mikrobiologia - Uniwersytet Warszawski
Transkrypt
mikrobiologia - Uniwersytet Warszawski
MIKROBIOLOGIA SKRYPT DO ĆWICZEŃ WERSJA DUŻA przygotowany przez zespół pracowników Zakładu Genetyki Bakterii INSTYTUT MIKROBIOLOGII WYDZIAŁ BIOLOGII UNIWERSYTET WARSZAWSKI 2012 SPIS TREŚCI I. REGULAMIN PRACOWNI 3 II. ĆWICZENIA Ćwiczenie 1. Przygotowanie i jałowienie szkła i podłoży Podstawowe techniki mikrobiologiczne Ćwiczenie 2. Izolowanie drobnoustrojów z różnych środowisk naturalnych Izolowanie czystych kultur Ćwiczenie 3. Wzrost hodowli bakteryjnej Określanie liczebności mikroorganizmów Ćwiczenie 4. Barwienie bakterii Formy morfologiczne bakterii Ćwiczenie 5. Barwienie bakterii cd. Budowa komórki bakteryjnej Ćwiczenie 6. Metabolizm bakterii – źródła węgla, azotu i energii Ćwiczenie 7. Metabolizm bakterii – procesy oddechowe i fermentacje Ćwiczenie 8. Koniugacja u bakterii Ćwiczenie 9. Analiza mikrobiologiczna wody Oznaczanie bakterii grupy coli Ćwiczenie 10. Podstawowe techniki pracy z bakteriofagami III. ADDENDUM 1. Opis kolonii bakteryjnych 2. Komora Thomy IV. KRÓTKA CHARAKTERYSTYKA BAKTERII STOSOWANYCH NA mmĆWICZENIACH 4 9 14 18 20 22 28 33 38 41 44 45 V. SŁOWNICZEK POLSKO-ANGIELSKI (terminy mikrobiologiczne) 49 VI. ZALECANA LITERATURA 51 2 I. Regulamin pracowni 1. W pracowni obowiązuje noszenie fartucha ochronnego (najlepiej białego). 2. Wszystkie odczynniki i ich roztwory, a także podłoża i hodowle mikroorganizmów muszą być czytelnie oznakowane. 3. Na stołach laboratoryjnych mogą znajdować się wyłącznie materiały potrzebne do wykonywania ćwiczenia. 4. Należy zachować daleko idącą ostrożność przy pracy z materiałem mikrobiologicznym, a w szczególności: a) stosować się do zasad pracy jałowej (zachować szczególną ostrożność przy pracy w bezpośrednim sąsiedztwie płomienia palnika); b) wstawiać hodowle bakteryjne w probówkach do statywów (nie wolno ich kłaść na stole); c) opisywać każdą posianą próbę (rodzaj posiewu, inicjały osoby wykonującej posiew, itp.); d) po skończeniu posiewów wyżarzać ezy, opalać głaszczki i zawsze wstawiać je do statywów, a zużyte pipety wkładać do specjalnych pojemników. 5. W pracowni obowiązuje szczególna ostrożność przy pracy z odczynnikami chemicznymi (do pipetowania ich roztworów należy używać WYŁĄCZNIE pompek lub gruszek); 6. W pracowni zabronione jest spożywanie posiłków, a także picie napojów. 7. Po zakończeniu pracy należy: a) posprzątać stół laboratoryjny; b) niepotrzebny już sprzęt odłożyć na miejsce, pozostawić w porządku mikroskopy; 8. Niepotrzebne hodowle drobnoustrojów oraz szkło zużyte w trakcie pracy należy odłożyć do specjalnie przygotowanych pojemników, po uprzednim usunięciu wszelkich napisów, i zanieść do zmywalni. 9. Nie wolno wynosić z pracowni żadnych hodowli bakteryjnych, preparatów i odczynników bez pozwolenia prowadzącego zajęcia. 10. Po zakończeniu pracy należy sprawdzić, czy został wyłączony gaz oraz aparatura nie przeznaczona do pracy ciągłej, a przed wyjściem z sali – umyć ręce. 11. W razie pojawienia się jakichkolwiek problemów należy niezwłocznie zgłosić się do osoby prowadzącej zajęcia lub do opiekuna. 3 Ćwiczenie 1 Temat: Przygotowanie i jałowienie szkła i podłoży rrr Podstawowe techniki mikrobiologiczne I. WPROWADZENIE 1. Podłoża Obiektem badań w mikrobiologii są mikroskopijnej wielkości organizmy występujące powszechnie we wszystkich środowiskach naturalnych. Badanie tych organizmów w naturalnych warunkach bytowania jest jednak z wielu względów bardzo trudne, a często niemożliwe. Poznanie morfologii, fizjologii, wymagań pokarmowych i środowiskowych drobnoustrojów jest możliwe dzięki stworzeniu sztucznych środowisk do ich hodowli – tzw. podłoży (pożywek) mikrobiologicznych. Umożliwiły one hodowanie