COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test

Transkrypt

COBAS® AMPLICOR®
Chlamydia trachomatis Test
CT
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
Informacje dotyczące
zamówienia
AMPLICOR® CT/NG
Specimen Preparation Kit
CT/NG PREP 100 Tests
AMPLICOR® CT/NG
Amplification Kit
CT/NG AMP
96 Tests
P/N: 20759902 122
ART: 07 5990 2
US: 83319
CT DK
100 Tests
P/N: 20757497 122
ART: 07 5749 7
US: 83277
COBAS® AMPLICOR®
Detection Reagents Kit
DK
100 Tests
P/N: 20757470 122
ART: 07 5747 0
US: 83276
COBAS® AMPLICOR®
Wash Buffer
WB
500 Tests
P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
COBAS® AMPLICOR®
Chlamydia trachomatis
Detection Kit
P/N: 20759414 122
ART: 07 5941 4
US: 83315
Poniższy zestaw stosować można do detekcji Neisseria gonorrhoeae w próbkach
amplifikowanych przy użyciu AMPLICOR® CT/NG Amplification Kit. Detekcja
Neisseria gonorrhoeae jest opcjonalna dla użytkownika.
COBAS® AMPLICOR®
Neisseria gonorrhoeae
Detection Kit
NG DK
100 Tests
P/N: 20757535 122
ART: 07 5753 5
US: 83278
Poniższy zestaw stosować można do detekcji kontroli wewnętrznej CT/NG
amplifikowanej przy użyciu zestawu AMPLICOR® CT/NG Amplification Kit.
Detekcja kontroli wewnętrznej CT/NG jest opcjonalna dla użytkownika przy badaniu
próbek moczu lub wymazów pobranych na transportowe podłoże hodowlane dla
chlamydii. Detekcja kontroli wewnętrznej jest obowiązkowa przy badaniu wymazów
pobranych i transportowanych przy użyciu AMPLICOR® STD Swab Specimen
Collection and Transport Kit.
COBAS® AMPLICOR®
Internal Control Detection Kit
IC DK
100 Tests
P/N: 20757608 122
ART: 07 5760 8
US: 83281
AMPLICOR® STD
Swab Specimen Collection
and Transport Kit
6/2007, Revision 6.0
STD SWAB
COBAS® AMPLICOR® Chlamydia trachomatis Test
50 Tests
P/N: 20753920 122
ART: 07 5392 0
US: 83075
1/36
P/N: 04497309 190
Następującego zestawu można użyć do pobierania i transportu wymazów
z kanału szyjki macicy i cewki moczowej.
Przeznaczenie
COBAS® AMPLICOR® Chlamydia trachomatis (CT) Test jest testem do
jakościowej detekcji in vitro DNA C. trachomatis w próbkach klinicznych przy
użyciu analizatora COBAS® AMPLICOR®. Do detekcji C. trachomatis w próbkach
z dróg moczowo-płciowych test ten wykorzystuje reakcję łańcuchowej polimerazy
(PCR), oraz technikę amplifikacji i hybrydyzacji kwasów nukleinowych.
Podsumowanie i objaśnienie testu
Chlamydie są to Gram-ujemne, nieruchome bakterie, występujące jako
obligatoryjny wewnątrzkomórkowy pasożyt komórek eukariotycznych z uwagi na
swą niezdolność do syntezy ATP. Rodzaj Chlamydia obejmuje cztery opisane
dotychczas gatunki: C. trachomatis, C. psittaci, C. pecorum oraz C. pneumoniae
(TWAR). C. psittaci i C. pecorum są patogenami spotykanymi głównie
u zwierząt1-3.
Zakażenia C. trachomatis są obecnie drugą co do częstości przyczyną schorzeń
przenoszonych drogą płciową (STD, sexually transmitted diseases) w populacji
ogólnoświatowej przy zapadalności wynoszącej około 89,1 miliona przypadków
rocznie4. Częstość występowania w Stanach Zjednoczonych wynosi około 3
milionów przypadków rocznie5. C. trachomatis powoduje zapalenie szyjki macicy,
zapalenie narządów miednicy mniejszej (Pelvic Inflammatory Disease, PID),
niemowlęce zapalenie spojówek, niemowlęce zapalenie płuc, zapalenie cewki
moczowej, zapalenie najądrza oraz zapalenie odbytu1,6. C. trachomatis jest też
najczęstszą przyczyną (około 25-55% przypadków) niegonokokowego zapalenia
cewki moczowej (NGU, non-gonococcal urethritis) u mężczyzn. U kobiet
konsekwencje zakażenia chlamydiami są poważne w przypadku braku leczenia.
Około 3 czwartych zakażeń jest bezobjawowych, dlatego też wiele przypadków
pozostaje nierozpoznanych i nieleczonych, co prowadzi do dodatkowych problemów,
szczególnie u kobiet ciężarnych. U dzieci urodzonych przez kobiety z zakażeniem
chlamydiami występuje wysokie ryzyko rozwoju wtrętowego zapalenia spojówek
i zapalenia płuc.
Dostępnych jest kilka metod wykrywania C. trachomatis w próbkach klinicznych.
Metody te obejmują bezpośrednie barwienie zakażonych tkanek metodą Giemsy,
wykrywanie chlamydiowych ciał wtrętowych w hodowlach zakażonych komórek
przy użyciu barwienia z użyciem testów immunofluorescencyjnych, metody
immunofluorescencji bezpośredniej oraz sondy kwasów nukleinowych1,7-9.
Hodowla komórkowa wykazuje dużą swoistość, ale jej czułość w rutynowej
praktyce klinicznej wynosi poniżej 100%. Ponieważ hodowla chlamydii nie ma
100% czułości zaproponowano, aby w celu identyfikacji zakażonych próbek,
których nie rozpoznano przy użyciu hodowli, stosować kilka testów niehodowlanych10. Metody badania nieoparte na hodowlach komórkowych stosuje się
celem identyfikacji składników mikroorganizmu (białka lub kwasy nukleinowe)
uważanych za swoiste dla drobnoustrojów zakaźnych. Metody te mogą wykryć
dodatkowe zakażenia w próbkach, których nie wykryto w hodowli komórkowej.
Ponieważ swoistość tych metod wynosi poniżej 100%, zalecono weryfikację
antygenów lub kwasów nukleinowych C. trachomatis metodą alternatywną
(działanie zalecone przez CDC w roku 1993)4.
Zasady procedury
COBAS® AMPLICOR® CT Test oparty jest na czterech głównych procesach:
przygotowanie próbki; amplifikacja PCR11,12 docelowego DNA przy użyciu
komplementarnych primerów swoistych dla CT; hybrydyzacja produktów
amplifikacji z sondami oligonukleotydowymi swoistymi dla elementu (elementów)
docelowego; oraz detekcja produktów amplifikacji związanych z sondami na drodze
reakcji barwnej.
2/36
Opracowanie testu PCR obejmuje identyfikację określonego regionu docelowego
DNA, który ma być poddany amplifikacji oraz syntezę dwóch krótkich,
biotynylowanych, oligonukleotydowych primerów, komplementarnych do
fragmentów DNA otaczających sekwencję docelową. Biotynylowane primery wiążą
się z komplementarnym fragmentem DNA otaczającym sekwencję docelową,
a polimeraza DNA wydłuża ich sekwencję w kierunku 5' do 3', używając nadmiaru
trójfosforanów dezoksynukleotydów (dNTPs) w mieszaninie reakcyjnej, tworząc
biotynylowaną, komplementarną sekwencję DNA określaną jako amplikon. Swoista
dla amplikonu oligonukleotydowa sonda, związana z trwałym podłożem
(mikrocząsteczki) wykorzystywana jest do hybrydyzacji (związania) amplikonu.
Układ detekcji w omawianym teście wykorzystuje koniugat awidyny z peroksydazą
chrzanową (HRP, horseradish peroxidase), który łączy się z biotynylowanym
amplikonem związanym na powierzchni mikrocząsteczek. Do reakcji barwnej
stosuje się substrat, jakim jest nadtlenek wodoru oraz chromofor w postaci
tetrametylobenzydyny (TMB).
COBAS® AMPLICOR® CT Test jest testem złożonym pozwalającym na
równoczesną amplifikację docelowego DNA C. trachomatis, docelowego DNA
N. gonorrhoeae oraz DNA kontroli wewnętrznej CT/NG (CT/NG IC). Odczynnik
Master Mix zawiera pary biotynylowanych primerów swoistych dla C. trachomatis,
N. gonorrhoeae oraz CT/NG IC. Detekcja zamplifikowanego DNA N. gonorrhoeae
jest opcjonalna i zależna od użytkownika. Przy badaniu próbek wymazów
pobranych i transportowanych przy użyciu zestawu do pobierania i transportu
wymazów AMPLICOR® STD Swab Specimen Collection and Transport Kit musi
być wykonywana detekcja kontroli wewnętrznej CT/NG IC. Detekcję kontroli
wewnętrznej CT/NG IC można wykonać według opcji użytkownika przy badaniu
próbek lub wymazów pobranych i transportowanych na pożywkach transportowych
dla Chlamydii.
Przygotowanie próbki
Komórki nabłonka dróg moczowo-płciowych pobrane w trakcie wymazu lub
odwirowane z moczu poddaje się działaniu roztworu detergentu w celu uwolnienia
DNA chlamydii zawartego w ciałkach siateczkowatych. Kolejny roztwór detergentu
dodaje się w celu przygotowania lizatu próbki do amplifikacji.
Amplifikacja PCR
Wybór sekwencji docelowej
Poza chromosomalnym DNA, C. trachomatis zawiera dodatkowo plazmid utajony
o wielkości około 7500 par zasad wspólny dla wszystkich typów serologicznych
C. trachomatis13,14. W COBAS® AMPLICOR® CT Test wykorzystano primery
CP24 i CP27 w celu określenia sekwencji DNA o długości około 208 nukleotydów
wewnątrz plazmidu utajonego C. trachomatis.
Amplifikacja sekwencji docelowej
Poddane obróbce próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach
do amplifikacji (A-tubes), gdzie zachodzi amplifikacja PCR. Mieszaninę reakcyjną
podgrzewa się w celu denaturacji dwuniciowej helisy DNA i odsłonięcia swoistych
sekwencji docelowych primerów w obrębie plazmidu utajonego C. trachomatis. Po
ochłodzeniu się mieszaniny, biotynylowane primery CP24 i CP27 wtapiają się do
docelowej nici DNA. Termostabilna polimeraza DNA z Thermus aquaticus (Taq
pol) w obecności nadmiaru trójfosforanów dezoksynukleotydów (dNTP), w tym
trójfosforanu
dezoksyadenozyny,
dezoksyguanozyny,
dezoksycytydyny
i dezoksyurydyny (zamiast dezoksytymidyny), wydłuża wtopione primery wzdłuż
wzorcowych nici docelowego DNA tworząc cząsteczkę dwuniciowego DNA
składającą się z 208 par zasad, określaną jako amplikon. Analizator COBAS®
AMPLICOR® automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę
cykli, w każdym z nich podwajając teoretycznie ilość DNA amplikonu.
Amplifikacja kontroli wewnętrznej
W procesach amplifikacji wykorzystujących enzymy, takich jak PCR, zawartość
w próbce klinicznej inhibitorów może skutkować zmniejszoną wydajnością
amplifikacji. Kontrola wewnętrzna CT/NG umożliwia identyfikację poddanych
obróbce próbek zawierających substancje, które mogą zakłócać amplifikację
3/36
PCR. Kontrola wewnętrzna CT/NG jest to niezakaźny, rekombinowany plazmid
DNA z regionami wiążącymi primery identycznymi jak te w sekwencji docelowej
C. trachomatis, losową sekwencją wewnętrzną o podobnej długości i składzie
zasad jak sekwencja docelowa C. trachomatis, oraz unikalnym regionem
wiążącym sondy różnicującym amplikon kontroli wewnętrznej CT/NG od
amplikonu docelowego. Powyższe cechy wybrano, aby zapewnić równoważną
amplifikację DNA kontroli wewnętrznej CT/NG i C. trachomatis. AMPLICOR®
CT/NG Amplification Kit zawiera odczynnik kontroli wewnętrznej CT/NG, który
wprowadza się do każdej reakcji amplifikacji celem równoczesnej amplifikacji
z docelowym DNA z próbki klinicznej. Opcjonalny zestaw COBAS®
AMPLICOR® Internal Control Detection Kit zawiera oligonukleotydową sondę
wychwytującą swoistą dla kontroli wewnętrznej, której można użyć do
identyfikacji dodatniego sygnału w mieszaninie reakcyjnej pochodzącego od
kontroli wewnętrznej. Kontrola wewnętrzna CT/NG ma za zadanie identyfikację
próbek zawierających substancje hamujące, które w oparciu o analizę Poissona
zakłócają amplifikację i detekcję 20 lub więcej kopii docelowego kwasu
nukleinowego C. trachomatis. Detekcja CT/NG IC jest opcjonalna dla
użytkownika przy badaniu próbek moczu lub wymazów pobranych
i transportowanych na transportowych podłożach hodowlanych dla Chlamydii.
Przy badaniu wymazów pobranych i transportowanych przy użyciu
AMPLICOR® STD Swab Specimen Collection and Transport Kit konieczne jest
wykonywanie detekcji CT/NG IC.
Amplifikacja wybiórcza
Amplifikację wybiórczą badanego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej przy
użyciu COBAS® AMPLICOR® CT Test uzyskuje się dzięki zastosowaniu enzymu
AmpErase (uracylo-N-glikozylaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dUTP). Enzym
AmpErase rozpoznaje i katalizuje rozkład nici DNA zawierających dezoksyurydynę15,
nie wpływając na nici DNA zawierające dezoksytymidynę. Dezoksyurydyna nie
wchodzi w skład występującego w naturze DNA, jest natomiast zawsze obecna
w amplikonie z uwagi na użycie trójfosforanu dezoksyurydyny w miejsce
