62799_Platelia Candida_8L - Bio-Rad

PLATELIA™ CANDIDA Ab/Ac/Ak
62799
96 TESTÓW
TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO ILOŚCIOWEGO OZNACZANIA PRZECIWCIAŁ
ANTY-MANNANOWYCH CANDIDA W SUROWICY
1- PRZEZNACZENIE TESTU
Platelia™ Candida Ab/Ac/Ak jest mikropłytkowym, pośrednim testem immunoenzymatycznym do
ilościowego oznaczania przeciwciał anty-mannanowych Candida w surowicy.
2- ZALECENIA DO STOSOWANIA TESTU
Diagnostyka inwazyjnej kandydozy musi opierać się na połączeniu wyników badań w kierunku
przeciwciał anty-mannanowych oraz wykrywaniu krążącego antygenu mannanowego (Platelia™
Candida Ag nr kat. 62798). Połączenie wyników obu tych badań pozwala na wcześniejsze
diagnozowanie i podnosi czułość procedury rozpoznania inwazyjnej kandydozy w procesie pełnego
podejścia diagnostycznego, łączącego dane kliniczne z mykologicznymi oraz ewaluację endogennych
i jatrogennych czynników ryzyka13. Połączenie obu tych badań jest integralnym elementem klinicznego
i laboratoryjnego monitorowania pacjentów jako pomoc w podjęciu decyzji o przebiegu leczenia.
3- ZASADA DZIAŁANIA
Zakażenia wywołane przez Candida są najczęstszą formą zakażeń szpitalnych wywoływanych przez
grzyby1. Zakażenia układowe stanowią najcięższą postać z 30-70% śmiertelnością u pacjentów w
immunosupresji11. Diagnostykę tych zakażeń utrudnia brak swoistych dla zakażenia grzybiczego
objawów oraz niska czułość wykrywania metodą hodowli, mimo postępów poczynionych na tym polu.
Inwazyjną kandydozę w celu wdrożenia leczenia, diagnozuje się przeważnie na podstawie połączenia
danych klinicznych, mykologicznych i wiedzy o istniejących czynnikach ryzyka8. W tym kontekście,
diagnostyka kandydoz układowych musi obejmować badania serologiczne jak też i bezpośrednie
badanie mykologiczne.
Platelia™ Candida Ab/Ac/Ak umożliwia wykrywanie przeciwciał skierowanych przeciw antygenowi
mannanowemu, który jest głównym składnikiem ściany komórkowej drożdżaków należących do
rodzaju Candida2. Mannan, marker inwazyjnej kandydozy3, 4, jest wysoce immunogennym
polisacharydem2.
4- ZASADA OZNACZENIA
Test Platelia® Candida Ab/Ac/Ak jest dwustopniowym, pośrednim testem immunoenzymatycznym do
ilościowego wykrywania przeciwciał anty-mannanowych w surowicy ludzkiej.
Do dołków mikropłytki opłaszczonych oczyszczonym mannanem C.albicans dodawane są
rozcieńczone próbki surowicy. Po inkubacji paski płucze się, w celu usunięcia niezwiązanego
materiału. Następnie do studzienek dodawany jest koniugat. W obecności przeciwciał antymannanowych powstaje kompleks: mannan- ludzkie przeciwciało anty-mannanowe– kozie
przeciwciało anty-IgG/ peroksydaza. Paski płucze się, w celu usunięcia niezwiązanego materiału.
Następnie, dodaje się roztwór substratu, który reaguje z kompleksami związanymi z dołkiem
wywołując niebieskie zabarwienie. Po dodaniu kwasu, reakcja enzymatyczna zostaje zatrzymana, a
zabarwienie z niebieskiego zmienia się na żółte. Wartości absorbancji próbek i kontroli określa się
spektrofotometrycznie przy długości fali 450 i 620 nm.
1
5- SKŁAD ZESTAWU
Test Platelia™ Candida Ab/Ac/Ak nr kat. 62799
Zestaw należy przechowywać w temperaturze 2-8°C. Przed użyciem wszystkie odczynniki przenieść
do temperatury pokojowej (18-25°C). Natychmiast po użyciu wszystkie odczynniki powinny być
przeniesione do temperatury 2-8°C. Niezużyte paski/płytki włożyć do opakowania, zamknąć szczelnie.
Nie usuwać środka pochłaniającego wilgoć. Paski powinny być zużyte w ciągu 5 tygodni od
pierwszego otwarcia opakowania. Rozcieńczony bufor do płukania można przechowywać przez 14 dni
w temp. 2-8°C. Wszystkie pozostałe odczynniki po otwarciu są stabilne do daty ważności podanej na
opakowaniu. Dostarczona ilość odczynników wystarcza do przeprowadzenia 96 testów w maksimum 6
seriach.