drobnoustrojów w warunkach laboratoryjnych i uzyskanie czystych kultur – tzn. hodowli stanowiących potomstwo jednego osobnika i będących materiałem do badań mikrobiologicznych. Podłoża mikrobiologiczne są to mieszaniny odpowiednio dobranych składników odżywczych, dostarczających hodowanym na nich organizmom niezbędnych pierwiastków chemicznych oraz źródła energii. Każde podłoże musi mieć odpowiednią dla danego gatunku wartość odżywczą, odpowiednie pH, rH i ciśnienie osmotyczne. Ważne jest również określenie, do jakiego celu ma służyć dane podłoże (np. czy chodzi nam o uzyskanie hodowli, o wyselekcjonowanie jakiegoś określonego gatunku, o zróżnicowanie gatunków występujących w mieszaninie, itd.). Zależnie od potrzeby możemy zastosować podłoże: (i) minimalne – zawiera tylko te składniki, które są niezbędne do wzrostu mikroorganizmu; (ii) pełne – zapewnia optymalny wzrost danego mikroorganizmu; (iii) selekcyjne – umożliwia wyłącznie wzrost mikroorganizmów o określonych cechach; (iv) różnicujące – pozwala na zróżnicowanie mikroorganizmów względem określonej cechy na podstawie morfologii kolonii; (v) syntetyczne – charakteryzuje się ściśle określonym składem jakościowym i ilościowym; (vi) złożone – zawiera ekstrakty drożdżowe, autolizaty drożdżowe, peptony, ekstrakty mięsne, itp., a więc jego skład jakościowy i ilościowy nie jest ściśle określony. Podłoża wzbogacone stosuje się do hodowli drobnoustrojów, które wymagają dodatkowych substancji odżywczych, występujących w naturalnych produktach. Podłoże (np. bulion odżywczy) wzbogaca się, dodając do niego krew, surowicę, wyciąg glebowy, mleko, żółtko jaj, namok siana, soki warzywne, itp. Podłoża mineralne nie zawierają związków organicznych i stosuje się je do hodowania różnego rodzaju mikroorganizmów autotroficznych. Ze względu na konsystencję dzielimy podłoża na: (i) płynne, (ii) półpłynne i (iii) stałe. Podłoża zestala się najczęściej agarem, który jest uzyskiwany z krasnorostów morskich. Podłoża zestalone można wykorzystywać w postaci słupków, skosów i na płytkach Petriego. 2. Zasady przygotowywania podłoży Przygotowując podłoża należy: a) używać szkła odpowiednio wymytego i wypłukanego; b) przestrzegać ściśle przepisów przygotowania pożywek (odważać dokładnie składniki, zwracać uwagę na kolejność ich dodawania i na uwodnienie soli); 4 c) używać tylko wody destylowanej; d) ustawiać odpowiednie pH podłoża, pamiętając o tym, że po jałowieniu w autoklawie pH może się obniżyć; e) do jałowienia rozlewać podłoże do kolb do objętości nie większej niż 3/4 naczynia, aby nie wykipiało w czasie jałowienia w autoklawie; f) kolby zatykać korkami z waty, zabezpieczać korki przed zamoczeniem folią aluminiową i odpowiednio podpisywać; g) stosować możliwie najniższą temperaturę do jałowienia. 3. Sposoby sterylizacji Jednym z koniecznych warunków, jaki muszą spełniać wszystkie podłoża, jest ich sterylność, co oznacza, że muszą być pozbawione wszelkich organizmów – zarówno ich form wegetatywnych jak i przetrwalnikowych, a także wirusów. Proces sterylizacji można przeprowadzić dwoma sposobami: 1. przez zabicie drobnoustrojów i ich form przetrwalnikowych, a także inaktywację wirusów, w danym środowisku w wyniku działania: (a) wysokiej temperatury – suszarka, autoklaw, aparat Kocha; (b) promieniowania UV, X; (c) związków chemicznych, np. tlenek etylenu lub propylenu; 2. przez usunięcie drobnoustrojów i ich form przetrwalnikowych z danego środowiska (filtracja). Wybór metody sterylizacji zależy od rodzaju sterylizowanego podłoża (środowiska), a także od wyposażenia laboratorium; należy wybrać metodę nie niszczącą podłoża, a skuteczną, możliwie szybką i tanią. Trzeba też pamiętać, że w pracowni mikrobiologicznej sterylizujemy