trójfosforanu dezoksytymidyny jako jednego z dNTPs w odczynniku Master Mix;
dlatego też wyłącznie amplikon zawiera dezoksyurydynę. Dezoksyurydyna powoduje
wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed
amplifikacją docelowego DNA. Enzym AmpErase zawarty w odczynniku Master Mix
katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt
dezoksyurydynowych przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy w pozycji C1.
Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym w pH zasadowym odczynnika
Master Mix, łańcuch amplikonu DNA pęka w pozycji dezoksyurydyny, w ten sposób
wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w
temperaturach powyżej 55°C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, dlatego
też nie niszczy on amplikonu docelowego. Po amplifikacji całość pozostałego enzymu
ulega denaturacji poprzez dodanie roztworu denaturującego, zapobiegając w ten
sposób degradacji dowolnego amplikonu docelowego. Wykazano, że enzym
AmpErase w COBAS® AMPLICOR® CT Test inaktywuje w czasie jednej reakcji PCR
przynajmniej 103 kopii amplikonu C. trachomatis zawierającego dezoksyurydynę.
Reakcja hybrydyzacji
4/36
Po amplifikacji PCR analizator COBAS® AMPLICOR® automatycznie dodaje
roztwór denaturujący do probówek A-tube w celu chemicznej denaturacji amplikonu
CT oraz amplikonu kontroli wewnętrznej CT/NG i uzyskania jednoniciowego DNA.
Próbki zdenaturowanego amplikonu przenosi się następnie do naczyniek używanych
do oznaczeń (D-cups). Do poszczególnych naczyniek D-cup dodaje się zawiesiny
magnetycznych cząsteczek pokrytych sondą oligonukleotydową swoistą dla
C. trachomatis (lub kontroli wewnętrznej, w zależności od opcji wybranej przez
użytkownika). Znakowane biotyną amplikony CT i kontroli wewnętrznej CT/NG
ulegają hybrydyzacji ze swoistymi dla badanego materiału sondami
oligonukleotydowymi związanymi z cząsteczkami magnetycznymi. Hybrydyzacja
amplikonu ze swoistą dla badanego materiału sondą zwiększa ogólną swoistość testu.
Reakcja detekcji
Po reakcji hybrydyzacji analizator COBAS® AMPLICOR® przemywa cząsteczki
magnetyczne w naczyńkach D-cup w celu usunięcia niezwiązanego materiału,
a następnie dodaje koniugat peroksydazy chrzanowej z awidyną. Koniugat
peroksydazy chrzanowej z awidyną wiąże się ze znakowanymi biotyną
amplikonami, które uległy hybrydyzacji ze swoistymi dla badanego materiału
sondami oligonukleotydowymi związanymi z cząsteczkami magnetycznymi.
Analizator COBAS® AMPLICOR® usuwa niezwiązany kompleks, płucząc
cząsteczki magnetyczne, a następnie do każdego naczyńka D-cup dodaje roztwór
substratów zawierający nadtlenek wodoru oraz 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę
(TMB). W obecności nadtlenku wodoru peroksydaza chrzanowa związana
z cząsteczkami katalizuje utlenianie TMB, tworząc barwny kompleks, którego
absorbancję mierzy analizator COBAS® AMPLICOR® przy długości fali 660 nm.
Odczynniki
AMPLICOR® CT/NG
CT/NG PREP 100 testów P/N: 20759414 122
ART: 07 5941 4
Zestaw do przygotowywanie próbek
US: 83315
AMPLICOR® CT/NG
CT/NG URINE WASH
(CT/NG bufor płuczący do próbek moczu)
Bufor Tris-HCl
300 mM chlorek sodu
< 0,1% detergent
0,09% azydek sodu
1 x 50 ml
CT/NG LYS
(CT/NG odczynnik lizujący)
Bufor Tris-HCl
< 1% środek zwiększający rozpuszczalność
0,09% azydek sodu
1 x 25 ml
CT/NG DIL
(CT/NG rozcieńczalnik do próbek)
Bufor Tris-HCl
6 mM chlorek magnezu
< 25% detergent
0,05% azydek sodu
2 x 50 ml
AMPLICOR® CT/NG
CT/NG AMP
Amplification Kit
AMPLICOR® CT/NG zestaw do amplifikacji
96 testów P/N: 20759902 122
ART: 07 5990 2
US: 83319
CT/NG MMX
3 x 1,8 ml
(CT/NG Master Mix)
Bufor Tris-HCl
EDTA
100 mM chlorek potasu
Glicerol
< 0,016% dUTP
< 0,01% AmpliTaq® (Taq polimeraza DNA, bakteryjna)
< 0,005% dATP, dCTP, dGTP
< 0,01% enzym AmpErase (uracylo-N-glikozylaza) (bakteryjny)
< 0,0004% primery SS01, SS02, CP24 i CP27, biotynylowane
0,05% azydek sodu
5/36
CT/NG IC
3 x 0,1 ml
(CT/NG kontrola wewnętrzna)
Bufor Tris-HCl
< 0,001% niezakaźny, rekombinowany plazmid DNA (bakteryjny)
zawierający sekwencje wiążące primer CT oraz unikalny
region wiążący sondę
< 0,005% Poly rA RNA (syntetyczny)
EDTA
Barwnik amarantowy
0,05% azydek sodu
CT (+) C
1 x 0,8 ml
[C. trachomatis kontrola (+)]
Bufor Tris-HCl
zawierający sekwencje C. trachomatis
< 0,5% detergent
EDTA
0,05% azydek sodu
NG (+) C
1 x 0,8 ml
[C. trachomatis kontrola (–)]
Bufor Tris-HCl
zawierający sekwencje N. gonorrhoeae
< 0,5% detergent
EDTA
0,05% azydek sodu
COBAS® AMPLICOR®
CT DK
Detection Kit
COBAS® AMPLICOR® zestaw do detekcji
100 testów P/N: 20757497 122
ART: 07 5749 7
US: 83277
CT PS1
1 x 100 testów
(Zawiesina sondy CT nr 1)
Bufor MES
< 0,3% zawiesina Dynabeads® (cząsteczek paramagnetycznych)
pokrytych oligonukleotydową sondą wychwytującą CP35
swoistą dla C. trachomatis
0,9% azydek sodu
CT4
Bufor fosforanu sodu
25% tiocyjanian sodu
< 0,2% środek zwiększający rozpuszczalność
25% (udział wagowy) tiocyjanian sodu
+
Xn
1 x 100 testów
Produkt szkodliwy
6/36
COBAS® AMPLICOR®
100 testów P/N: 20757470 122
DK
ART: 07 5747 0
COBAS® AMPLICOR® zestaw odczynników do detekcji US: 83276
DN4
(Roztwór denaturujący)
1,6% wodorotlenek sodu
EDTA
Błękit tymolowy
1,6% (udział wagowy) wodorotlenek sodu
+
Xi
1 x 100 testów
Produkt drażniący
CN4
(Koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej)
Bufor Tris-HCl
< 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy
Chrzanowej albumina surowicy wołowej (ssacza)
Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.)
0,1% fenol
1% substancja konserwująca ProClin® 150
1 x 100 testów
SB3
(Substrat A)
Roztwór kwasu cytrynowego
0,01% nadtlenek wodoru
0,1% substancja konserwująca ProClin® 150
5 x 75 testów
SB
(Substrat B)
0,1% 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB)
40% dimetyloformamid (DMF)
5 x 5 ml
T
40% (udział wagowy) dimetyloformamid (DMF)
Produkt toksyczny
R: 61-20/21-36
Może działać szkodliwie na dziecko w łonie
matki. Działa szkodliwie przez drogi
oddechowe i w kontakcie ze skórą. Działa
drażniąco na oczy.
S: 53-45
Unikać narażenia - przed użyciem zapoznać
się z instrukcją. W przypadku awarii lub
jeżeli źle się poczujesz, niezwłocznie
zasięgnij porady lekarza - jeżeli to możliwe,
pokaż etykietę.
7/36
COBAS® AMPLICOR®
WB
Wash Buffer
COBAS® AMPLICOR® Bufor płuczący
500 testów P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
WB
(10X – koncentrat płuczący)
< 2% bufor fosforanowy
< 9% chlorek sodu
EDTA
< 2% detergent
0,5% substancja konserwująca ProClin® 300
2 x 250 testów
Ostrzeżenia i środki ostrożności
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Używany w niniejszej instrukcji użytkowania termin kopia odnosi się do 1 kopii
docelowego kwasu nukleinowego C. trachomatis. Jedna (1) kopia jest
równoważna najmniejszej ilości docelowego kwasu nukleinowego
C. trachomatis, która daje dodatni wynik testu PCR.
Test ten używany jest wyłącznie z próbkami pobranymi z kanału szyjki macicy,
cewki moczowej oraz próbkami moczu. Test nie jest przeznaczony do stosowania
z próbkami pobranymi z gardła, odbytnicy ani próbkami innymi niż wymienione.
Nie pipetować za pomocą ust.
Nie jeść, nie pić oraz nie palić w laboratorium, w obszarach roboczych. W czasie
pracy w próbkami i odczynnikami z zestawów należy stosować jednorazowe
rękawice bezpudrowe, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu.
Dokładnie umyć ręce po obchodzeniu się z próbkami i odczynnikami testowymi.
Unikać skażenia odczynników bakteriami podczas pobierania równych objętości
z butelek z odczynnikami. Zaleca się stosowanie jałowych, jednorazowych pipet
oraz końcówek pipet.
Nie mieszać odczynników pochodzących z różnych serii lub różnych butelek tej
samej serii.
Wyrzucić wszystkie nieużyte odczynniki, postępując zgodnie z przepisami
krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi.
Nie używać zestawu po upływie daty przydatności.
Karty charakterystyki bezpieczeństwa materiału (MSDS, Material Safety Data
Sheets) dostępne są na żądanie w lokalnym przedstawicielstwie firmy Roche.
Praca w laboratorium musi zachodzić w sposób jednokierunkowy, z początkiem
w obszarze przedamplifikacyjnym i z jednokierunkowym ruchem w stronę
obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Czynności przed procesem
amplifikacji muszą zaczynać się od przygotowania odczynników, a następnie
przygotowania próbki. Materiały i wyposażenie muszą być przeznaczone
wyłącznie do określonej czynności przed procesem amplifikacji i nie wolno
używać ich do innych czynności ani przemieszczać między obszarami.
W każdym z obszarów konieczne jest używanie rękawiczek, które należy zmienić
przed opuszczeniem danego obszaru. Wyposażenie i materiały zastosowane do
przygotowania odczynnika nie mogą być używane podczas czynności
związanych z przygotowywaniem próbki lub pipetowaniem albo obróbką
zamplifikowanego DNA lub innych źródeł docelowego DNA. Materiały
i urządzenia używane w czynnościach po amplifikacji muszą pozostawać zawsze
w obszarze poamplifikacyjnym.
8/36
Z próbkami należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym, stosując
laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak określone w Biosafety in
Microbiological and Biomedical Laboratories16 oraz w CLSI Document
M29-A317. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie powierzchnie robocze świeżo
przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub
destylowanej.
Uwaga
Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zawiera zazwyczaj podchloryn
sodu w stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10
przyniesie 0,5% roztwór podchlorynu sodu.
Badanie próbek otrzymanych przez laboratorium z wacikiem pozostawionym
w AMPLICOR® STM jest niedopuszczalne. Próbki te należy wyrzucić i pobrać
nowe.
Próbki pobrane i transportowane w wymazie w zestawie do pobierania
i transportu próbek AMPLICOR® STD Swab Specimen Collection and
Transport Kit mogą hamować reakcję PCR. Przy badaniu tych próbek musi być
przeprowadzana detekcja kontroli wewnętrznej CT/NG IC.
W przypadku próbek transportowanych na transportowym podłożu
hodowlanym dla chlamydii, waciki należy pozostawić w probówce z podłożem
transportowy, aby zapewnić wizualne potwierdzenie inokulacji próbki. COBAS®
AMPLICOR® CT/NG Test dla Chlamydia trachomatis badano przy użyciu
próbek transportowanych w postaci wacika umieszczonego w probówce
transportowego podłoża hodowlanego dla chlamydii (CTM, culture transport
medium). Nie oceniano próbek CTM transportowanych bez wacików i nie zaleca
się stosowania tego rodzaju próbek z niniejszym testem.
Przechowywanie próbek moczu w temperaturze pokojowej przez ponad 24
godziny może spowodować degradację próbki. Próbek moczu przechowywanych
przez ponad 24 godziny w temperaturze pokojowej nie należy używać do testów.
CT/NG URINE WASH, CT/NG LYS, CT/NG DIL, CT/NG MMX, CT/NG
IC, CT (+) C, NG (+) C, CT PS1 oraz IC PS1 zawierają azydek sodu. Azydek
sodu może wchodzić w reakcje z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi
wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali.
Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy
spłukać rury dużą objętością wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków.
W czasie pracy z DN4, CN4, SB3, SB oraz substratem roboczym (mieszanina
odczynników SB3 i SB) należy nosić okulary ochronne, fartuchy laboratoryjne i
jednorazowe rękawice bezpudrowe. Unikać kontaktu wymienionych materiałów
ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, natychmiast
spłukać dużą objętością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki
może dojść do oparzeń. W razie rozlania powyższych odczynników, przed
wytarciem plam należy rozcieńczyć je wodą.
Należy unikać kontaktu SB i substratu roboczego ze skórą i błonami śluzowymi.
Jeżeli dojdzie do kontaktu ze skórą, natychmiast spłukać dużą objętością wody.
Dimetyloformamid zawarty w SB i substracie roboczym może działać szkodliwe
na płód w łonie matki; opisywano ponadto działania toksyczne po doustnym
przyjęciu dużych dawek. Należy unikać kontaktu ze skórą, wdychania oparów
oraz spożycia. Jeżeli dojdzie do kontaktu ze skórą, dokładnie spłukać za pomocą
mydła i wody oraz natychmiast zwrócić się o pomoc medyczną.
Do przygotowywania próbek oraz kontroli należy używać probówek z zakręcanym
korkiem, aby zapobiegać rozlaniu i możliwości skażenia krzyżowego próbek. Nie
należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym.
9/36
Wymagania dotyczące przechowywania
i obchodzenia się
Nie zamrażać odczynników.
Przechowywać CT/NG LYS w temperaturze 2-25°C. Przechowywać CT/NG
URINE WASH i CT/NG DIL w temperaturze 2-8°C. W przypadku powstania
osadu podczas przechowywania powyższych odczynników, należy je ogrzać do
temperatury otoczenia i dokładnie wymieszać przed użyciem. Odczynniki te
zachowują stabilność do podanej daty przydatności.
Przechowywać CT/NG MMX i CT/NG IC w temperaturze 2-8°C. Odczynniki te
zachowują stabilność do podanej daty przydatności. Roboczy odczynnik Master
Mix (przygotowany przez dodanie CT/NG IC do CT/NG MMX) musi być
przechowywany w temperaturze 2-8°C; zachowuje stabilność przez 4 tygodnie.
Przechowywać CT (+) C i NG (+) C w temperaturze 2-8°C. Odczynniki te
zachowują stabilność do podanej daty przydatności.
Przechowywać CT PS1 i CT4 w temperaturze 2-8°C. Odczynniki te zachowują
stabilność do podanej daty przydatności. Po zmieszaniu CT PS1 i CT4 odczynnik
roboczy zachowuje stabilność przez 30 dni w temperaturze 2-8°C. Odczynnik
roboczy może być używany maksymalnie przez 6 cykli pracy urządzenia
(12 godzin na cykl) i pomiędzy poszczególnymi cyklami musi być przechowywany
w temperaturze 2-8°C.
DN4 należy przechowywać w temperaturze 2-25°C. DN4 zachowuje stabilność do
podanej daty przydatności. Po otwarciu DN4 zachowuje stabilność przez 30 dni
w temperaturze 2-8°C lub do daty przydatności (zależnie od tego, która data jest
wcześniejsza). DN4 może być stosowany maksymalnie przez 6 cykli pracy
analizatora (12 godzin na cykl), a pomiędzy poszczególnymi cyklami musi być
przechowywany w temperaturze 2-8°C.
CN4 należy przechowywać w temperaturze 2-8°C. CN4 zachowuje stabilność do
podanej daty przydatności. Po otwarciu odczynnik CN4 zachowuje stabilność przez
30 dni w temperaturze 2-8°C lub do daty przydatności (zależnie od tego, która data
jest wcześniejsza). CN4 może być stosowany maksymalnie przez 6 cykli pracy
analizatora (12 godzin na cykl), a pomiędzy poszczególnymi cyklami musi być
przechowywany w temperaturze 2-8°C.
SB3 i SB należy przechowywać w temperaturze 2-8°C. Jeżeli nie zostały otwarte,
odczynniki te zachowują stabilność do podanej daty przydatności. Substrat roboczy
musi być przygotowywany codziennie poprzez zmieszanie SB3 z SB. Substrat
roboczy zachowuje trwałość w analizatorze COBAS® AMPLICOR® przez 16
godzin. SB3, SB ani substratu roboczego nie należy poddawać działaniu metali,
środków utleniających lub bezpośredniego światła.
Przechowywać WB w temperaturze 2-30°C. WB zachowuje stabilność do podanej
daty przydatności. Zbadać WB oraz, jeżeli jest to konieczne, ogrzać w temperaturze
30-37°C w celu ponownego rozpuszczenia ewentualnego osadu. Roboczy bufor
płuczący (1X), przygotowany przez rozcieńczenie WB wodą destylowaną lub
dejonizowaną w stosunku 1:10, musi być przechowywany w pojemniku na bufor
płuczący analizatora COBAS® AMPLICOR® w temperaturze 2-25°C; bufor
zachowuje stabilność przez 2 tygodnie od daty przygotowania.
Pomiędzy cyklami pracy urządzenia częściowo zużyte odczynniki służące do
detekcji należy przechowywać w temperaturze 2-8°C. Przed wprowadzeniem do
analizatora COBAS® AMPLICOR® odczynników z otwartych opakowań lub
odczynników roboczych należy sprawdzić ich datę przydatności.
10/36
Dostarczane materiały
AMPLICOR® CT/NG
P/N: 20759414 122
CT/NG PREP
ART: 07 5941 4
Zestaw do przygotowywania próbek AMPLICOR® CT/NG US: 83315
CT/NG URINE WASH
(CT/NG bufor płuczący do próbek moczu)
CT/NG LYS
(CT/NG odczynnik lizujący)
CT/NG DIL
(CT/NG rozcieńczalnik do próbek)
AMPLICOR® CT/NG
CT/NG AMP
Amplification Kit
®
AMPLICOR CT/NG zestaw do amplifikacji
P/N: 20759902 122
ART: 07 5990 2
US: 83319
CT/NG MMX
(CT/NG Master Mix)
CT/NG IC
(CT/NG kontrola wewnętrzna)
CT (+) C
[C. trachomatis kontrola (+)]
NG (+) C
[C. trachomatis kontrola (–)]
COBAS® AMPLICOR®
CT DK
Detection Kit
COBAS® AMPLICOR® Chlamydia trachomatis
zestaw do detekcji
P/N: 20757497 122
ART: 07 5749 7
US: 83277
CT PS1
CT4
COBAS® AMPLICOR®
P/N: 20757470 122
DK
ART: 07 5747 0
COBAS® AMPLICOR® zestaw odczynników do detekcji US: 83276
DN4
(Roztwór denaturujący)
CN4
(Koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej)
SB3
(Substrat A)
SB
(Substrat B)
11/36
COBAS® AMPLICOR®
WB
Wash Buffer
COBAS® AMPLICOR® Bufor płuczący
P/N: 20759899 123
ART: 07 5989 9
US: 83314
WB
(10X-koncentrat płuczący)
Materiały wymagane, lecz niedostarczane
Pobieranie próbek
– Waciki do pobierania próbek z kanału szyjki macicy i cewki moczowej: do
pobierania próbek używać wyłącznie wacików pokrytych dakronem, rayonem lub
alginianem wapnia z uchwytem wykonanym z tworzywa sztucznego lub drutu
innego niż aluminium
– Należy stosować wyłącznie transportowe podłoże hodowlane 2SP lub SPG,
podłoże transportowe dla Chlamydii Bartels® ChlamTrans (Trinity Biotech
Plc.), transportowy system hodowlany M4® MicroTest lub transportowy
system hodowlany M4RT® MicroTest (Remel, Inc.).
– Polipropylenowe kubeczki do pobierania próbek moczu pozbawione
substancji konserwujących
– Transportowy system hodowlany M4RT MicroTest – dla kobiet (100 szt.)
(Remel, Inc.).
– Transportowy system hodowlany M4RT MicroTest – dla mężczyzn (100 szt.)
(Remel, Inc.).
Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania odczynników
– Pierścień A-ring przeznaczony do aparatu
z wbudowanymi 12 probówkami A-tube
COBAS®
AMPLICOR®
– Statyw pierścienia A-ring przeznaczony do aparatu COBAS® AMPLICOR®
– Pipeta Eppendorf Multipette® z pojemnikiem 1,25 ml Combitip® (jałowa,
pojedynczo pakowana)
– Pipetory (pojemność 100 µl)* z barierą aerozolową lub z końcówkami
z wyrzutnikiem
– Mieszadło wibracyjne
– Rękawice jednorazowe bezpudrowe
Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar przygotowania próbek
i kontroli
– Probówki polipropylenowe o pojemności 2,0 ml z zakrętką, jałowe,
niesilikonizowane, stożkowe (Sarstedt 72.693.005 lub odpowiednik)**
– Statywy na probówki (Sarstedt 93.1428 lub odpowiednik)
– Jałowe kalibrowane pipety transferowe
– Pipetory (pojemność 50 µl, 100 µl, 200 µl, 250 µl, 500 µl i 1000 µl)* z barierą
aerozolową lub końcówkami z wyrzutnikiem
– Mikrowirówka (maks. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g); Eppendorf
5415C, HERMLE Z230M, lub odpowiednik
– Końcówki z przedłużoną osłoną aerozolową (Matrix 7055 lub odpowiednik)
do stosowania z próbkami transportowanymi na podłożu transportowym dla
12/36
Chlamydii Bartels® ChlamTrans (Trinity Biotech Plc.), transportowym
systemie hodowlanym M4® MicroTest lub transportowym systemie
hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.).
– Blok grzejny 37°C ± 2°C
– Papier chłonny
Obszarze obróbki poamplifikacyjnej – obszar amplifikacji/detekcji
– Analizator COBAS® AMPLICOR® z drukarką
– Instrukcja obsługi analizatora COBAS® AMPLICOR®
• Opcjonalnie: Oprogramowanie AMPLILINK obejmujące:
– stację danych z oprogramowaniem AMPLILINK, wyposażoną
w drukarkę
– „Instrukcję obsługi oprogramowania AMPLILINK serii 2.4”,
współpracującego z analizatorem COBAS® AMPLICOR® (w przypadku
stosowania oprogramowania AMPLILINK w wersji 2.41) lub
„Podręcznik oprogramowania AMPLILINK serii 3.2” stosowanego
z urządzeniem COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®,
analizatorem COBAS® TaqMan® 48 i analizatorem COBAS®
AMPLICOR® (w przypadku stosowania oprogramowania AMPLILINK
serii 3.2).
– Stojaki na naczyńka D-cups
– Woda destylowana lub dejonizowana
– Pipety serologiczne 5 ml
– Cylinder miarowy (o pojemności co najmniej 1 litra)
*
Dokładność pipetorów musi wahać się w zakresie 3% podanej objętości. Tam, gdzie jest to
wskazane, konieczne jest stosowanie końcówek z barierą aerozolową lub wyrzutnikiem, aby
zapobiec krzyżowemu skażeniu próbki i amplikonu.
** Do przygotowania próbek i kontroli należy bezwzględnie używać probówek zakręcanych, aby
uniknąć rozpryśnięcia i możliwości krzyżowego skażenia próbek i kontroli. Nie należy stosować
probówek z korkiem zatrzaskowym.
Pobieranie, transport i przechowywanie próbek
Uwaga
Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem zdolnym do
przenoszenia czynników zakaźnych.
Jedynie akceptowalne próbki to:
1.
Próbki moczu (mężczyzn i kobiet) transportowane w czystych pojemnikach
polipropylenowych. Nie używać próbek moczu pobranych do
pojemników zawierających konserwanty.
2.
Wymazy z kanału szyjki macicy i cewki moczowej pobrane i transportowane
przy użyciu AMPLICOR® STD Swab Specimen Collection and Transport Kit.
Przy badaniu tych próbek konieczna jest detekcja CT/NG IC.
13/36
3.
Wymazy z kanału szyjki macicy i cewki moczowej pobrane i transportowane
na:
•
transportowym podłożu hodowlanym 2SP lub SPG,
•
transportowym podłożu dla Chlamydii Bartels® ChlamTrans (Trinity
Biotech Plc.),
•
transportowym systemie hodowlanym M4® MicroTest (Remel, Inc.),
•
transportowym systemie hodowlanym M4RT® MicroTest (Remel, Inc.).
Serie produkcyjne podłoży muszą posiadać kwalifikację do stosowania
w danym laboratorium (szczegółowe dane patrz punkt Kontrola jakości).
Dla uzyskania wiarygodnych wyników testu przestrzegać podanych poniżej
instrukcji właściwego pobierania próbek. Test nie jest przeznaczony do
stosowania z próbkami pobranymi z gardła, odbytnicy ani próbkami innymi niż
wskazane.
Aby zapewnić dostarczenie wysokiej jakości próbek do badań w laboratorium,
próbki moczu i wymazy z dróg moczowo-płciowych należy transportować do
laboratorium w praktycznie najkrótszym czasie. Nie wolno dopuścić, aby próbki
transportowano w warunkach uniemożliwiających kontrolę temperatury.
Pobieranie próbek
Próbki moczu
Uwaga
Pacjenci muszą powstrzymywać się od oddawania moczu przez okres 2 godzin
poprzedzających badanie.
1.
Pobrać 10 do 50 ml pierwszej porcji moczu (pierwszą część strumienia) do
czystego polipropylenowego pojemnika bez środków konserwujących.
2.
Zamknąć pojemnik z próbką i oznaczyć odpowiednio etykietę. Postępować
zgodnie z laboratoryjną procedurą pobierania i transportu próbek. Próbkę
można transportować do miejsca badania w temperaturze pokojowej
18-25°C.
Wymazy pobrane przy użyciu AMPLICOR® Specimen Transport Medium
(STM)
Uwaga
14/36
1.
Usunąć śluz z części pochwowej szyjki macicy jednym z dostarczonych
dużych wacików i wyrzucić go.
2.
Włożyć drugi duży wacik do kanału szyjki macicy do głębokości, przy której
niewidoczny jest koniec wacika.
3.
Obracać wacik przez 3–5 sekund i wyjąć, unikając kontaktu ze ścianami
pochwy.
4.
Umieścić wacik w probówce AMPLICOR® STM, energicznie obracać lub
poruszać wacikiem w płynie przez 15 sekund.
Pozostawienie wacika w STM przez okres dłuższy niż 15 sekund może prowadzić
do zahamowania PCR.
5.