Składnik
Mikropłytka
Zawartość
-96 dołków (12 pasków z 8 dołkami każdy) opłaszczonych
oczyszczonym antygenem mannanowym C.albicans.
Stężony bufor do - bufor Tris NaCl (pH 7.4)
płukania (10x)
- 1% Tween® 20
- 0,01% tiomersal
Kontrola ujemna
- Ludzka surowica ujemna pod względem przeciwciał antymannanowych.
- Jest ona ujemna pod względem przeciwciał anty-HIV-1 i
anty-HIV-2 oraz antygenów HBs i przeciwciał anty-HCV.
- Konserwant: < 0.1% azydek sodu
Surowica
- Zawiesina ludzkich przeciwciał anty-mannanowych,
kalibracyjna
uzyskanych z surowicy ujemnej pod względem przeciwciał
anty-HIV-1 i anty-HIV-2 oraz antygenów HBs i przeciwciał
anty-HCV. Stosowana do wykreślenia krzywej wzorcowej
(patrz p.10 Procedura).
- Jest ona ujemna pod względem przeciwciał anty-HIV-1 i
anty-HIV-2 oraz antygenów HBs i przeciwciał anty-HCV.
- Konserwant: < 0.1% azydek sodu
Kontrola Dodatnia - Ludzka surowica zawierająca przeciwciała anty-mannanowe.
- Jest ona ujemna pod względem przeciwciał anty-HIV-1 i
anty-HIV-2 oraz antygenów HBs i przeciwciał anty-HCV.
- Konserwant: < 0.1% azydek sodu
Koniugat (gotowy Antyglobulinowe
przeciwciała
kozie
znakowane
do użycia)
peroksydazą.
-Środek konserwujący: 0,01% tiomersal
Rozcieńczalnik
-kwaśny roztwór EDTA, bez środka konserwującego
próbek
(gotowy
do użycia)
Bufor
substratu -Roztwór kwasu cytrynowego i octanu sodu pH 5.2
TMB (gotowy do -0,009% Nadtlenek wodoru
użycia)
-4% Dwumetylosulfotlenek (DMSO)
Chromogen:
-90% roztwór dwumetylosulfotlenku (DMSO) zawierający 0,6%
roztwór
TMB tetrametylobenzydynę (TMB)*
(stężony)
Roztwór
-1.5 N Kwas siarkowy (H2SO4)
zatrzymujący(goto
wy do użycia)
Folia adhezyjna
Folia adhezyjna do mikropłytek
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
R8
R9
R10
Ilość
1 płytka /
12 × 8 dołków
1 × 100 ml
1 x 0.250 ml
1 x 0.250 ml
1 x 0.250 ml
1 × 12 ml
2 x 100 ml
1 × 60 ml
1 × 1 ml
1 × 12 ml
4 arkusze
*
Uwaga: TMB (tetrametylobenzydyna) - jest nierakotwórczym i niemutagennym substratem
chromogennym dla peroksydazy.
6- HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY
1. Wyrób do diagnostyki in vitro.
2. Tylko do użytku profesjonalnego.
3. Nie zaleca się stosowania próbek innych niż ludzka surowica.
2
4. Surowica kontrolna dodatnia, surowica kalibracyjna i surowica kontrolna ujemna to inaktywowana
termicznie surowica ludzka. Próbki zostały przebadane z użyciem zatwierdzonych we Francji
testów i uznane za ujemne w kierunku: przeciwciał anty-HIV -1/2 i anty-HCV, jak również
antygenu HBs. Ponieważ żadna ze znanych metod badawczych nie może dać całkowitej
pewności, co do nieobecności czynników zakaźnych, z odczynnikami jak i z próbkami pacjentów
należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym. Oznaczenia należy prowadzić z
zastosowaniem środków ochrony właściwych dla patogenów przenoszonych drogą krwi.
5. W trakcie pracy z odczynnikami i próbkami używać rękawiczek i okularów ochronnych. Po
wykonaniu testu umyć dokładnie ręce.
6. Nie pipetować ustami.
7. Nie palić, nie pić i nie jeść w miejscu pracy z próbkami i odczynnikami zestawu.
8. Unikać rozlania próbek i roztworów zawierających próbki.
9. Niezawierające kwasów rozlane płyny zawierające materiały biologiczne, należy wytrzeć
dokładnie z stosując środek dezynfekujący. Jako środka dezynfekującego można użyć między
innymi: 10% wybielacza (0.5% roztwór podchlorynu sodu), 70% etanolu lub 0.5% Wescodyne™.
W przypadku rozlania kwaśnych cieczy, należy je dokładnie wytrzeć bibułą lub zobojętnić
dwuwęglanem sodu, a następnie przemyć środkiem dezynfekującym. Materiały użyte do
wycierania rozlanych cieczy należy wyrzucić do pojemnika na odpady biologiczne.
