FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Beta-Catenin Klon β
Transkrypt
FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Beta-Catenin Klon β
FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Beta-Catenin Klon β-Catenin-1 Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS702 Przeznaczenie Do badań diagnostycznych in vitro. Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Beta-Catenin, klon β-catenin-1, Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus) jest przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Dako Autostainer/Autostainer Plus. Przeciwciała te są przydatne identyfikacji desmoidów (1) i raków jelita grubego (2). Przeciwciała przeciwko β-kateninie mogą być równieŜ uŜyteczne w identyfikacji gruczolaka okręŜnicy (3). Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne, z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych, i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa, z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych. Podsumowanie i wyjaśnienie Kateniny są to podobne do siebie pod względem struktury białka cytoplazmatyczne, zaliczane do kategorii alfa (α), beta (β) i gamma (γ), w zaleŜności od ich ruchliwości w elektroforezie (4, 5). Gen β-kateniny zlokalizowany jest na chromosomie 3p21 i koduje białko o masie 88 kD (4, 5). To białko cytoplazmatyczne ma charakter wielofunkcyjny odgrywa zasadniczą rolę w zachodzącym pod wpływem kadheryny mocowaniu i organizacji cytoszkieletu (4). Betakatenina bierze równieŜ udział w regulacji ekspresji genów, jako mediator szlaku sygnalizacji Wnt. StęŜenie β-kateniny w komórkach jest ściśle regulowane przez wielobiałkowy kompleks, zawierający kinazę serynową/treoninową GSK3β, produkt genu wywierającego działanie supresyjne na nowotwory APC i aksynę, która wspomaga fosforylację oraz będący jej skutkiem rozkład β-kateniny. Rozregulowanie rozkładu β-kateniny prowadzi do akumulacji białka w cytoplazmie, a następnie jego translokacji do jądra. Jądrowa β-katenina tworzy kompleksy białkami wiąŜącymi DNA, takimi jak TCF i LEF, powodując aktywację transkrypcji genów (6). Patrz dokument “Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych” firmy Dako lub następujące części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody. Odczynnik dostarczony Gotowe do uŜycia mysie przeciwciało monoklonalne jest dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym białko stabilizujące i azydek sodu w stęŜeniu 0,015 mol/L. Klon: β-catenin-1. Izotyp: Ig G1, kappa. Immunogen Rekombinowane C-końcowe białko fuzyjne β-katenina-GST (7). Swoistość W testach Western blot ludzkich komórek nabłonka A431, przeciwciało barwi prąŜek odpowiadający ludzkiemu białku - β-kateninie. Nie obserwowano reaktywności krzyŜowej z α i γ-kateniną (7). Środki ostroŜności 1. Do stosowania przez wyszkolony personel. 2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji. 3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować właściwe procedury postępowania. 4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne. 5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami. Przechowywanie Przechowywać w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta, naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Przygotowanie próbek oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm. Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8010/K8004). (119498-001) Dako Denmark A/S IS702/PL/SSM/2009.02.02 str. 1/2 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17 Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury wstępnej obróbki tkanek, zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8010/K8004). Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania. Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych, zalecane jest uŜycie odczynnika Dako PT Link i przeprowadzenie procedury opisanej dla skrawków parafinowych. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŜy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania. W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych, zaleca się stosowanie szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Procedura barwienia oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX+, High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010). Kolejne kroki barwienia oraz czasy inkubacji zaprogramowano wstępnie w oprogramowaniu aparatów Dako Autostainer/Autostainer Plus, przy uŜyciu następujących protokołów: Protokół wzorcowy: FLEXRTU2 (200 µL dozowanych odczynników) lub FLEXRTU3 (300 µL dozowanych odczynników) Autoprogram: BETACAT (bez barwienia kontrastowego) lub BETACATH (z barwieniem kontrastowym) Dla etapu „Auxiliary” naleŜy ustawić opcję „rinse buffer ” w programach barwienia ≤10 szkiełek. W przypadku programów barwienia >10 szkiełek etap Auxiliary naleŜy ustawić na „none”. Zapewnia to porównywalne czasy płukania. Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje zawiera instrukcja obsługi odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym aparacie Dako Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania, i powinny być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. Aby moŜliwe było wykonanie oceny przez patologów z róŜnym nasileniem odczynu preparatów, naleŜy skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako, w celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe – w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów, naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować okręŜnicę i wątrobę, natomiast komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki, jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa” we wszystkich dodatnich preparatach. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Mouse, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS750). Interpretacja wybarwienia Komórki znakowane przez przeciwciała wykazują odczyn błonowy. Komórki nowotworowe mogą wykazywać zarówno wzór odczynu cytoplazmatycznego, jak i jądrowego. Charakterystyka działania Tkanki normalne: W okręŜnicy komórki nabłonka wykazują odczyn z zakresu od umiarkowanego do silnego. W wątrobie, hepatocyty wykazują odczyn z zakresu od słabego do umiarkowanego. Tkanki patologiczne: Przeciwciało dało odczyn w przypadku 24/30 sporadycznych desmoidów i 8/12 desmoidów u pacjentów z rodzinną polipowatością gruczołową (1). W badaniach z uŜyciem mikromacierzy tkanki raka jelita grubego, 657/1310 przypadków wykazało odczyn jądrowy, 1068/1310 wykazało odczyn cytoplazmatyczny i 1107/1310 wykazało odczyn błonowy (2). Przeciwciało znakowało 1/1 przypadków gruczolaka okręŜnicy. Piśmiennictwo 1. Carlson JW, Fletcher CDM. Immunohistochemistry for β-catenin in the differential diagnosis of spindle cell lesions: analysis of a series and review of the literature. Histopathol 2007;51:509-14. 2. Lugli A, Zlobec I, Minoo P, Baker K, Tornillo L, Terracciano L, et al. Prognostic significance of the wnt signalling pathway molecules APC, β-catenin and E-cadherin in colorectal cancer-a tissue microarray-based analysis. Histopathol. 2007;50:453-64. 3. Iwamoto M, Ahnen DJ, Franklin WA, Maltzman TH. Expression of β-catenin and full-length APC protein in normal and neoplastic colonic tissue. Carcinogenesis 2000;21:1935-40. 4. Bracke ME, Van Roy FM, Mareel MM. The E-cadherin/catenin complex in invasion and metastasis. Cur Top Microbiol Immunol 1996; 213 (Pt 1):123-61. 5. Ozawa M, Baribault H, Kemler R. The cytoplasmic domain of the cell adhesion molecule uvomorulin associates with three independent proteins structurally related in different species. EMBO J 1989;8:1711-7. 6. Willert K, Nusse R. Curr Opin Genet Dev 1998;8:95-102. 7. Antibody Certification. On file at DakoCytomation Corporation. Objaśnienie symboli N ume r ka ta log owy Tempe ratura prze chow ywan ia Zu Ŝyć p rzed Wyró b medyczny do d ia gno styki in vi tro Zawa rto ść w ysta rcza na <n> testów Produ cent S prawd zić w instrukcj i sto sowa nia Nu mer serii (119498-001) Dako Denmark A/S IS702/PL/SSM/2009.02.02 str. 2/2 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17