Wycisnąć płyn uciskając wacik o ścianę probówki. Wszelki nadmiar śluzu
w próbce należy w tym momencie usunąć, zbierając go na waciku. Wycisnąć
wszelkie pozostałości płynu ze śluzu, uciskając wacik o ścianę probówki.
Wyjąć i wyrzucić wacik wraz z zebranym na nim ewentualnym
nadmiarem śluzu. Zamknąć probówkę.
6.
Zamknąć pojemnik z próbką i oznaczyć odpowiednio etykietę. Postępować
zgodnie z laboratoryjną procedurą transportu próbek. Przechowywać próbki
w temperaturze pokojowej do chwili przetransportowania ich do
laboratorium.
Próbki z wymazów pobrane na transportowe podłoże hodowlane (CTM,
Culture Transport Media)
Transport próbki
1.
Wymazy z kanału szyjki macicy i cewki moczowej można pobierać
i transportować na 1 do 3 ml transportowego podłoża hodowlanego 2SP lub
SPG, transportowego podłoża dla Chlamydii Bartels® ChlamTrans (Trinity
Biotech Plc.), transportowego systemu hodowlanego M4® MicroTest lub
transportowego systemu hodowlanego M4RT® MicroTest (Remel, Inc.). Po
usunięciu śluzu szyjkowego należy stosować zalecane metody w celu
pobrania komórek nabłonka walcowatego oraz komórek okolicy połączenia
nabłonka płaskiego i walcowatego16.
2.
Do pobierania próbek używać wyłącznie wacików pokrytych dakronem,
rayonem lub alginianem wapnia z uchwytem wykonanym z tworzywa
sztucznego lub drutu innego niż aluminium. Nie używać wacików
z drewnianą lub aluminiową rękojeścią.
3.
Pozostawić waciki w transportowym podłożu hodowlanym. Zamknąć
pojemnik z próbką i oznaczyć odpowiednio etykietę. Postępować zgodnie
z laboratoryjną procedurą pobierania i transportu próbek. Jeżeli transport do
laboratorium opóźnia się powyżej godziny od czasu pobrania próbki,
wymazy należy przechowywać w niskiej temperaturze.
Próbki moczu
1.
Próbki moczu transportować można do miejsca wykonania testu
w temperaturze 18-25°C. Próbki moczu zachowują trwałość przez 24
godziny w temperaturze 18-25°C. Jeżeli próbki moczu nie zostaną poddane
obróbce w ciągu 24 godzin od pobrania, konieczne jest ich przechowywanie
w temperaturze 2-8°C i poddanie obróbce w ciągu 7 dni od pobrania. Próbki
moczu, które nie mogą być poddane obróbce w ciągu 7 dni od pobrania
można przechowywać w temperaturze -20°C lub niższej, a następnie poddać
badaniu w ciągu 30 dni od daty pobrania.
2.
Próbki moczu wymagające transportu do ośrodków wykonujących
oznaczenie zlokalizowanych poza miejscem pobrania muszą być
transportowane w ciągu jednej nocy z zagwarantowanym terminem dostawy
w ciągu 24 godzin; próbki można transportować w temperaturze 18-25°C.
W przypadku transportu próbek moczu w temperaturze 18-25°C, do czasu
transportu należy je przechowywać w temperaturze 2-8°C, aby upewnić się,
że czas przechowywania w temperaturze 18-25°C nie przekroczy 24 godzin.
Próbki należy przesyłać zgodnie z odpowiednimi przepisami lokalnymi,
stanowymi i krajowymi dotyczącymi transportu czynników etiologicznych18.
Wymazy pobrane przy użyciu AMPLICOR® Specimen Transport Medium
(STM)
1.
Wymazy zachowują stabilność przez 10 dni w temperaturze 18-25°C.
Wymazy należy przechowywać w temperaturze pokojowej, a następnie
poddać obróbce w ciągu 10 dni od pobrania.
2.
Wymazy wymagające transportu do ośrodków wykonujących oznaczenie
zlokalizowanych poza miejscem pobrania należy przechowywać
w temperaturze pokojowej do chwili wysyłki. Należy je przesyłać
w temperaturze pokojowej; próbki muszą dotrzeć na miejsce tak, by możliwa
była ich obróbka w ciągu 10 dni od pobrania. Próbki należy przesyłać
zgodnie z odpowiednimi przepisami lokalnymi, stanowymi i krajowymi
dotyczącymi transportu czynników etiologicznych18.
Wymazy pobrane na transportowe podłoże hodowlane (CTM, Culture
Transport Media)
1.
Wymazy transportować można do miejsca wykonania testu w temperaturze
18-25°C pod warunkiem, że całkowity czas przechowywania i transportu
15/36
w temperaturze 18-25°C wynosi poniżej 1 godziny. Jeżeli transport do
laboratorium opóźnia się powyżej godziny od czasu pobrania próbki,
wymazy należy przechowywać w niskiej temperaturze.
2.
Wymazy wymagające transportu do ośrodków wykonujących oznaczenie
zlokalizowanych poza miejscem pobrania należy przesłać w niskiej
temperaturze możliwie najszybciej po pobraniu zgodnie z laboratoryjnymi
procedurami transportu próbek hodowli chlamydii. Próbki należy przesyłać
zgodnie z odpowiednimi przepisami lokalnymi, stanowymi i krajowymi
dotyczącymi transportu czynników etiologicznych18.
Przechowywanie próbek
Uwaga
Rutynowe zamrażanie lub przedłużone przechowywanie próbek może wpływać
na skuteczność testu.
Próbki moczu
1.
Próbki moczu, które nie zostaną poddane obróbce w ciągu 24 godzin od
pobrania należy przechowywać w temperaturze 2-8°C i poddać obróbce
w ciągu 7 dni od pobrania. Próbki moczu, których nie można poddać obróbce
w ciągu 7 dni od pobrania można przechowywać w temperaturze -20°C lub
niższej przez okres do 30 dni.
Wymazy pobrane przy użyciu AMPLICOR® Specimen Transport Medium (STM)
1.
Wymazy zachowują trwałość przez 10 dni w temperaturze 18-25°C.
Wymazy należy przechowywać w temperaturze 18-25°C, a następnie poddać
obróbce w ciągu 10 dni od pobrania.
2.
Wymazy należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu wysyłki.
Należy je przesyłać w temperaturze 18-25°C; próbki muszą dotrzeć na
miejsce tak, by możliwa była ich obróbka w ciągu 10 dni od pobrania.
Wymazy pobrane na transportowe podłoże hodowlane (CTM, Culture
Transport Media)
1.
Jeżeli transport do laboratorium lub obróbka wymazów opóźnia się powyżej
godziny od czasu pobrania próbki, wymazy należy przechowywać w niskiej
temperaturze. Wymazy wymagające transportu do ośrodków wykonujących
oznaczenie zlokalizowanych poza miejscem pobrania należy przesłać
możliwie najszybciej po pobraniu zgodnie z laboratoryjnymi procedurami
transportu próbek hodowli chlamydii.
2.
Wymazy, które nie są badane z chwilą dostarczenia do laboratorium
wykonującego oznaczenie należy przechowywać w temperaturze 2-8°C
i poddać obróbce w ciągu 7 dni. Wymazy, które nie mogą być poddane obróbce
w ciągu 7 dni od pobrania należy przechowywać w temperaturze
-20°C lub niższej, a następnie poddać badaniu w ciągu 30 dni od daty pobrania.
Instrukcje użytkowania
Uwaga
16/36
Szczegółowe informacje na temat obsługi, drukowania wyników oraz
interpretacji sygnałów i komentarzy przedstawiono w (1) „Instrukcji obsługi
analizatora COBAS® AMPLICOR®”, (2) „Instrukcji obsługi oprogramowania
AMPLILINK w wersji 2.4”, współpracującego z analizatorem COBAS®
AMPLICOR® (w przypadku stosowania oprogramowania AMPLILINK serii
2.41) lub, w przypadku używania oprogramowania AMPLILINK serii 3.2 –
w „Podręczniku oprogramowania AMPLILINK serii 3.2”, stosowanego
z urządzeniem COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®,
analizatorem COBAS® TaqMan® 48 i analizatorem COBAS® AMPLICOR®.
Uwaga
Wszystkie odczynniki muszą mieć temperaturę otoczenia przed użyciem. Tam,
gdzie jest to wskazane, używać pipetorów z końcówkami z barierą aerozolową
lub wyrzutnikiem. Należy dołożyć wszelkich starań, aby zapewnić selektywną
amplifikację.
Uwaga
Próbki moczu i wymazy muszą mieć temperaturę otoczenia przed użyciem. Tam,
gdzie jest to wskazane, używać pipetorów z końcówkami z barierą aerozolową
lub wyrzutnikiem. Należy dołożyć wszelkich starań, aby zapewnić selektywną
amplifikację.
Uwaga
Można zredukować zahamowanie PCR, przechowując poddane obróbce próbki
przez noc w temperaturze 2-8°C przed dodaniem próbki do roboczego odczynnika
Master Mix21.
Uwaga
Do przygotowania próbek oraz kontroli należy używać probówek z zakręcanym
korkiem, aby zapobiegać rozlaniu i możliwości skażenia krzyżowego próbek. Nie
należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym.
Wielkość przebiegu
Każdy z zestawów zawiera ilość odczynników wystarczającą na osiem
przebiegów z 12 próbkami każdy, które można wykonać oddzielnie lub
równocześnie. W każdym przebiegu oznaczeń konieczne jest umieszczenie co
najmniej jednego powtórzenia kontroli (+) C. trachomatis oraz jednego
powtórzenia kontroli (–) C. trachomatis (patrz punkt Kontrola jakości).
Uwaga
Kontrola (+) NG służy jako kontrola (–) CT dla COBAS® AMPLICOR® CT Test.
Odczynniki do przygotowywania próbek pakowane są w zestawy umożliwiające
wykonanie 100 testów. Kontrola (+) CT oraz kontrola (+) NG dostarczane są
w pojedynczych butelkach zawierających wystarczającą ilość materiału do
przygotowania 8 zestawów przygotowanych kontroli.
Odczynnik CT/NG Master Mix i kontrola wewnętrzna CT/NG dostarczane są
w trzech butelkach, z których każda zawiera ilość materiału wystarczającą do
wykonania cyklu oznaczeń składającego się z maksymalnie 32 testów, włączając
próbki i kontrole. Aby najwydajniej wykorzystać odczynniki, próbki badane
i kontrolne należy poddawać obróbce w seriach będących wielokrotnością 12.
Przebieg pracy
COBAS® AMPLICOR® CT Test można wykonać w czasie jednego lub dwóch dni.
Jeżeli test ma być zakończony w czasie jednego dnia, należy stosować się kolejno
do instrukcji zawartych w rozdziałach Przygotowanie odczynników, przygotowanie
próbek, przygotowanie kontroli, amplifikacja i detekcja. Test można przeprowadzić
w ciągu 2 dni: w 1 dniu należy przygotować próbki, a w 2 dniu – odczynniki i
kontrolę oraz wykonać amplifikację i detekcję. Ewentualnie można przygotować
odczynniki, próbki i kontrolę oraz dodać przygotowane próbki i kontrole do
odczynnika Master Mix w 1 dniu, a następnie, w 2 dniu, wykonać amplifikację i
detekcję.
Przygotowanie
odczynników
Miejsce wykonania: Obszar obróbki przedamplifikacyjnej – obszar
przygotowania odczynników
1.
Uwaga
Nawet jeżeli nie będzie wykonywana detekcja CT/NG IC, konieczne jest dodanie
CT/NG IC do odczynnika Master Mix.
2.
Ustalić odpowiednią liczbę pierścieni A-ring potrzebnych do oznaczenia
próbek pacjentów i kontrolnych. Umieścić pierścień (pierścienie) A-ring
w odpowiednim statywie (statywach).
Przygotować roboczy odczynnik Master Mix dodając 100 µl CT/NG IC do
jednej probówki CT/NG MMX. Nie jest konieczny pomiar objętości
odczynnika Master Mix. Dodać 100 µl CT/NG IC do całej probówki CT/NG
MMX. Zamknąć ponownie probówkę i dokładnie wymieszać zawartość,
odwracając 10-15 razy. Nie mieszać roboczego odczynnika Master Mix na
17/36
mieszadle wibracyjnym. Różowy barwnik w CT/NG IC używany jest do
wizualnego potwierdzenia, że CT/NG IC dodano do CT/NG MMX. Usunąć
pozostały CT/NG IC. Dokładnie wymieszać zawartość, odwracając 10-15
razy. Odczynnik roboczy Master Mix musi być przechowywany
w temperaturze 2-8°C i zużyty w przeciągu 4 tygodni od przygotowania.
Przygotowanie próbki
3.
Dodać 50 µl roboczego odczynnika Master Mix do każdej z probówek
A-tube, używając pipetora powtarzalnego lub pipetora wyposażonego
w końcówkę z barierą aerozolową lub końcówkę z wyrzutnikiem. W tym
czasie nie należy zamykać korków probówek A-tube.
4.
Umieścić pierścień (pierścienie) A-ring zawierające roboczy odczynnik
Master Mix w plastikowej torebce przeznaczonej do wielokrotnego
zamykania i zamknąć szczelnie torebkę. Przenieść pierścień (pierścienie)
A-ring do przedamplifikacyjnego obszaru przygotowania próbek. Pierścień
(pierścienie) A-ring zawierające roboczy odczynnik Master Mix należy
przechowywać w temperaturze 2-8°C w obszarze przedamplifikacyjnym –
obszar przygotowania próbek do czasu zakończenia przygotowywania próbek
i kontroli. Odczynnik roboczy Master Mix zachowuje stabilność przez 48
godziny w temperaturze 2-8°C w probówkach A-tube umieszczonych
w szczelnie zamkniętej torebce z tworzywa.
przygotowania próbek
Próbki moczu
1.