UWAGA: Nie wstawiać roztworów zawierających wybielacz do autoklawu.
10. Wszystkie próbki i materiały używane do wykonania testu należy traktować jak materiał
potencjalnie zakaźny. Należy przestrzegać wszelkich wymagań odnośnie usuwania odpadów tego
rodzaju.
11. Niektóre z odczynników zestawu zawierają jako konserwant azydek sodu. W połączeniu z
ołowiem lub miedzią, azydek sodu może w kanalizacji tworzyć wybuchowe azydki metali.
Usuwając do kanalizacji inaktywowane roztwory zawierające azydki należy spłukać zlew dużą
ilością wody, aby zapobiec ich kumulacji.
12. UWAGA:
Xi - drażniący
1.5 N kwas siarkowy (H2SO4) i 90% DMSO (dwumetylosulfotlenek)
R36/38: Substancja drażniąca dla oczu i skóry.
S26-30: W razie kontaktu z oczami natychmiast przemyć dużą ilością wody i
zasięgnąć porady lekarza.
Nigdy nie dodawać wody do tego produktu.
13. Należy unikać kontaktu skóry i błon śluzowych z buforem do substratu, chromogenem i roztworem
zatrzymującym (możliwość zatrucia, podrażnienia i poparzenia).
14. Karta charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) jest dostępna na żądanie.
7- ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA
1. ZAMROŻONE PRÓBKI, PRZECHOWYWANE W NIEZNANYCH WARUNKACH MOGĄ DAWAĆ
WYNIKI
FAŁSZYWE DODATNIE Z POWODU ZANIECZYSZCZENIA GRZYBAMI I/LUB
BAKTERIAMI.
2. Nie używać odczynników po upływie terminu ważności.
3. Z wyjątkiem stężonego buforu do płukania (R2) oraz roztworu zatrzymującego (R10), nie mieszać
odczynników z różnych zestawów posiadających odmienny numer serii.
4. Przynajmniej 15 minut przed użyciem przenieść wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej.
5. Starannie mieszać odczynniki w trakcie rekonstytucji, unikając ich zanieczyszczenia.
6. Nie wykonywać testu w obecności reaktywnych par związków (kwasów, zasad, aldehydów) lub
kurzu, które mogą pływać na aktywność enzymatyczną koniugatu.
7. Do przygotowywania roztworu substrat-chromogen używać czystych, jednorazowych,
polipropylenowych pojemników. W przypadku stosowania naczyń szklanych, należy przemyć je
1N kwasem solnym, a następnie wypłukać wodą destylowaną i wysuszyć.
8. Podczas ręcznego pipetowania kontroli i próbek, w celu uniknięcia zanieczyszczania materiałem
pochodzącym z próbek, za każdym razem zmieniać jednorazową końcówkę.
3
9. W celu zapewnienia dokładnego przemycia dołków, należy przestrzegać zalecanej ilości cykli
płukania oraz zwracać uwagę, czy studzienki są całkowicie napełniane a następnie opróżniane.
Do przemywania nie należy stosować tryskawki.
10. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki między etapem płukania a dodawaniem kolejnego
odczynnika.
11. Nigdy nie używać tych samych pojemników dla roztworów koniugatu i substratu.
12. Nie dopuszczać do kontaktu koniugatu i roztworu substrat-chromogen z metalami i jonami metali.
13. Przechowując odczynniki i wykonując oznaczenie, unikać ekspozycji koniugatu i roztworu
substrat-chromogen na silne światło. Nie dopuszczać do kontaktu roztworów chromogenu z
utleniaczami.
14. Unikać kontaktu roztworu zatrzymującego z utleniaczami. Nie dopuszczać do kontaktu roztworu
zatrzymującego z metalami i jonami metali.
15. Ograniczyć do minimum kontakt roztworów (próbek, roztworu do przygotowywania próbek,
koniugatu) oraz otwartych pojemników (mikropłytek, próbówek i pipet) z powietrzem.
16. Nie zlewać niezużytego koniugatu do oryginalnego opakowania.
17. Roztwór substrat-chromogen musi być bezbarwny. Pojawienie się wkrótce po rozcieńczeniu
niebieskiego zabarwienia, wskazuje na zanieczyszczenie odczynnika i oznacza, iż nie może być
on stosowany. Należy przygotować nowy odczynnik.
8- PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW I WARUNKI PRZECHOWYWANIA
Mikropłytka (R1)
Po otwarciu oryginalnego opakowania, studzienki mikropłytek zachowują zdolność reakcyjną przez 5
tygodni, o ile są przechowywane w temp. 2-8 °C, w szczelnie zamkniętej torebce, w obecności
pochłaniacza wilgoci.
