kodowane przez gen MUM1 pierwotnie zidentyfikowany w związku z jego uczestnictwem w rzadkiej translokacji t(6;14)(p25;q32) obserwowanej w szpiczaku mnogim, powodującej zestawienie genu MUM1 z pozycją odpowiadającą cięŜkiemu łańcuchowi immunoglobuliny (4, 5). W organizmach myszy z niedoborem białka MUM1 nie było moŜliwe tworzenie ośrodków rozmnaŜania, stwierdzano brak komórek plazmatycznych w śledzionie i blaszce właściwej jajnika oraz obserwowano wyraźny spadek poziomów immunoglobulin osocza i niezdolność do generowania wykrywalnej odpowiedzi przeciwciał lub odpowiedzi limfocytów T i odpowiedzi przeciwnowotworowej (1). Ekspresja białka MUM1 jest niezaleŜna od translokacji t(6;14) (p25;q32) i była wykrywana w komórkach szpiczaka mnogiego, chłoniakach typu LPL (limfoplazmocytalnych), chłoniakach rozlanych z duŜych limfocytów B (DLBCL) oraz aktywowanych limfocytach T. Białko MUM1 nie jest swoiste ze względu na róŜnicowanie do komórek plazmatycznych, ale moŜe zostać włączone do panelu markerów fenotypowych słuŜących do badania histogenezy chłoniaka z limfocytów B, a przy tym jest markerem uŜytecznym w szczegółowej klasyfikacji złośliwych nowotworów limfoidalnych, np. w B-CLL (1-3, 6). Ekspresja białka MUM1 ogranicza się do komórek linii limfocytarnych i melanocytarnych (5). Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody. Odczynnik dostarczony Gotowe do uŜycia mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym białko stabilizujące i azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L. Klon: MUM1p (1). Izotyp: IgG1, kappa. Immunogen Rekombinowane białko fuzyjne GST-MUM1 (1). Swoistość W teście Western blot lizatu komórek HeLa transfekowanych pHeBo-CMV-MUM1-HA przeciwciało barwi prąŜek odpowiadający masie 52 kDa, czyli białku MUM1-HA, natomiast w przypadku lizatów nietransfekowanych komórek HeLa nie obserwuje się barwienia. W testach Western blot lizatów IM9 (linii komórkowej szpiczaka), niefrakcjonowanych zawiesin komórek migdałków, oraz limfocytów T stymulowanych PHA przeciwciało barwi prąŜek odpowiadający masie 50 kDa, czyli białku MUM1. Nie stwierdzono barwienia w przypadku lizatów komórek U937 (linii komórkowej szpiczaka) i niestymulowanych limfocytów T (1). Analiza SDS-PAGE immunoprecypitatów wytwarzanych w reakcji przeciwciał z lizatami komórek z linii komórkowej szpiczaka IM9 wykazuje reakcję z białkiem 50 kDa odpowiadającym białku MUM1 (1). Środki ostroŜności 1. Do stosowania przez wyszkolony personel. 2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji. 3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować właściwe procedury postępowania. 4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne. 5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami. (117936-003) Dako Denmark A/S IS644/PL/MNI/2009.12.04 str. 1/3 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17 Przechowywanie Przechowywać w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, oraz gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Przygotowanie próbek oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm. Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8000/K8004). Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury wstępnej obróbki tkanek, zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8000/K8004). Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania. Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych, zalecane jest uŜycie odczynnika Dako PT Link i przeprowadzenie procedury opisane dla skrawków parafinowych. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŜy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania. W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych, zaleca się stosowanie szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Procedura barwienia oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010). Kolejne kroki barwienia oraz czasy inkubacji zaprogramowano wstępnie w oprogramowaniu aparatów Dako Autostainer/Autostainer Plus, przy uŜyciu następujących protokołów: Protokół wzorcowy: FLEXRTU2 (200 µL dozowanych odczynników) lub FLEXRTU3 (300 µL dozowanych odczynników) Autoprogram: MUM1 (bez barwienia kontrastowego) lub MUM1H (z barwieniem kontrastowym) Dla etapu „Auxiliary” naleŜy ustawić opcję „rinse buffer ” w programach barwienia ≤10 szkiełek. W przypadku programów barwienia >10 szkiełek etap Auxiliary naleŜy ustawić na „none”. Zapewnia to porównywalne czasy płukania. Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje zawiera instrukcja obsługi odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym aparacie Dako Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania i powinny być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. Aby moŜliwe było wykonanie oceny przez patologów z róŜnym nasileniem odczynu preparatów, naleŜy skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako w celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe – w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować okręŜnicę/wyrostek robaczkowy oraz migdałki, natomiast we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Mouse, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS750). Interpretacja wybarwienia W reakcji z przeciwciałem komórki dają odczyn ograniczony głównie do jądra, choć w większości przypadków dodatniemu odczynowi jądrowemu towarzyszy takŜe słaby do umiarkowanego odczyn cytoplazmatyczny (2). Charakterystyka działania Tkanki normalne: W tkankach migdałków i śledziony przeciwciało daje silny odczyn z komórkami plazmatycznymi i z 3 do 10% limfocytów B w ośrodkach rozmnaŜania (OR), zlokalizowanych głównie w strefie jasnej. Nieliczne komórki dodatnie na obecność białka MUM1 w strefie płaszcza to limfocyty B opuszczające OR i przemieszczające się przez strefę płaszcza grudek. Przeciwciało daje takŜe dodatni odczyn z 1-5% limfocytów T obecnych w OR i w obszarze międzygrudkowym. Nie zaobserwowano odczynu z makrofagami migdałków, komórkami dendrytycznymi grudek chłonnych, środbłonka i nabłonka. Odczyn ujemny dają takŜe komórki kory grasicy, rdzenia grasicy, ciałek Hassala oraz prekursory erytroidalne i szpikowe, megakariocyty, osteoblasty i osteoklasty (1). W dodatkowym badaniu 142 prawidłowych tkanek nielimfoidalnych, reprezentujących 33 typy tkanek, wszystkie tkanki dawały wynik ujemny w reakcji z przeciwciałem (2). Komórki plazmatyczne w okręŜnicy/wyrostku robaczkowym wykazują odczyn umiarkowany do silnego, natomiast aktywowane komórki B w migdałkach wykazują odczyn słaby do umiarkowanego. Tkanki patologiczne: W badaniu obejmującym liczne (N=210) i zróŜnicowane (18 typów) ludzkie nowotwory z tkanek krwiotwórczych i chłonnych przeciwciało dawało odczyn dodatni z wieloma róŜnymi chłoniakami z limfocytów B, limfocytów T i naturalnych komórek cytotoksycznych. Odczyn dodatni obserwowano we wszystkich badanych nowotworach z tkanek krwiotwórczych i chłonnych, z wyjątkiem chłoniaka Burkitta, komórek tucznych i zaburzeń histiocytarnych. Odczyn dodatni zaobserwowano w 56% wszystkich chłoniaków z limfocytów T i naturalnych komórek cytotoksycznych oraz w 35% wszystkich nowotworów z limfocytów B, przy czym odczyn był silny w przypadku szpiczaka mnogiego (100%), DLBCL (51%), chłoniaków strefy brzeŜnej (58%), LPL (50%), zaburzeń limfoproliferacyjnych (67%) i choroby Hodgkina (100%). Spośród 122 chłoniaków z grudek chłonnych przeciwciało dawało odczyn z 23% , tj. z 79% o stopniu złośliwości III i 21% o stopniach złośliwości I+II. Komórki zmienionych tkanek dające dodatni odczyn z przeciwciałem nie zawsze wykazywały róŜnicowanie do komórek plazmatycznych, co sugeruje, Ŝe ekspresja białka MUM1 moŜe poprzedzać ekspresję białek CD138 i VS38, będących bardziej (117936-003) Dako Denmark A/S IS644/PL/MNI/2009.12.04 str. 2/3 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17 swoistymi markerami róŜnicowania do komórek plazmatycznych. Spośród 731 nowotworów nielimfoidalnych, reprezentujących 20 róŜnych typów, przeciwciało dawało odczyn dodatni tylko z 5/22 czerniaków (2). Piśmiennictwo 1. Falini B, Fizzotti M, Pucciarini A, Bigerna B, Marafioti T, Gambacorta M, et al. A monoclonal antibody (MUM1p) detects expression of the MUM1/IRF4 protein in a subset of germinal center B cells, plasma cells, and activated T cells. Blood 2000;95:2084-92. 2. Natkunam Y, Warnke RA, Montgomery K, Falini B, van de Rijn M. Analysis of MUM1/IRF4 protein expression using tissue microarrays and immunohistochemistry. Mod Pathol 2001;14:686-94. Gaidano G, Carbone A. MUM1: a step ahead toward the understanding of lymphoma histogenesis. Leukemia 2000;14:563-6. Iida S, Rao PH, Butler M, Corradini P, Boccadoro M, Klein B, et al. Deregulation of MUM1/IRF4 by chromosomal translocation in multiple myeloma. Nat Genet 1997;17:226-30. Tsuboi K, Iida S, Inagaki H, Kato M, Hayami Y, Hanamura I, et al. MUM1/IRF4 expression as a frequent event in mature lymphoid malignancies. Leukemia 2000;14:449-56. Chang CC, Lorek J, Sabath DE, Li Y, Chitambar CR, Logan B, et al. Expression of MUM1/IRF4 correlates with clinical outcome in patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 2002;100:4671-5. 3. 4. 5. 6. Objaśnienie symboli Numer katalogowy Temperatura przechowywania ZuŜyć przed Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro Zawartość wystarcza na <n> testów Producent Sprawdzić w instrukcji stosowania Numer serii (117936-003) Dako Denmark A/S IS644/PL/MNI/2009.12.04 str. 3/3 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17