Dla każdej próbki chorego oznaczyć jedną probówkę o pojemności 2,0 ml
z zakręcanym korkiem. Nie należy stosować probówek z korkiem
zatrzaskowym.
2.
Dodać 500 µl CT/NG URINE WASH do każdej z oznaczonych probówek.
3.
Dokładnie wymieszać mocz na mieszadle wibracyjnym (3-10 sekund).
W przypadku zamrożonych próbek, przed mieszaniem na mieszadle
wibracyjnym należy je rozmrozić w temperaturze pokojowej (próbki
o objętości powyżej 2 ml muszą być rozmrażane w temperaturze 2-8°C przez
okres nocy); kontynuować obróbkę nawet w przypadku obecności precypitatu.
Ostrożnie zdjąć korki z pojemników z moczem. Zachować ostrożność, aby
uniknąć skażenia rękawic moczem obecnym na korku. W przypadku
zanieczyszczenia rękawic, zmienić rękawice na czystą parę przed
przystąpieniem do otwarcia następnej próbki.
4. Dodać 500 µl każdej z dokładnie wymieszanych próbek moczu chorych do
odpowiednio oznaczonej probówki z CT/NG URINE WASH. Użyć nowej
końcówki z osłoną aerozolową dla każdej próbki. Zamknąć ponownie
probówki i dokładnie wymieszać na mieszadle wibracyjnym.
5. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37°C.
6. Odwirować przy prędkości ł 12 500 x g przez 5 minut.
7. Odlać supernatant i osuszyć każdą probówkę oddzielnym arkuszem papieru
chłonnego.
8. Używając pipety z nową końcówką z osłoną aerozolową dla każdej z próbek,
dodać 250 µl CT/NG LYS do każdej probówki. Zamknąć ponownie
9. Inkubować probówki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
10. Używając pipety z nową końcówką z osłoną aerozolową dla każdej z próbek,
dodać 250 µl CT/NG DIL do każdej probówki. Zamknąć ponownie
18/36
11. Odwirować probówki przez 10 minut przy prędkości ≥ 12 500 x g.
12. Przygotowane próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej przez
najwyżej 2 godziny przed przeniesieniem równych objętości do probówek
A-tube zawierających odczynnik roboczy Master Mix. Jeżeli próbki nie będą
dodane do probówek A-tube w ciągu 2 godzin, przygotowane próbki należy
przechowywać w temperaturze 2-8°C. Przygotowane próbki przechowywane
w temperaturze 2-8°C muszą być poddane badaniu w ciągu 7 dni.
13. Jeśli przygotowane próbki przechowywano w temperaturze 2-8°C, należy je
ogrzać do temperatury pokojowej i dokładnie wymieszać na mieszadle
wibracyjnym przed amplifikacją. Po wymieszaniu na mieszadle wibracyjnym
odwirować przygotowane próbki przez 10 minut przy prędkości ≥ 12 500 x g.
14. Używając pipetora z końcówką z osłoną aerozolową, przenieść 50 µl
supernatantu do odpowiedniej probówki A. Użyć nowej końcówki z osłoną
aerozolową dla każdej próbki. Zachować ostrożność, aby nie uszkodzić
peletki (peletka może nie być dobrze widoczna). Zanotować pozycję
poszczególnych próbek chorych na mapie pierścienia A-ring. Zamknąć
probówki A-tube.
15. Przechowywać pozostałości każdej z przygotowanych próbek w temperaturze
2-8°C na wypadek konieczności ponownego wykonania testu. Wszelkie ponowne
testy należy wykonać w ciągu 7 dni od przygotowania próbek.
Próbki z wymazów
Uwaga
Wymazy transportowane przy użyciu AMPLICOR® Specimen Transport
Medium (STM)
Przy badaniu tych próbek konieczna jest detekcja CT/NG IC.
1.
Sprawdzić probówkę transportową AMPLICOR® STM. Jeśli próbkę
transportowano w probówce z wacikiem, próbkę tę należy wyrzucić
i pobrać nową próbkę.
2.
Pipetować 1 ml CT/NG DIL do każdej probówki transportowej, używając
nowej jałowej pipety dla każdej z probówek.
3. Ponownie zamknąć probówkę. Wymieszać na mieszadle wibracyjnym przez
5–10 sekund.
4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
5. Przygotowane próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej
przez najwyżej 2 godziny przed przeniesieniem równych objętości do
probówek A-tube zawierających odczynnik roboczy Master Mix. Jeżeli
próbki nie będą dodane do probówek A-tube w ciągu 2 godzin, przygotowane
próbki należy przechowywać w temperaturze 2-8°C. Przygotowane próbki
przechowywane w temperaturze 2-8°C powinny być poddane badaniu
w ciągu 4 dni.
wibracyjnym przed amplifikacją.
7. Używając pipetora z końcówką z osłoną aerozolową przenieść 50 µl każdej
z przygotowanych próbek do odpowiedniej probówki A-tube. Zanotować
pozycję poszczególnych próbek chorych na mapie pierścienia A-ring.
Zamknąć probówki.
8. Przechowywać pozostałości każdej z przygotowanych próbek
w temperaturze 2-8°C na wypadek konieczności ponownego wykonania
testu. Wszelkie ponowne testy należy wykonać w ciągu 4 dni od
przygotowania próbek.
19/36
Wymazy transportowane w transportowym podłożu hodowlanym (CTM,
Culture Transport Media)
Uwaga
Test COBAS® AMPLICOR® CT poddano ocenie z użyciem transportowego
podłoża hodowlanego 2SP lub SPG, podłoża transportowego dla Chlamydii
Bartels® ChlamTrans (Trinity Biotech Plc.), transportowego systemu
hodowlanego M4® MicroTest lub transportowego systemu hodowlanego
M4RT® MicroTest (Remel, Inc.). Stosowanie alternatywnych podłoży
transportowych musi zostać poddane walidacji przez laboratorium.
1.
Sprawdzić, czy probówka z podłożem transportowym zawiera wacik. Nie
opracowano specyfikacji skuteczności niniejszego testu dla próbek, które nie
zawierają wacików.
2.
Dla każdej próbki chorego oznaczyć jedną probówkę o pojemności 2,0 ml
z zakręcanym korkiem. Nie używać probówek z zatrzaskowym korkiem.
3.
Dodać 100 µl CT/NG LYS do odpowiednio
polipropylenowych probówek o pojemności 2 ml.
4.
Wymieszać próbki na mieszadle wibracyjnym. Jeśli próbki były
przechowywane w stanie zamrożonym, rozmrozić w temperaturze
pokojowej przed mieszaniem na mieszadle wibracyjnym. Ostrożnie zdjąć
korki z probówek z próbkami. Zachować ostrożność, aby uniknąć skażenia
rękawic. W przypadku zanieczyszczenia rękawic, zmienić rękawice na
czystą parę przed przystąpieniem do otwarcia następnej próbki.
5.
Używając pipetora z nową końcówką z osłoną aerozolową, dodać 100 µl
dobrze wymieszanej próbki do odpowiedniej probówki z CT/NG LYS. Użyć
nowej końcówki z osłoną aerozolową dla każdej próbki. Zamknąć ponownie
probówkę i dokładnie wymieszać na mieszadle wibracyjnym.
6.
Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
7.
Używając nowej końcówki pipety z osłoną aerozolową dla każdej z próbek,
dodać 200 µl CT/NG DIL do każdej probówki. Zamknąć ponownie
probówkę i dokładnie wymieszać na mieszadle wibracyjnym.
oznakowanych
8. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
9. Przygotowane próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej przez
najwyżej 2 godziny przed przeniesieniem równych objętości do probówek
A-tube zawierających odczynnik roboczy Master Mix. Jeżeli próbki nie będą
dodane do probówek A-tube w ciągu 2 godzin, przygotowane próbki należy
przechowywać w temperaturze 2-8°C. Przygotowane próbki przechowywane
w temperaturze 2-8°C muszą być poddane badaniu w ciągu 7 dni.
wibracyjnym przed amplifikacją.
11. Używając pipetora z końcówką z osłoną aerozolową, przenieść 50 µl każdej
z przygotowanych próbek do odpowiedniej probówki A-tube. Użyć nowej
końcówki z osłoną aerozolową dla każdej próbki. Zanotować pozycję
poszczególnych próbek chorych na mapie pierścienia A-ring. Zamknąć
probówki A-tube.
12. Przechowywać pozostałości każdej z przygotowanych próbek
w temperaturze 2-8°C na wypadek konieczności ponownego wykonania
testu. Wszelkie ponowne testy należy wykonać w ciągu 7 dni od
przygotowania próbek.
20/36
Przygotowanie kontroli
przygotowania kontroli
Uwaga
Przygotować świeże kontrole robocze każdego dnia w którym wykonywane są
testy. Kontroli roboczych używać można do przygotowania wielu kontroli
obrobionych (Processed Controls) w ciągu dnia, lecz należy je wyrzucić przy
końcu dnia.
Uwaga
Kontrola (+) CT służy jako dodatnia kontrola testu CT. Kontrola (+) NG służy jako
ujemna kontrola testu CT.
Uwaga
W przypadku badania zarówno wymazów jak i próbek moczu konieczne jest
przygotowanie jednego zestawu kontroli dla każdego rodzaju próbek.
Część A.
Kontrole robocze:
Przygotować następujące kontrole robocze: CT (+) i CT (–).
A1. Używając jałowej końcówki pipety, dodać 1 ml CT/NG DIL do każdej
z dwóch polipropylenowych probówek o pojemności 2 ml z zakrętką.
Oznaczyć jedną probówkę „Kontrola robocza CT (+)”, a drugą „Kontrola
robocza CT (–)”.
A2. Wymieszać CT (+) C oraz NG (+) C na mieszadle wibracyjnym przez
5 sekund przy maksymalnej prędkości. Ostrożnie zdjąć korki z probówek.
Zachować ostrożność, aby uniknąć skażenia rękawic. W przypadku
zanieczyszczenia rękawic, zmienić rękawice na czystą parę przed kontynuacją
pracy.
A3. Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową dodać 100 µl
CT (+) C do probówki oznaczonej „Kontrola robocza CT (+)”.
A4. Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową dodać 100 µl
NG (+) C do probówki oznaczonej „Kontrola robocza CT (–)”.
Część B.
Mocz i wymazy
AMPLICOR® STD:
A5. Zamknąć ponownie probówki i dokładnie wymieszać na mieszadle
wibracyjnym. Przechowywać w temperaturze pokojowej i wyrzucić na
koniec dnia roboczego.
Przygotować następujące kontrole obrobione: CT (+) i CT (–).
B1. Używając jałowej końcówki pipety, dodać 250 µl CT/NG LYS do każdej
Oznaczyć jedną probówkę „Kontrola obrobiona CT (+)”, a drugą „Kontrola
obrobiona CT (–)”.
B2. Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową, dodać 250 µl
kontroli roboczej CT (+) do probówki oznaczonej „Kontrola obrobiona
CT (+)”.
B3. Używając nowej końcówki do pipetora z osłoną aerozolową, dodać 250 µl
kontroli roboczej CT (–) do probówki oznaczonej „Kontrola obrobiona
CT (–)”.
B4. Zamknąć ponownie probówki i dokładnie wymieszać na mieszadle
wibracyjnym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Przechowywać w temperaturze pokojowej i wyrzucić na koniec dnia
roboczego.
B5. Używając pipetora z końcówką z osłoną aerozolową, przenieść 50 µl każdej
z obrobionych kontroli do odpowiedniej probówki A-tube. Zamknąć
probówki A-tube i zanotować pozycje kontroli na mapie pierścienia A-ring.
B6. Przenieść przygotowane próbki (próbki badane i kontrolne) w pierścieniach
A-ring do obszaru poamplifikacyjnego. Próbki gotowe do reakcji PCR
można przechowywać w temperaturze 2-8°C przez okres do 16 godzin.
21/36
Część C.
Wymazy CTM:
Przygotować następujące kontrole obrobione CT (+) i CT (–).
C1. Używając jałowej końcówki pipety, dodać 100 µl CT/NG LYS do każdej
Oznaczyć jedną probówkę „Kontrola obrobiona CT (+)”, a drugą „Kontrola
obrobiona CT (–)”.
C2. Używając jałowej końcówki pipety, dodać 100 µl transportowego podłoża
hodowlanego do każdej probówki z CT/NG LYS.
C3. Zamknąć ponownie probówki i dokładnie wymieszać na mieszadle
wibracyjnym.
C4. Używając pipetora z nową końcówką z osłoną aerozolową, dodać 200 µl
kontroli roboczej CT (+) do probówki oznaczonej „Kontrola obrobiona
CT (+)”.
C5. Używając pipetora z nową końcówką z osłoną aerozolową, dodać 200 µl
kontroli roboczej CT (–) do probówki oznaczonej „Kontrola obrobiona
CT (–)”.
C6. Zamknąć ponownie probówki i dokładnie wymieszać na mieszadle
wibracyjnym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Przechowywać w temperaturze pokojowej i wyrzucić na koniec dnia
roboczego.
C7. Używając pipetora z końcówką z osłoną aerozolową, przenieść 50 µl każdej
z obrobionych kontroli do odpowiedniej probówki A-tube. Zamknąć
probówki A-tube i zanotować pozycje kontroli na mapie pierścienia A-ring.
Amplifikacja i detekcja
C8. Przenieść przygotowane próbki (próbki badane i kontrolne) w pierścieniach
A-ring do obszaru poamplifikacyjnego. Próbki gotowe do reakcji PCR
można przechowywać w temperaturze 2-8°C przez okres do 16 godzin.
Miejsce wykonania: Obszar obróbki poamplifikacyjnej – obszar