Stężony bufor do płukania (R2)
Przygotować roboczy bufor do płukania dodając jedną część stężonego buforu do płukania do
dziewięciu części jałowej wody dejonizowanej lub destylowanej. Roboczy bufor do płukania może być
przechowywany przez 14 dni w temp. 2-8°C. Przygotowywać odpowiednią ilość buforu na całe
badanie (80 ml buforu wystarcza na jeden pasek : 8 ml R2 + 72 ml wody destylowanej).
Stężony odczynnik po otwarciu należy przechowywać w temp. +2-25°C, przy braku zanieczyszczenia,
odczynnik jest stabilny do daty ważności podanej na opakowaniu.
Roztwór roboczy substrat-chromogen (R8 + R9)
Przygotować roztwór substrat-chromogen, dodając jedną część stężonego roztworu chromogenu TMB
(R9) do 50 części buforu substratu TMB (R8). Przygotować 2 ml roztworu substrat-chromogen na
każdy pasek: 40 µl (R9) + 2 ml (R8). Roztwór zachowuje trwałość przez 6 godz. przechowywany w
ciemności, w temperaturze pokojowej (+18-25°C).
Po otwarciu, odczynniki R8 i R9 przechowywane w temp. +2-8°C, przy braku zanieczyszczenia, są
stabilne do daty ważności podanej na opakowaniu.
Surowica kontrolna ujemna (R3), Surowica kalibracyjna (R4), Surowica kontrolna dodatnia (R5)
Koniugat (R6), rozcieńczalnik próbek (R7) i roztwór zatrzymujący (R10)
Po otwarciu, odczynniki R3, R4, R5, R6, R7 i R10 przechowywane w temp. +2-8°C przy braku
zanieczyszczenia, są stabilne do daty ważności podanej na opakowaniu.
9- POBIERANIE PRÓBEK
Pobrać krew zgodnie z rutynową procedurą. Oznaczenie należy wykonywać z użyciem surowicy.
Próbki surowicy muszą być wolne od spor grzybiczych i/lub bakterii. Próbówki z próbkami podczas
przechowywania i transportu powinny być szczelnie zamknięte, bez dostępu powietrza. Przed
oznaczeniem próbki w zamkniętej probówce, w temp. 2-8°C mogą być przechowywane przez 24
godziny. W celu dłuższego przechowywania surowicę należy zamrozić w -70°C.
Próbki surowicy mogą być zamrażane/rozmrażane najwyżej raz. Rozmrożone próbki przez
oznaczeniem należy dokładnie wymieszać.
Nie ogrzewać próbek.
4
Nie badano wpływu nadmiernych ilości albuminy, lipidów, hemoglobiny ani bilirubiny na wynik
oznaczenia.
Nie używać surowicy pozbawionej dopełniacza.
10- PROCEDURA
Materiały dostarczone
Patrz rozdział ODCZYNNIKI.
Materiały potrzebne, ale niedostarczone w zestawie
1. Jałowa woda destylowana lub dejonizowana, do rozcieńczania buforu do płukania.
2. Bibuła.
3. Rękawice jednorazowego użytku.
4. Okulary ochronne.
5. Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu.
6. Pipety lub pipety wielokanałowe, nastawne lub stało-objętościowe, pozwalające odmierzać i
dozować 2 µl, 100 µl, i 400 µl.
7. Próbówki do rozcieńczania próbek surowicy
8. Wortex.
9. Inkubator mikropłytek nastawiony na temp. 37 ± 1°C.
10. Półautomatyczna lub automatyczna płuczka mikropłytek.
11. Czytnik mikropłytek wyposażony w filtry 450nm i 620 nm.
12. Pojemnik na odpady zakaźne.
Uwagi proceduralne
W celu walidacji każdej serii oznaczeń należy zawsze stosować surowice kontrolne: ujemną, dodatnią
oraz standardy.
Przygotowanie standardów
Stężenie przeciwciał anty-mannanowych wyrażane jest w jednostkach umownych AU/ml (Arbitrary
Units):
• Standard 20 AU/ml: rozcieńczenie 1:441 R4 w R7: dwa kolejne rozcieńczenia 1:21 (40 μl + 800 μl
rozcieńczalnika).
• Standard 10 AU/ml: rozcieńczenie 1:2 standardu 20 AU/ml (200 μl + 200 μl rozcieńczalnika).
• Standard 5 AU/ml: rozcieńczenie 1:4 standardu 20 AU/ml (100 μl + 300 μl rozcieńczalnika).
• Standard 2.5 AU/ml: rozcieńczenie 1:8 standardu 20 AU/ml (50 μl + 350 μl rozcieńczalnika).
Przygotowanie próbek i kontroli
• Wykonać dwa kolejne rozcieńczenia 1/81 (10 μl surowicy + 800 μl R7); podobnie przygotować
kontrolę dodatnią i ujemną.
Procedura testu EIA
Oznaczenie należy wykonać ściśle wg opisanej procedury.
Stosować się do zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej.
1. Wszystkie odczynniki przenieść do temperatury pokojowej (18 - 25°C) przynajmniej 15 min. przed
użyciem.
2. Przygotować bufor do płukania, roztwór substrat-chromogen oraz surowice kontrolne: dodatnią,
ujemną i standardy.
3. Należy ustalić rozkład używanych dołków dla badanych surowic, standardów (20, 10, 5 i 2.5
AU/ml) i kontroli.
- A1: surowica kontrolna ujemna (R3)
- B1: surowica kontrolna - standard 2.5 AU/ml
- C1: surowica kontrolna - standard 5 AU/ml
- D1: surowica kontrolna - standard 10 AU/ml
- E1: surowica kontrolna - standard 20 AU/ml
- F1: surowica kontrolna dodatnia (R5)
- G1: surowica kontrolna dodatnia(R5)
5
4. Wyjąć ramkę i paski (R1) z opakowania. Paski, które nie będą używane schować do opakowania
z pochłaniaczem wilgoci i szczelnie zamknąć.
5. Do dołków dodać po 100 µl rozcieńczonych próbek, kontroli i standardów.
6. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną lub podobnym materiałem, tak by zapewnić ochronę
przed odparowaniem płynu z dołków. Upewnić się, iż zamknięcie jest wodoszczelne i przykryta
jest cała powierzchnia.
7. Inkubowa płytk w suchym inkubatorze mikropłytek przez 60 ± 5 min. w temp. 37°C (± 1°C).
8. Zdjąć przykrycie. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika na odpady z podchlorynem
sodu). Wykonać 4 cykle płukania. Po ostatnim płukaniu, odwracając i ostukując, osuszyć
mikropłytkę z resztek płynu na bibule.
9. Przed użyciem koniugat (R6) wymieszać przez odwracanie.
10. Dodać po 100 µl koniugatu (R6) do każdego dołka.
11. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną lub podobnym materiałem, tak by zapewnić ochronę
przed odparowaniem płynu z dołków. Upewnić się, iż zamknięcie jest wodoszczelne i przykryta
jest cała powierzchnia.
12. Inkubowa płytk w suchym inkubatorze mikropłytek przez 60 ± 5 min. w temp. 37°C (± 1°C).
13. Zdjąć przykrycie. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika na odpady z podchlorynem
sodu). Wykonać 4 cykle płukania. Po ostatnim płukaniu, odwracając i ostukując, osuszyć
mikropłytkę z resztek płynu na bibule.
14. Unikając ostrego światła, szybko nanieść do studzienek po 200 ul roztworu substrat-chromogen
(R8+R9).
15. Inkubować mikropłytkę w ciemności, przez 30 ± 5 min, w temp. pokojowej (18-30°C). Nie
zakrywać folią adhezyjną.
16. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 ul roztworu
zatrzymującego (R10). Roztwór ten dodawać w tej samej kolejności jak roztwór substratu.
Wymieszać dokładnie.
17. Wytrzeć starannie spód każdej mikropłytki.
18. Odczytać gęstość optyczną dla każdego dołka przy 450 nm (z filtrem referencyjnym 620 nm).
Wyniki odczytać w ciągu 30 min. od zatrzymania reakcji.
11- KONTROLA JAKOŚCI (KRYTERIA WAŻNOŚCI)
Następujące kryteria muszą być spełnione w celu walidacji oznaczenia:
• Wartość gęstości optycznej:
0.400< OD standardu 5 AU/ml < 1.200
• Proporcje:
OD standardu 20 AU/ml / OD standardu 5 AU/ml > 2
OD standardu 10 AU/ml / OD standardu 5 AU/ml > 1.4
OD standardu 2.5 AU/ml / OD standardu 5 AU/ml < 0.8
• Stężenie przeciwciał anty-mannanowych:
Stężenie R3: < 2.5 AU/ml
Stężenie R5: stężenie podane na fiolce ± 2.5 AU/ml
12- INTERPRETACJA WYNIKÓW
Krzywa wzorcowa
Krzywą wzorcową wyznaczają cztery punkty, odpowiadające wartościom uzyskanym dla czterech
standardów: 2.5, 5, 10, i 20 A/U, będących rozcieńczeniami dodatniej surowicy kalibracyjnej (R4). do
krzywej nie włącza się wartości surowic kontrolnych, dodatniej (R5) i ujemnej (R3).
Aby uzyskać najwyższą precyzję, należy ekstrapolując wykreślić krzywą sigmoidalną na osi X
zaznaczając stężenie przeciwciał w jednostkach AU/ml (skala logarytmiczna), na osi Y wartości
odczytu OD (skala liniowa).