amplifikacji/detekcji
Należy wykonać codzienne czynności serwisowe obejmujące:
– Przecierać stanowisko startowe przy użyciu wilgotnej szmatki pozbawionej
kłaczków, a następnie osuszyć je
– Przecierać końcówkę uchwytu do naczyniek D-cup przy użyciu wilgotnej
szmatki pozbawionej kłaczków, a następnie osuszyć ją
– Sprawdzić pojemnik buforu płuczącego i napełnić go w razie potrzeby
– Przygotować roboczy bufor płuczący (1X) w sposób podany poniżej. Zbadać
WB oraz, jeżeli jest to konieczne, ogrzać w temperaturze 30-37°C w celu
ponownego rozpuszczenia ewentualnego osadu. Dodać 1 objętość WB do 9
objętości wody destylowanej lub dejonizowanej. Dobrze wymieszać. Należy
dbać o to, żeby w zbiorniku buforu płuczącego przez cały czas znajdowało się
przynajmniej 3-4 litry buforu płuczącego (1X).
– Opróżnić pojemnik na odpady
– Załadować system
– Podczas uruchamiania ładowania systemu sprawdzić strzykawki i przewody
– W czasie uruchamiania sprawdzić końcówkę transferową
Przed każdym przebiegiem oznaczeń:
– Sprawdzić pojemnik na odpady i opróżnić go w razie potrzeby
– Sprawdzić pojemnik buforu płuczącego i dodać buforu w razie potrzeby
– Usunąć zużyte statywy do naczyniek D-cup
– Załadować system
22/36
Ładowanie analizatora COBAS® AMPLICOR® i sprawdzenie działania
systemu
1.
Sprawdzić ilości odczynników wewnątrz analizatora COBAS®
AMPLICOR®. Przygotować wystarczającą ilość kaset z odczynnikami do
ukończenia analizy wprowadzonych próbek.
2.
Dokładnie wymieszać CT PS1 na mieszadle wibracyjnym. Dodać 2,5 ml CT
PS1 do kasety z CT4. Umieścić kasetę w statywie na odczynniki specyficzne
dla określonego testu. Usunąć zużytą fiolkę CT PS1. Zanotować datę
przygotowania odczynnika na kasecie CT4.
Uwaga
Jeżeli nie będzie wykonywana detekcja kontroli wewnętrznej przejść do etapu 4.
W przeciwnym wypadku kontynuować etap 3.
Uwaga
Przy badaniu próbek wymazów pobranych i transportowanych przy użyciu
AMPLICOR® STD Swab Specimen Collection and Transport Kit konieczne jest
wykonywanie detekcji CT/NG IC.
3.
Dokładnie wymieszać IC PS1 na mieszadle wibracyjnym. Dodać 2,5 ml IC
PS1 do kasety z IC4. Umieścić kasetę w statywie na odczynniki specyficzne
dla określonego testu. Usunąć zużytą fiolkę IC PS1. Zanotować datę
przygotowania odczynnika na kasecie IC4.
4.
Przygotować substrat roboczy, pipetując 5 ml SB do jednej kasety z SB3.
Aby wymieszać roztwór, kilkakrotnie nabierać i usunąć płyn z pipety.
Usunąć pustą fiolkę SB. Odnotować datę przygotowania na kasecie z SB3.
5.
Umieścić substrat roboczy w statywie na roztwory podstawowe.
6.
Umieścić kasety z DN4 i CN4 w statywie na roztwory podstawowe. Na
każdej z kaset zanotować datę jej otwarcia.
7.
Oznaczyć ramki na odczynniki jako zwykłe lub określone dla danego testu,
używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania
AMPLILINK.
8.
Skonfigurować ramki na odczynniki przez wprowadzenie pozycji
odczynników i numerów serii do analizatora COBAS® AMPLICOR®,
AMPLILINK.
9.
Załadować ramki na odczynniki do analizatora COBAS® AMPLICOR®,
AMPLILINK. Upewnić się, że każda kaseta z odczynnikami znajduje się w
przypisanym jej miejscu i jest mocno zamocowana w statywie.
10. Umieścić statyw na naczyńka D-cup w palecie na naczyńka D-cup. Dla każdej
reakcji detekcji próbki badanej lub kontroli wymagany jest jedno naczyńko
D-cup, a dla każdej kasety z substratem roboczym wymagane są dwa naczyńka
D-cup, aby umożliwić wyzerowanie analizatora COBAS® AMPLICOR®.
11. Umieścić pierścień/nie A-ring w segmencie/tach termocyklera analizatora
COBAS® AMPLICOR® Analyzer.
12. Załadować pierścienie A do analizatora COBAS® AMPLICOR®, używając
klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK.
13. Utworzyć listę roboczą pierścienia A.
14. Szczelnie zamknąć pokrywę segmentu(ów) termocyklera.
15. Uruchomić analizator COBAS® AMPLICOR®.
16. Zaczekać, aż analizator COBAS® AMPLICOR® wyświetli komunikat
o omyślnym sprawdzeniu systemu w czasie uruchamiania.
23/36
Uwaga
Analizator COBAS® AMPLICOR® umożliwia wykonanie do 6 oddzielnych
oznaczeń zawartości każdej probówki A. Analizator COBAS® AMPLICOR®
oblicza niezbędną ilość każdego odczynnika do detekcji, a sprawdzanie
zawartości wykonywane na początku każdego cyklu oznaczeń określa, czy jest
dostępna wystarczająca ilość odczynników do wykonania zaplanowanych
badań.
17. Analizator COBAS® AMPLICOR® automatycznie wykonuje amplifikację
i detekcję. Wyniki wyrażone są w postaci wartości absorbancji przy długości
fali 660 nm oraz jako wynik dodatni, ujemny lub niejednoznaczny w oparciu
o porównanie wartości absorbancji ze zdefiniowaną wcześniej wartością
graniczną, swoistą dla danego testu.
24/36
Kontrola jakości
Każdy cykl oznaczeń musi zawierać przynajmniej jedno powtórzenie obrobionej
kontroli CT (+) oraz jedno powtórzenie obrobionej kontroli CT (–). Tak jak
w przypadku każdej nowej procedury laboratoryjnej, nowy operator powinien
rozważyć zastosowanie dodatkowych kontroli za każdym razem, kiedy
przeprowadzany jest test, do czasu osiągnięcia dużego stopnia zaufania
dotyczącego poprawności przeprowadzania testu. Brak jest zaleceń dotyczących
położenia próbek kontrolnych i badanych w pierścieniu(ach) A-ring.
Kontrola ujemna
Absorbancja kontroli CT (–) przy długości fali 660 nm powinna wynosić poniżej
0,2. Jeżeli absorbancja kontroli CT (–) jest równa lub wyższa niż 0,2, cały
przebieg oznaczeń jest nieprawidłowy. Należy powtórzyć cały proces
(przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, amplifikacja i detekcja). Jeżeli
absorbancja kontroli CT (–) systematycznie przekracza 0,2, należy skontaktować
się z lokalnym przedstawicielstwem firmy Roche celem pomocy technicznej.
Kontrola CT (–) zawiera niehomologiczny DNA (sekwencje N. gonorrhoeae)
i służy do monitorowania kontaminacji odczynników lub sprzętu badanym DNA.
Kontrola dodatnia
Absorbancja kontroli CT (+) przy długości fali 660 nm powinna równa lub
wyższa niż 2,0. Jeżeli absorbancja kontroli CT (+) jest niższa niż 2,0, cały
przebieg oznaczeń jest nieprawidłowy. Należy powtórzyć cały proces
(przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, amplifikacja i detekcja). Jeżeli
absorbancja kontroli CT (+) wynosi systematycznie poniżej 2,0, należy
skontaktować się z lokalnym przedstawicielstwem firmy Roche celem pomocy
technicznej.
Kontrola CT (+) zawiera około 20 kopii/test sekwencji plazmidowego DNA
C. trachomatis. Jest to około czterokrotnie większa ilość niż minimalny poziom
detekcji dla stosowanego testu, który określono przy użyciu analizy Poissona.
Amplifikacja i detekcja kontroli CT (+) potwierdza dokonanie procesu
amplifikacji. Kontrola CT (+) nie monitoruje wydajności amplifikacji ani
poziomu detekcji stosowanego testu.
Walidacja wacików
po pobierania próbek
i transportowych
podłoży hodowlanych
Nowe serie wacików do pobierania próbek i transportowych podłoży
hodowlanych (CTM) używanych do transportu wymazów do laboratorium celem
badania przy użyciu COBAS® AMPLICOR® CT Test powinny posiadać
kwalifikację do stosowania w omawianym teście, aby zapewnić brak obecności
substancji zakłócających PCR w wymazach i podłożach. Należy skontaktować się
z lokalnym przedstawicielem firmy Roche celem uzyskania procedury walidacji
wacików do pobierania próbek i podłoży transportowych.
Kontrola
przygotowywania próbek
Celem oceny skuteczności przygotowania próbek, do probówki z transportowym
podłożem hodowlanym lub probówki z AMPLICOR® STM należy dodać komórki
McCoya zakażone C. trachomatis (dostępne z American Type Culture Collection)
w ilości do 103-104 komórek/ml, a następnie inkubować przez godzinę
w temperaturze pokojowej. Zakażone transportowe podłoże hodowlane lub
AMPLICOR® STM należy poddać obróbce, a następnie zbadać używając procedury
dla odpowiedniego rodzaju wymazu, w sposób opisany w niniejszej Instrukcji
użytkowania. Odpowiednio przygotowane próbki powinny dać dodatni wynik przy
użyciu COBAS® AMPLICOR® CT Test przy absorbancji równej lub wyższej niż
0,8 przy długości fali 660 nm.
25/36
Wyniki
Interpretacja wyników
Bez użycia detekcji kontroli wewnętrznej
1.
Aby upewnić się o poprawnym przebiegu cyklu, należy sprawdzić sygnały
(flags) i komentarze umieszczone na wydruku dla danego cyklu. Jeśli
przebieg jest niewłaściwy, powtórzyć cały przebieg oznaczeń
(przygotowanie próbek i kontroli, amplifikacja i detekcja).
2.
W przypadku prawidłowego cyklu, wyniki próbek interpretuje się
w następujący sposób:
A660
FLG
Komentarz
Interpretacja
< 0,2
—
NEGATIVE
Nie wykryto DNA C. trachomatis. Próbka jest
prawdopodobnie ujemna dla C. trachomatis.
Wynik ujemny nie wyklucza zakażenia
C. trachomatis gdyż wyniki zależne są od
odpowiedniego
pobrania
próbki,
braku
inhibitorów, oraz obecności DNA wystarczającej
do detekcji.
≥ 0,8
—
POSITIVE
Wykryto DNA C. trachomatis. Próbka jest
dodatnia dla C. trachomatis.
≥ 0,2, < 0,8
—
GZ 0.2 – 0.8
Wynik
badania
próbki
w
kierunku
C. trachomatis jest niejednoznaczny. Powtórzyć
badanie w dwóch powtórzeniach używając
próbki poddanej obróbce. Interpretować wynik
na podstawie wszystkich 3 wartości.
3.
Interpretacja wyników
Z użyciem detekcji kontroli wewnętrznej
1.
26/36
Ostateczną interpretację testu dla próbek niejednoznacznych należy wykonać
używając wartości granicznej 0,2 A660. Przed podaniem ostatecznego wyniku
próbki dającej początkowo wynik niejednoznaczny (GZ 0,2–0,8), należy ją
poddać ponownemu badaniu używając dwóch powtórzeń przygotowanej
próbki. Próbki, dla których co najmniej 2 z 3 wyników (pierwotny i
przynajmniej jeden powtórzony) mają wartość A660 większą lub równą 0,2,
należy uważać za dodatnie dla C. trachomatis. Jeśli obydwa wyniki
powtórnego badania dają wartość A660 mniejszą od 0,2, próbka jest
Aby upewnić się o poprawnym przebiegu cyklu, należy sprawdzić sygnały
(flags) i komentarze umieszczone na wydruku dla danego cyklu. Jeśli
przebieg jest niewłaściwy, powtórzyć cały przebieg oznaczeń
(przygotowanie próbek i kontroli, amplifikacja i detekcja).
2.
W przypadku prawidłowego przebiegu, próbki z wartością A660 < 0,2
interpretuje się w następujący sposób:
Wynik CT
A660
Wynik IC
A660
Interpretacja
< 0,2
≥ 0,2
Nie wykryto DNA C. trachomatis. Próbka jest
Wynik ujemny nie wyklucza zakażenia
C. trachomatis gdyż wyniki zależne są od
odpowiedniego
pobrania
próbki,
braku
inhibitorów, oraz obecności DNA wystarczającej
do detekcji.
< 0,2
< 0,2
Próbka zawierająca substancje hamujące. W razie
obecności DNA C. trachomatis będzie on
niewykrywalny. Przygotuj jeszcze jedną próbkę
z oryginalnie pobranego materiału i powtórz test.
Inhibitory często są niestabilne, stąd próbki
początkowo zawierające inhibitor mogą nie
wykazywać cech zahamowania przy powtórzeniu
testu. Jeżeli oryginalna próbka nie jest dostępna,
należy pobrać nową.
3.
W przypadku prawidłowego przebiegu, próbki z wartością A660 ≥ 0,8
interpretowane są jako dodatnie dla C. trachomatis, niezależnie od
wyniku IC.
4.
W przypadku prawidłowego przebiegu, próbki dające początkowo wynik
CT w szarej strefie (A660 ≥ 0,2, < 0,8), niezależnie od wyniku IC, należy
poddać ponownemu badaniu, używając dwóch powtórzeń przygotowanej
próbki przed podaniem wyniku końcowego. Ostateczną interpretację testu
dla tych próbek należy wykonać, używając wartości granicznej A660
wynoszącej 0,2. Interpretacja ponownego badania:
Powtórzyć
wynik próbki CT
Powtórzyć
wynik próbki IC
Przynajmniej jeden wynik
ł 0,2
Dowolna wartość
Obydwa wyniki < 0,2
Obydwa wyniki ≥ 0,2
Obydwa wyniki < 0,2
Przynajmniej jeden wynik
< 0,2
Interpretacja
Próbka dodatnia dla