Jeśli czytnik nie posiada opcji definiowania skali, należy wykreślić krzywą łączącą punkty
odpowiadające wartościom standardów.
6
Oznaczenie stężenia przeciwciał anty-mannanowych w badanej surowicy
Krzywa wzorcowa może być użyta do odczytania stężenia przeciwciał anty-mannanowych w AU/ml
dla każdej z badanych surowic.
Interpretacja wyników
• Próbki surowicy z poziomem przeciwciał poniżej 5 AU/ml (C < 5) są uznawane za „ujemne”
pod względem obecności przeciwciał anty-mannanowych.
• Próbki surowicy z poziomem przeciwciał pomiędzy 5 -10 AU/ml (5 ≤ C < 10) są uznawane za
„pośrednie” pod względem obecności przeciwciał anty-mannanowych.
• Próbki surowicy z poziomem przeciwciał powyżej 10 AU/ml (C ≥ 10) są uznawane za
„dodatnie” pod względem obecności przeciwciał anty-mannanowych.
• Krzywa wzorcowa wykreślona w oparciu o standardy nie pozwala na dokładne określenie poziomu
przeciwciał, jeżeli ich stężenie wynosi powyżej 20 AU/ml. W celu uzyskania bardziej pracyzyjnych
wyników dla silnie dodatnich surowic, test należy powtórzyć po rozcieńczeniu badanej surowicy
1:4 w roztworze do rozcieńczania próbek (R7) zanim wykonane zostanie rozcieńczenie opisane w
procedurze wykonania testu (patrz punkt 10). Uzyskany wynik OD pomnożyć przez 4.
Określenie poziomu przeciwciał anty-mannanowych jest istotne przy określaniu statusu
immunologicznego chorego w stosunku do zakażenia Candida. Obecność przeciwciał odzwierciedla
obecność grzybów z rodzaju Candida i musi być interpretowana jako dodatkowy czynnik ryzyka
rozwoju układowej kandydozy u pacjentów z grupy ryzyka5, 13. Nagły wzrost poziomu przeciwciał mówi
o przejściu do fazy aktywnego zakażenia: wyniki te powinny być interpretowane w świetle danych
klinicznych.
W diagnostyce inwazyjnej kandydozy monitorowanie miana przeciwciał powinno być połączone z
określeniem miana antygenu krążącego.
Wykonywanie regularnych badań skryningowych jest bardziej informatywne, niż wynik pojedynczego
oznaczenia i umożliwia monitorowanie pacjentów z grup wysokiego ryzyka7, 12.
Zalecane jest wykonywanie regularnych badań skryningowych u pacjentów z grupy wysokiego ryzyka,
aby podnieść czułość procedury i uchwycić wczesną konwersję na wynik dodatni testu.
13- OGRANICZENIA TESTU
1. Wynik ujemny nie wyklucza rozpoznania inwazyjnej kandydozy. Trudno jest interpretować
brak przeciwciał u pacjentów z upośledzonym układem odpornościowym.
2. Ujemny wynik w teście wykrywającym przeciwciała anty-mannanowe należy interpretować
jednocześnie z wynikiem testu wykrywającego antygen mannanowy: u pacjentów dodatnich w
kierunku przeciwciał anty-mannanowych trudniej jest wykryć antygen mannanowy (patrz p. 14
Charakterystyka testu).
3. Na wykrywanie antygenu mannanowego w surowicy ma wpływ ilość testów wykonanych dla
danego pacjenta4. Regularne monitorowanie pacjentów wysokiego ryzyka oraz wykonywanie testu
na obecność przeciwciał anty-mannanowych podnosi czułość procedury i pozwala uchwycić
wczesną konwersję na wynik dodatni.
4. Wykonując oznaczenie należy przestrzegać procedury wykonania testu oraz zasad interpretacji
wyników testu Platelia™ Candida Ab/Ac/Ak.
Przed przystąpieniem do wykonania testu
użytkownik powinien dokładnie zapoznać się z instrukcją obsługi. W szczególności dokładnie
przestrzegana musi być procedura pipetowania próbek i odczynników, płukania płytki oraz czasy
inkubacji.
5. Dodanie próbki lub odczynnika niezgodnie z procedurą może prowadzić do uzyskania wyników
fałszywie ujemnych. Należy rozważyć powtórzenie badania dla kolejnej próbki w przypadku
podejrzenia inwazyjnej kandydozy w oparciu o dane kliniczne lub wystąpienia błędu
proceduralnego.
6. W przypadku nieostrożnego obchodzenia się z mikropłytkami lub technicznie nieprawidłowego
pipetowania odczynników, możliwe jest zanieczyszczenie dołków z ujemną próbką pacjenta na
skutek przelania się do nich zawartości dołka z kontrolą lub próbką dodatnią.
7
14- CHARAKTERYSTYKA TESTU
14.1. Powtarzalność
Współczynnik zmienności wyliczony w badaniach powtarzalności wewnątrz-testowej (30 replikatów) i
między-testowej (5 dni) potwierdził wysoką jakość testu ( współczynnik zmienności (AU/ml) < 10% dla
próbek dodatnich, natomiast pomiędzy testami, oraz współczynnik zmienności < 17.5% dla próbek
dodatnich w badaniach między-testowych).
• Powtarzalność wewnątrz-testowa:
4 surowice (1 ujemna, 2 pośrednie o stężeniu przeciwciał 8.5 AU/ml i 9.7 AU/ml, oraz 1 dodatnia o
stężeniu 14.4 AU/ml) oznaczono w 30 powtórzeniach. Uzyskano dla nich powtarzalność wynoszącą
odpowiednio 3.6%, 4.8%, 6.9% i 5.4%.
• Powtarzalność pomiędzy-testowa:
Przez 5 dni oznaczano 4 surowice ujemne, 1 pośrednią i 2 dodatnie. Współczynnik zmienności
wynosił < 17.5% dla wartości uzyskiwanych dla surowic dodatnich i pośredniej.
14.2. Oznaczenia kliniczne
SWOISTOŚĆ
Test Platelia™ Candida Ab/Ac/Ak, wykonany na próbkach surowic od 700 hospitalizowanych chorych,
charakteryzował się 83% korelacją (współczynnik Spearmana) z metodą immunofluorescencyjną
wykrywania przeciwciał10.
Swoistość testu, uzyskana dla różnych populacji pacjentów, przedstawia tabela.
Stężenie przeciwciał anty-mannanowych uzyskane dla różnych populacji badanych w oznaczeniu
testem Platelia™ Candida Ab/Ac/Ak:
Kategoria pacjentów
Nie wybierani
Hospitalizowani
Nie skolonizowani
Hospitalizowani
Skolonizowani Candida
Inwazyjna kandydoza
C < 2.5
Stężenie przeciwciał (AU/ml)
2.5 ≤ C < 5
5 ≤ C < 10
10 ≤ C < 20
Liczba
pacjentów
(surowic)
173 (173)
33 (62)
C ≥ 20
82.1% (142)
84.9% (28)
11% (19)
9.1% (3)
4.6% (8)
3.0% (1)
1.7% (3)
0.6% (1)
3.0% (1)
102 (221)
20.6% (21)
11.8% (12)
31.4% (32)
22.5% (23)
13.7% (14)
117 (384)
25.6% (30)
8.5% (10)
20.5% (24)
16.2% (19)
29.2% (34)
CZUŁOŚĆ
W celu oceny czułości testu Platelia™ Candida Ab/Ac/Ak przeprowadzono badania w czterech
szpitalach akademickich na terenie Francji. Wykonano badania retrospektywne dla 337 surowic (117
pacjentów) z różnych oddziałów szpitalnych (chirurgia, hematologia, OIOM, oparzeniowy, itp.).
Drożdżaki z rodzaju Candida były izolowane z krwi tych pacjentów lub z głębokich materiałów
klinicznych6, 9, 10.
Dla badanej populacji, uzyskano dla testu Platelia™ Candida Ab/Ac/Ak uzyskano ogólną czułość 60%
(wyłączając 16% pacjentów, dla których uzyskano wynik pośredni pomiędzy 5 a 10 AU/ml).
8
Czułość testu różniła się w zależności od izolowanego gatunku Candida:
Gatunek
Czułość
Liczba pacjentów
(liczba surowic)
C ≥ 10
C.tropicalis
C.glabrata
C.albicans
C.kefyr
C.parapsilosis
C.krusei
10 (72)
12 (31)
75 (219)
2 (5)
10 (29)
8 (21)
66.7 %
30.0%
71.0 %
50.0 %
25.0 %
42.9 %
C ≥ 10 i 5 ≤ C < 10
76.7 %
46.7 %
88.3 %
50.0 %
45.0 %
62.9 %
Badania te wykazały celowość jednoczesnego wykonywania testu na obecność przeciwciał antymannanowych i testu Platelia™ Candida Ag, wykrywającego antygen krążący.
Testy te wykonano dla 106 pacjentów z inwazyjną kandydozą9, 10. Uzyskano czułość 84.8%
(wyłączając 6.6% pacjentów, dla których uzyskano wynik pośredni pomiędzy 5 a 10 AU/ml).
Wykazano nie tylko przydatność wykonywania obu oznaczeń dla populacji wysokiego ryzyka, ale i
obserwować można także balans pomiędzy wynikami obu tych testów podczas jednego epizodu
zakażenia Candida, co może być pomocne w prognozie rozwoju infekcji14.
16- KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA
Wszystkie produkty Bio-Rad są przygotowane zgodnie z naszym systemem jakości, poczynając od
materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego.