C. trachomatis.
Próbka jest prawdopodobnie
ujemna dla C. trachomatis.
Wynik ujemny nieważny. Próbka
niejednoznaczna w kierunku
C. trachomatis.
27/36
Środki ostrożności dotyczące procedury
Praca w laboratorium musi zachodzić w sposób jednokierunkowy, z początkiem
w obszarze przedamplifikacyjnym i z jednokierunkowym ruchem w stronę
obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Czynności przed procesem
amplifikacji muszą zaczynać się od przygotowania odczynników, a następnie
przygotowania próbki. Materiały i wyposażenie muszą być przeznaczone
wyłącznie do określonej czynności przed procesem amplifikacji i nie wolno
używać ich do innych czynności ani przemieszczać między obszarami.
W każdym z obszarów konieczne jest używanie rękawiczek, które należy zmienić
przed opuszczeniem danego obszaru. Wyposażenie i materiały zastosowane do
przygotowania odczynnika nie mogą być używane podczas czynności
związanych z przygotowywaniem próbki lub pipetowaniem albo obróbką
zamplifikowanego DNA lub innych źródeł docelowego DNA. Materiały
i urządzenia używane w czynnościach po amplifikacji muszą pozostawać zawsze
w obszarze poamplifikacyjnym.
Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia
badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej.
Z uwagi na wysoką czułość analityczną niniejszego testu, należy przedsięwziąć
wyjątkową ostrożność, używając odczynników z zestawów oraz mieszanin do
amplifikacji, aby zapobiec kontaminacji. Należy usunąć wszystkie podejrzane
odczynniki.
Ograniczenia procedury
Do badań należy używać jedynie określonych rodzajów próbek. Test COBAS®
AMPLICOR® CT poddano ocenie przy użyciu wymazów z kanału szyjki macicy,
wymazów z męskiej cewki moczowej pobieranych na transportowe podłoże
hodowlane 2SP lub SPG, podłoże transportowe dla Chlamydii Bartels®
ChlamTrans (Trinity Biotech Plc.), transportowy system hodowlany M4®
MicroTest lub transportowy system hodowlany M4RT® MicroTest (Remel, Inc.),
a także moczu kobiet i mężczyzn, pobranego bez środków konserwujących. Nie
oceniano stosowania testu w przypadku innych rodzajów próbek, a ich użycie
może powodować wyniki fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie.
Detekcja C. trachomatis zależna jest od liczby organizmów obecnych w próbce
i mogą na nią mieć wpływ metody pobrania próbek, czynniki zależne od pacjenta (tj.
wiek, wywiad w kierunku chorób przenoszonych drogą płciową, obecność objawów),
stadium zakażenia i/lub szczep C. trachomatis wywołującej zakażenie.
Mutacje w obrębie wysoce konserwatywnych regionów DNA plazmidu
kryptycznego C. trachomatis, z którymi łączą się primery i/lub sonda używane
w teście, choć rzadkie, mogą spowodować niewykrycie obecności bakterii w tym
przypadku.
Wyniki fałszywie ujemne pojawiać się mogą na skutek hamowania polimerazy.
COBAS® AMPLICOR® CT Test uzupełniono o kontrolę wewnętrzną CT/NG, aby
umożliwić identyfikację poddanych obróbce próbek zawierających substancje,
które mogą zakłócać amplifikację PCR w stopniu większym niż 20 kopii/test.
Przy badaniu wymazów pobranych i transportowanych przy użyciu AMPLICOR®
STD Swab Specimen Collection and Transport Kit konieczne jest wykonanie
detekcji CT/NG IC.
Laboratoria wprowadzające test COBAS® AMPLICOR® CT/NG dla Chlamydia
trachomatis, zatrudniające nowych laborantów bądź zmieniające procedury testowe
lub pobierania próbek mogą zastosować CT/NG IC w celu określenia odsetka inhibicji
w ich populacji badanej przy badaniu próbek moczu lub wymazów transportowanych
na transportowych podłożach hodowlanych dla chlamydii. W zależności od wyników
28/36
tego wstępnego oszacowania, laboratorium może zdecydować o kontynuacji używania
CT/NG IC przy tego typu próbkach.
Częstość występowania zakażenia chlamydiami w populacji może wpływać na
skuteczność testu. Dodatnie wartości predykcyjne ulegają zmniejszeniu przy
badaniu populacji z niską częstością zachorowań lub u osób, u których nie
występuje ryzyko zakażenia.
Wiarygodne wyniki uzależnione są od właściwego pobrania próbki, transportu,
przechowywania oraz procedur obróbki. Nie zdefiniowano w pełni czynników
wynikających z przechowywania próbek. W badaniach stabilności próbek
skuteczność testu dla próbek przechowywanych w obniżonej temperaturze oraz
w stanie zamrożenia była podobna.
Dodatek enzymu AmpErase do odczynnika Master Mix umożliwia selektywną
amplifikację docelowego DNA; mimo tego kontaminacji odczynników uniknąć
można jedynie dzięki dobrej praktyce laboratoryjnej i dokładnemu przestrzeganiu
procedur wyszczególnionych w Instrukcji użytkowania.
Niniejszego testu nie wolno używać do oceny skuteczności leczenia lub jej braku.
Jak w przypadku każdego testu diagnostycznego, wyniki COBAS®
AMPLICOR® CT Test należy interpretować z uwzględnieniem wszystkich
dostępnych wyników badania klinicznego i badań laboratoryjnych.
Produktu tego powinny używać wyłącznie osoby wykwalifikowane w technikach
PCR.
COBAS® AMPLICOR® CT Test nie jest w stanie wykryć odmian
bezplazmidowych C. trachomatis.
Odpowiedniość próbek (w przypadku wymazów) potwierdzić można tylko na
drodze wizualizacji pod mikroskopem komórek nabłonka walcowatego
w próbkach.
Nie zaleca się używania testu COBAS® AMPLICOR® CT Test celem oceny
podejrzenia nadużyć seksualnych lub w innych wskazaniach sądowo-lekarskich.
W każdym przypadku, kiedy wynik fałszywie dodatni lub fałszywie ujemny może
prowadzić do niekorzystnych następstw medycznych, socjalnych lub
psychologicznych zaleca się wykonanie dodatkowych badań.
Zalecenia dotyczące przechowywania próbek oparte są o badania obejmujące 21
próbek chorych z dodatnim wynikiem hodowli (10 wymazów i 11 próbek moczu)
oraz 52 próbki chorych z negatywnym wynikiem hodowli.
Wyniki COBAS® AMPLICOR® CT Test mają charakter jakościowy. Nie stwierdzono
korelacji między wielkością absorbancji dodatniego sygnału w COBAS® AMPLICOR®
CT Test i liczbą komórek C. trachomatis w zakażonej próbce. Niniejszy test wykrywa
włącznie C. trachomatis, nie wykrywa natomiast C. psittaci ani C. pneumoniae.
Zaleca się wykonywanie oznaczeń próbek moczu mężczyzn i kobiet w COBAS®
AMPLICOR® CT Test przy użyciu losowo pobranych próbek pierwszej porcji
moczu (określanej jako pierwsze 10 do 50 ml strumienia moczu). Nie oceniano
wpływu innych zmiennych, takich jak pierwsza porcja moczu w porównaniu do
środkowej, próbki pobrane po kąpieli itd.
Nie oceniano również wpływu innych potencjalnych zmiennych, takich jak
upławy, stosowanie tamponów, irygacje itd. oraz zmiennych związanych
z pobieraniem wymazu.
COBAS® AMPLICOR® CT Test nie ma na celu zastąpienie badania szyjki
macicy ani pobierania próbek z kanału szyjki macicy w diagnostyce zakażeń
moczowo-płciowych. Występujące u chorych zapalenie szyjki macicy, zapalenie
29/36
cewki moczowej, zakażenia dróg moczowych lub pochwy może mieć inne
przyczyny lub może być wywoływane przez równoczesne zakażenie innymi
patogenami.
Substancje wpływające na wynik testu
Obecność substancji hamujących PCR może dawać wyniki fałszywie ujemne.
Poniżej zamieszczono listę części substancji wpływających na wynik testu:
•
Stwierdzono, że środek zwilżający Replens® hamuje PCR i może
powodować fałszywie negatywne wyniki niniejszego testu.
•
Obecność śluzu w próbkach pobranych z szyjki macicy może hamować PCR
i powodować fałszywie negatywne wyniki testu. Celem optymalnej
skuteczności testu zaleca się stosowanie próbek wolnych od śluzu. Aby
usunąć wydzielinę szyjki macicy i upławy, należy przed pobraniem próbki
stosować gąbkę lub duży gazik19.
•
Próbki zawierające powyżej 5% (v/v) krwi mogą dać fałszywie dodatnie
wyniki. W badaniach klinicznych 689 spośród 2306 wymazów u kobiet
zawierało treść krwistą. Częstość występowania wyników fałszywie
dodatnich w tych próbkach nie była wyższa.
Charakterystyka skuteczności
Swoistość analityczna:
hodowle komórkowe
i wirusów
Swoistość COBAS® AMPLICOR® CT Test oceniono dodając hodowli
komórkowych lub wirusów do normalnego moczu pobranego od ludzi oraz
moczu pobranego do CTM. CTM i mocz poddano obróbce a następnie badaniu
przy użyciu procedury badania COBAS® AMPLICOR® CT. Wiele spośród
badanych mikroorganizmów izolować można z dróg moczowo-płciowych.
W przypadku żadnego spośród poniższych drobnoustrojów czy wirusów nie
stwierdzono dodatniego wyniku badania przy użyciu COBAS® AMPLICOR®
CT Test:
Achromobacter xerosis
Acinetobacter calcoaceticus
Acinetobacter lwoffi
Acinetobacter sp. genogatunki 3
Actinomyces israelii
Aerococcus viridans
Aeromonas hydrophila
Agrobacterium radiobacter
Alcaligenes faecalis
Bacillus subtilis
Bacillus thuringiensis
Bacteroides fragilis
Bacteroides caccae
Bacteroides gracilis
Bifidobacillus longum
Bifidobacterium adolescentis
Branhamella catarrhalis
Brevibacterium linens
Candida albicans
Candida glabrata
Candida guilliermondi
Candida krusei
30/36
Lactococcus lactis subsp. cremoris
Legionella bozemnii
Legionella pneumophila
Leuconostoc paramesenteroides
Micrococcus luteus
Mobiluncus curtsil subsp. curtsii
Mobiluncus curtsil subsp. holmesii
Moraxella osloensis
Morganella morganii
Mycobacterium smegmatis
Mycoplasma genitalium
Mycoplasma hominis
Mycoplasma pneumoniae
Neisseria cinerea
Neisseria elongata
Neisseria flavescens
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria kochi
Neisseria lactamica
Neisseria meningitidis W135
Neisseria mucosa
Neisseria perflava
Candida parapsilosis
Candida tropicalis
Chlamydia pneumoniae
Chlamydia psittaci
Chromobacter violaceum
Chryseobacterium meningosepticum
Citrobacter freundii
Clostridium innocuum
Clostridium perfringens
Corynebacterium genitalium
Corynebacterium xerosis
Cryptococcus neoformans
Cytomegalowirus
Deinococcus radiopugnans
Derxia gummosa
Echerichia coli
Edwardsiella tarda
Eikenella corrodens
Enterobacter cloacae
Enterococcus avium
Enterococcus faecium
wirus Epstein Barr
Erysipelothrix rhusiopathiae
Ewingella americana
Gardnerella vaginalis
Gemella haemolysans
Gemella morbillorum
Haemophilus ducreyi
Haemophilus influenzae
wirus Herpes simplex 1
wirus Herpes simplex 2
ludzki wirus papilloma typ 16
ludzki wirus papilloma typ 18
Kingella kingae
Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae
Lactobacillus acidophillus
Lactobacillus brevis
Lactobacillus crisptus
Lactobacillus jensenii
Lactobacillus lactis subsp. lactis
Lactobacillus oris
Lactobacillus parabuchnerri
Lactobacillus vaginalis
Neisseria polysaccharea
Neisseria sicca
Neisseria subflava
Paracoccus denitrificans
Pasteurella maltocida
Pediococcus acidilactica
Peptostreptococcus anaerobius
Peptostreptococcus magnus
Peptostreptococcus productus
Prevotella bivia
Prevotella corporis
Prevotella intermedia
Propionibacterium acnes
Proteus mirabilis
Providencia stuartii
Pseudomonas putida
Pseudomonas aeruginosa
Rahnella aquatilis
Rhodospirillum rubrum
Salmonella minnesota
Salmonella typhimurium
Serratia marcescens
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus agalactiae
Streptococcus anginosus
Streptococcus bovis
Streptococcus dysgalatia
Streptococcus equinis
Streptococcus mitis
Streptococcus mutans
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Streptococcus salivarius
Streptococcus sanguis
Streptomyces griseinus
Treponema pallidum*
Trichomonas vaginalis
Ureaplasma urealyticum
Vibrio parahaemolyticus
Yersinia enterocolitica
* Dodawano oczyszczony DNA do poddanego obróbce CTM i moczu.
31/36
Czułość analityczna:
oczyszczone DNA
W badaniu czułości analitycznej dla oczyszczonego DNA, COBAS® AMPLICOR® CT
Test wykazał zdolność detekcji w sposób powtarzalny 5 lub więcej kopii