Każda seria ostatecznego produktu podlega oznaczeniu kontrolnemu i jest dopuszczona do użytku,
jeśli spełnia wymagane kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii.
17- BIBLIOGRAFIA
1.
FRIDKIN, S. K. and W. R. JARVIS. 1996. Epidemiology of nosocomial fungal infections.
Clin. Microbiol. Rev. 9: p. 499-511.
2.
FUKAZAWA, Y. 1989. Antigenic structure of Candida albicans. Immunochemical basis of
the serologic specificity of the mannans in yeasts. Immunol. Ser. 47: p. 37-62.
3.
HERENT, P., D. STYNEN, F. HERNANDO, J. FRUIT, and D. POULAIN. 1992.
Retrospective evaluation of two latex agglutination tests for detection of circulating antigens
during invasive candidosis. J. Clin. Microbiol. 30: p. 2158-64.
4.
PONTON, J., M. MORAGUES, and G. QUINDOS. 2002. Non-Culture-Based Diagnostics, p.
395-425. In R. Calderone (ed.), Candida and Candidiasis. ASM Press, Washington, D.C.
5.
POULAIN, D. 2000. Physiopathologie et diagnostic des candidoses systémiques. La Lettre
de l'Infectiologue 15: p. 182-190.
6.
RODIER, M.H., C. KAUFFMAN-LACROIX, P. GAUTRET, D. MAYET and J.L.
JACQUEMIN. 1999. Evaluation of a mettalopeptidase antigen from Candida albicans in
serodiagnosis of candidosis : comparison of technics. Journal Mycologie Médicale 9: p. 149153.
7.
RUCHEL, R. 1993. Diagnosis of invasive mycoses in severely immunosuppressed patients.
Ann. Hematol. 67: p. 1-11.
8.
RUHNKE, M. and G. MASCHMEYER. 2002. Management of mycoses in patients with
hematologic disease and cancer - review of the literature. Eur. J. Med. Res. 7: p. 227-235.
9
9.
SENDID, B., J. L. POIROT, M. TABOURET, A. BONNIN, D. CAILLOT, D. CAMUS, and D.
POULAIN. 2002. Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a
strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J.
Med. Microbiol. 51: p. 433-442.
10. SENDID, B., M. TABOURET, J. L. POIROT, D. MATHIEU, J. FRUIT, and D. POULAIN.
1999. New enzyme immunoassays for sensitive detection of circulating Candida albicans
mannan and antimannan antibodies: useful combined test for diagnosis of systemic
candidiasis. J. Clin. Microbiol. 37: p. 1510-1517.
11. TIRABOSCHI, I. N., J. E. BENNETT, C. A. KAUFFMAN, J. H. REX, C. GIRMENIA, J. D.
SOBEL, and F. MENICHETTI. 2000. Deep Candida infections in the neutropenic and nonneutropenic host: an ISHAM symposium. Med. Mycol. 38 Suppl 1: p. 199-204.
12. VAN DEVENTER, A. J., W. H. GOESSENS, J. H. VAN ZEIJL, J. W. MOUTON, M. F.
MICHEL, and H. A. VERBRUGH. 1996. Kinetics of anti-mannan antibodies useful in
confirming invasive candidiasis in immunocompromised patients. Microbiol. Immunol. 40: p.
125-131.
13. VERWEIJ, P. E., D. POULAIN, T. OBAYASHI, T. F. PATTERSON, D. W. DENNING, and
J. PONTON. 1998. Current trends in the detection of antigenaemia, metabolites and cell
wall markers for the diagnosis and therapeutic monitoring of fungal infections. Med. Mycol.
36 Suppl 1: p. 146-155.
14. YERA, H., B. SENDID, N. FRANCOIS, D. CAMUS, and D. POULAIN. 2001. Contribution of
serological tests and blood culture to the early diagnosis of systemic candidiasis. Eur. J.
Clin. Microbiol. Infect. Dis. 20: p. 864-870.
10
• CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)
• Znak CE (Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady nr 98/79/CE o wyrobach diagnozy medycznej in vitro)
•
•
For in vitro diagnostic use
Wyrób do diagnostyki in vitro
•
•
Catalogue number
Numer katalogowy
•
•
Manufacturer
Wytwórca
•
•
Authorised Representative
Autoryzowany przedstawiciel
•
•
Batch code
Kod partii
•
•
Expiry date YYYY/MM/DD
U y przed RRRR/MM/DD
•
•
Storage temperature limitation
Przestrzega zakresu temperatur
•
•
Consult Instruction for use
Sprawd w instrukcji obsługi
Bio-Rad
3, Bd Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette – France
Tél. : 33 (0) 1 47 95 60 00
Fax.: 33 (0) 1 47 41 91 33
03/2009
kod: 881046
11