oczyszczonego DNA C. trachomatis na jedną reakcję PCR. Liczbę kopii DNA
C. trachomatis DNA użytych w tym eksperymencie oszacowano za pomocą analizy
Poissona.
Czułość analityczna:
COBAS® AMPLICOR® CT jest w stanie wykryć pojedynczą IFU C. trachomatis
komórki C. trachomatis na reakcję PCR. Taką czułość analityczną określono na drodze seryjnych
rozcieńczeń mianowanych bulionów hodowlanych każdego z 12 wariantów
serologicznych C. trachomatis w CTM. Próbki każdego rozcieńczenia poddano
obróbce i następnie zbadano przy użyciu standardowej procedury COBAS®
AMPLICOR® CT Test. Dla każdego wariantu serologicznego rozcieńczenie CTM
zawierające 80 IFU/ml, odpowiadające 1 IFU na reakcję amplifikacji, dało silny
dodatni sygnał.
Precyzja
Precyzję wewnątrz przebiegu oznaczeń, między cyklami, między dniami oraz precyzję
całkowitą COBAS® AMPLICOR® CT Test określono przy użyciu kontroli (+) CT.
Kontrolę (+) CT poddano obróbce, a następnie rozcieńczono buforami do przygotowania
próbek, aby uzyskać stężenia 0, 5, 10 i 20 kopii DNA/reakcję amplifikacji. Przez okres
ośmiu dni, trzech laborantów jednokrotnie w ciągu danego dnia badało pięć powtórzeń
każdego stężenia DNA. Zatem codziennie poddawano amplifikacji 15 kopii z każdego
stężenia DNA, a każda amplifikacja analizowana była dwukrotnie, dając w sumie
240 kopii. Patrz tabela 1.
Tabela 1
Precyzja testu COBAS® AMPLICOR® CT Test*
Liczba kopii badanych
CT/PCR
0
kopii/PCR
5
kopii/PCR
10
kopii/PCR
20
kopii/PCR
240
240
240
240
Średnia absorbancja
Wartość minimalna
Wartość maksymalna
0,014
0,002
0,031
3,978
3,559
4,000
3,942
1,770
4,000
3,942
3,478
4,000
Między dniami
Odchylenie standardowe
Współczynnik zmienności
0,0012
8,9%
0,00360
0,1%
0,00964
0,2%
0,01604
0,4%
Między przebiegami
0,0064
45,7%
0,02875
0,7%
0,09561
2,4%
0,00474
0,1%
Wewnątrz przebiegu
0,0030
21,8%
0,06694
1,7%
0,20616
5,2%
0,09978
2,5%
Łącznie
0,0072
51,4%
0,07295
1,8%
0,22746
5,8%
0,10117
2,6%
Całkowita liczba powtórzeń
* Obliczenia oparto na wytycznych CLSI (EP5A) dla precyzji wewnątrz przebiegu oznaczeń
i precyzji całkowitej.
32/36
COBAS® AMPLICOR® CT Test oceniono w badaniu klinicznym przeprowadzonym
w pojedynczym ośrodku badawczym. Łącznie przebadano 144 wymazy z kanału
szyjki macicy, 144 próbki kobiecego moczu, 50 wymazów z cewki moczowej
u mężczyzn oraz 50 próbek moczu od mężczyzn. W pewych ośrodkach metodą
referencyjną było badanie odpowiednio dobranych wymazów i próbek moczu
pobranych od każdego pacjenta za pomocą testu Culture.
Skuteczność kliniczna
Próbki z rozbieżnymi wynikami badań analizowano, powtarzając COBAS®
AMPLICOR® CT Test oraz wykonując PCR dla alternatywnej sekwencji DNA
swoistej dla Chlamydii (część genu głównego białka zewnętrznej błony
komórkowej)20. Wyniki ustalano na dwa sposoby. W pierwszej z metod (analiza
próbek) próbki zakażone w oparciu o badanie referencyjne, które dawały ujemny
wynik testu identyfikowano przy użyciu wyników PCR tylko dla jednego typu
próbek (wymaz lub mocz). Pacjenci byli klasyfikowani jako zakażenie dodatnie
jeśli wynik testu referencyjnego był dodatni lub jeśli badana próbka była dodatnia
w PCR zarówno dla głównych jak i drugorzędowych sekwencji docelowych.
W drugiej z metod (analizie pacjentów) próbki zakażone w oparciu o badanie
referencyjne, które dawały ujemny wynik testu identyfikowano przy użyciu
wyników PCR zarówno dla wymazów jak i próbek moczu pobranych od jednego
pacjenta. Pacjenci byli klasyfikowani jako zakażeni jeśli wynik testu referencyjnego
był dodatni lub jeśli jeden z badanych rodzajów próbki był dodatni w PCR zarówno
dla głównych jak i drugorzędowych sekwencji docelowych.
Skuteczność testu obliczono oddzielnie dla każdego rodzaju próbek. Czułość
i swoistość obliczano porównując wyniki z wynikami testu odniesienia, wynikami
po przetworzeniu dla próbek i wynikami po przetworzeniu dla pacjentów.
Prawdziwą czułość i swoistość kliniczną COBAS® AMPLICOR® CT Test należy
oceniać w porównaniu do wyników ustalonych dla danego chorego.
Skuteczność CT bez stosowania kontroli wewnętrznej w porównaniu z hodowlą
Ośrodek
Rodzaj próbki N
1 mocz u mężczyzn
Częstość
występowania
50
20,0%
wymaz u mężczyzn 50
20,0%
mocz u kobiet
144
15,3%
wymaz u kobiet
144
15,3%
vs hodowla
Czułość
Swoistość
vs wyniki zweryfikowane
na próbkę
na pacjenta
Czułość
Swoistość
Czułość
Swoistość
100,0%
(2/2)
100,0%
(2/2)
60,0%
(3/5)
60,0%
(3/5)
79,2%
(38/48)
85,4%
(41/48)
87,1%
(121/139)
87,1%
(121/139)
100,0%
(10/10)
100,0%
(9/9)
90,0%
(18/20)
90,5%
(19/21)
95,0%
(38/40)
100,0%
(41/41)
97,6%
(121/124)
98,4%
(121/123)
100,0%
(10/10)
90,0%
(9/10)
81,8%
(18/22)
86,4%
(19/22)
95,0%
(38/40)
100,0%
(40/40)
97,5%
(119/122)
98,4%
(120/122)
Skuteczność CT przy użyciu kontroli wewnętrznej w porównaniu z hodowlą
Ośrodek Rodzaj
próbki
1
mocz u
mężczyzn
Wymaz u
mężczyzn
mocz
u kobiet
wymaz
u kobiet
N
Częstość Zahamo- vs hodowla
występowania wanie
Czułość
Swoistość
50
20%
50
20%
144
15,3%
144
15,3%
2,0%
(1/50)
–
(0/50)
10,4%
(15/144)
2,8%
(3/144)
100,0%
(2/2)
100,0%
(2/2)
75,0%
(3/4)
60,0%
(3/5)
79,2%
(38/48)
85,4%
(41/48)
86,3%
(113/131)
86,9%
(119/137)
vs wyniki zweryfikowane
na próbkę
na pacjenta
Czułość
Swoistość
Czułość
Swoistość
100,0%
(10/10)
100,0%
(9/9)
94,7%
(18/19)
90,5%
(19/21)
95,0%
(38/40)
100,0%
(41/41)
97,4%
(113/116)
98,3%
(119/121)
100,0%
(10/10)
90,0%
(9/10)
85,7%
(18/21)
86,4%
(19/22)
95,0%
(38/40)
100,0%
(40/40)
97,4%
(111/114)
98,3%
(118/120)
33/36
Piśmiennictwo
1.
Schachter, J. and Stamm, W.E. 1999. Chlamydia. In: Manual of Clinical
Microbiology, (P.R. Murray, ed.) 7th ed., ASM Press, Washington, D.C., 795-800.
2.
Grayston, J.T., Kuo, C.C., Campbell, L.A. et al. 1989. Chlamydia
pneumoniae sp. nov. for Chlamydia sp. strain TWAR. International Journal of
Systematic Bacteriology 39: 88-90.
3.
Grayston, J.T. 1990. Chlamydia pneumoniae, strain TWAR. In: Chlamydial
Infections: Proceedings of the Seventh International Symposium on Human
Chlamydial Infections, W.R. Bowie, et al., Cambridge University Press, New
York, 389-401.
4.
Gerbase, A., Rowley J.T., and Mertens, T.E. 1998. Global epidemiology of
sexually transmitted diseases. Lancet 351:(S3) 2-4.
5.
Screening Tests to detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae
Infections 2002. Morbidity and Mortality Weekly Reports 2002 51: (No. RR15): 1-48.
6.
Thompson, S.E. and Washington, A. E. 1983. Epidemiology of sexually
transmitted Chlamydia trachomatis infections. Epidemiological Reviews.
5: 96-123.
7.
Pao, C.C., Lin, S-S, Yang, T-E., et al. 1987. Deoxyribonucleic acid
hybridization analysis for the detection of urogenital Chlamydia trachomatis
infections in women. American Journal of Obstetrics and Gynocology. 156:
195-199.
8.
Loeffelholz, M. J., Lewinski, C. A., Silver, S. R. et al. 1992. Detection of
Chlamydia trachomatis in endocervical specimens by polymerase chain
reaction. Journal of Clinical Microbiology 30: 2847-2851.
9.
Chernesky, M. A., Lee, H., Schachter, J. et al. 1994. Diagnosis of Chlamydia
trachomatis urethral infection in symptomatic and asymptomatic men by
testing first-void urine in a ligase chain reaction assay. Journal of Infectious
Diseases 179: 1308-1311.
10. Schachter, J., Stamm, W. E. Chernesky, M. A., et al. 1992. Nonculture tests
for genital tract chlamydial infection: What does the package insert mean,
and will it mean the same thing tomorrow? Sexually Transmitted Diseases
19: 243-244.
11. Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of
β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of
sickle cell anemia. Science 230: 1350-1354.
12. Mullis, K.B. and Faloona, F.A. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a
polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155: 335-350.
34/36
13. Palmer, L. and Falkow, S. 1986. A common plasmid of Chlamydia
trachomatis. Plasmid 16: 52-63.
14. Peterson, E.M. and de la Maza, L.M. 1988. Restriction endonuclease analysis
of DNA from Chlamydia trachomatis biovars. Journal of Clinical
Microbiology 26: 625-629.
15. Longo, M.C., Berninger, M.L.S., and Hartley J.L. 1990. Use of uracil DNA
glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain
reactions. Gene 93: 125-128.
16. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 1999. Richmond,
J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC)
93-8395.
17. Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory
Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue.
Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA: CLSI, 1997.
18. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st
Edition, 2000. 704.
19. Guidelines for Treatment of Sexually Transmitted Diseases. Morbidity and
Mortality Weekly Reports 1998 (No. RR-1): 1-118.
20. Dutilh, B., Bebear, C., Rodriguez, P. et al. 1989. Specific amplification of a
DNA sequence common to all Chlamydia trachomatis serovars using the
polymerase chain reaction. Research Microbiology 140: 7-16.
21. Toye, B., Woods, W., Bobrowska, M., and Ramotar K. 1998. Inhibition of
PCR in genital and urine specimens submitted for Chlamydia trachomatis
testing. Journal of Clinical Microbiology 36:2356-2358.
35/36
"
Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA
Członek Grupy Roche
Distributed by
Roche Diagnostics
Indianapolis, IN 46256 USA
(For Technical Assistance call the
Roche Response Center
toll-free: 1-800 526 1247)
Roche Diagnostics
H7V 4A2 Laval, Quebec
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273 3433)
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
CH-6343 Rotkreuz
Roche Diagnostics
F-38240 Meylan
Roche Diagnostics GmbH
D-68298 Mannheim, Germany
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics SpA
Piazza Durante 11
I-20131 Milano
Roche Diagnostics S.L.
E-08006 Barcelona
Distribuidor em Portugal:
Roche Farmacêutica Química, Lda
P-2700 Amadora
ROCHE, COBAS, AMPLICOR, AMPLILINK, AMPLITAQ, AMPERASE i
TAQMAN są znakami towarowymi firmy Roche.
ROCHE RESPONSE CENTER jest znakiem serwisowym firmy Roche.
Bartels® jest zastrzeżonym znakiem towarowym, będącym własnością lub
stanowiącym przedmiot licencji członka grupy Trinity Biotech Plc.
Cząsteczki paramagnetyczne Dynabeads® są przedmiotem licencji od właściciela
patentów Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway. Dynabeads® jest
zarejestrowanym znakiem handlowym Dynal Biotech ASA, Oslo, Norwegia, na
który udzielono licencji firmie Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis,
Indiana.
Emulsit jest znakiem towarowym firmy Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.
Eppendorf Multipette® i Eppendorf Combitip® są zarejestrowanymi znakami
towarowymi firmy Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, Niemcy.
M4® i M4RT® są zastrzeżonymi znakami towarowymi firmy Remel, Inc.
ProClin® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Rohm and Haas
Company.
Replens® jest zarejestrowanym
Laboratories Inc.
znakiem
Copyright 2007, Roche Molecular Systems, Inc.
Wszelkie prawa zastrzeżone.
towarowym
firmy
Columbia
6/2007
(00058003569-05ENGL)
04497368001-04
36/36

COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test

Transkrypt

Podobne dokumenty

Informacja prasowa

Zestawy badań chłodziw

Opactwo cystersów p.w. N.M.P. i św. Bernarda,

SKRÓCONA INSTRUKCJA POBIERANIA PRÓBEK WODY DO

Praca Poglądowa Review Article

Instrukcja pobierania próbek gleb sadowniczych. • Próbki z pola

spis treści Próbki od pacjenta

Pobierz cały komunikat w formacie PDF

Panel diagnostyki niepłodności

Pobierz - Sysmex