wszystko, czym moglibyśmy zakazić hodowlę badanych drobnoustrojów. Jałowienie szkła w suszarce W suszarce jałowimy przede wszystkim szkło (odpowiednio zabezpieczone i zapakowane) i te przedmioty, które nie ulegną zniszczeniu w tak wysokiej temperaturze. Sterylizację przeprowadza się w 160oC przez 2 godziny lub rzadziej w 180oC przez 1 godzinę (nie wolno przekraczać temp. 180oC, gdyż grozi to zwęgleniem papieru i waty). Zabite zostają wszystkie mikroorganizmy, w tym ich formy przetrwalnikowe, i wirusy. Jałowienie w autoklawie Temperatura 100oC nie zabija form przetrwalnikowych i niektórych wirusów. Wyższą temperaturę wrzenia wody można osiągnąć po zastosowaniu nadciśnienia. W autoklawie – hermetycznie zamkniętym kotle – stosując nadciśnienie 1 atm, uzyskuje się atmosferę nasyconej pary wodnej o temp. 121oC. W tej temperaturze wszystkie mikroorganizmy i ich przetrwalniki zostają zabite w ciągu około 30 min. Czas trwania sterylizacji w autoklawie zależeć będzie od rodzaju jałowionego materiału i jego objętości. W autoklawie jałowi się: a) podłoża (oprócz tych, które rozkładają się w tej temperaturze), np. bulion i agar odżywczy, b) sól fizjologiczną, roztwory soli, bufory, c) wodę destylowaną, d) narzędzia chirurgiczne, opatrunki, itp. W autoklawie nie sterylizuje się stężonych roztworów cukrów oraz substancji łatwo hydrolizujących, np. witamin, aminokwasów, puryn, pirymidyn, mocznika. 5 Jałowienie w aparacie Kocha (tyndalizacja) W aparacie Kocha sterylizuje się substancje, które ulegają rozkładowi w temp. powyżej 100 oC. Tyndalizacja polega na trzykrotnym ogrzewaniu jałowionego podłoża w temp. 100oC przez 30 min, co 24 godz. W czasie pierwszego ogrzewania zabite zostają formy wegetatywne, a przetrwalniki są aktywowane do kiełkowania, w wyniku działania wysokiej temperatury i obecności pewnych związków organicznych. Proces ten jest możliwy, dzięki pozostawieniu jałowionego materiału w temp. pokojowej przez około 24 godz. Następne ogrzewanie zabija kiełkujące przetrwalniki (które utraciły ciepłooporność). Trzecie ogrzewanie zabija ewentualne formy endospory, których kiełkowanie było opóźnione. Ponieważ metoda tyndalizacji wykorzystuje zjawisko kiełkowania przetrwalników, możemy ją stosować tylko do jałowienia wodnych roztworów substancji umożliwiających ten proces, a więc zawierających określone związki organiczne. W ten sposób jałowi się stężone roztwory cukrów, witamin, aminokwasów, puryn, pirymidyn, itp. Jałowienie przez filtrację Filtracja pozwala na jałowienie płynów, które ulegają rozkładowi pod wpływem ciepła (np. roztwór mocznika, surowica), a także gazów. Polega ona na przepuszczaniu jałowionego płynu przez filtr o określonej wielkości porów przy zastosowaniu nad- lub podciśnienia. Filtr zatrzymuje bakterie na zasadzie mechanicznej i/lub fizyko-chemicznej. Filtry i oprawki do filtrów należy przed użyciem wyjałowić (na ogół w autoklawie); sterylne musi też być naczynie, do którego filtrujemy jałowy płyn. Do jałowienia niewielkich ilości płynu bardzo wygodne są, dostępne w sprzedaży, wysterylizowane jednorazowe zestawy filtracyjne. Trzeba pamiętać, że filtracja nie usuwa wirusów. II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA 1. Przygotowanie bulionu odżywczego, agaru odżywczego oraz składników podłoża Davisa i ich jałowienie 1.1. Bulion odżywczy Skład: bulion w proszku woda destylowana 15 g 1000 ml a) Bulion w proszku wsypać do kolby, wlać wodę, rozpuścić mieszając. Sprawdzić pH podłoża przy pomocy papierka wskaźnikowego – powinno wynosić 7,2 - 7,4. b) Część bulionu rozlać po około 200 ml do 2 kolb o pojemności 300 ml. Kolby zatkać korkami z waty i zabezpieczyć przed zamoknięciem folią aluminiową. c) Jedną kolbę jałowić w autoklawie przy nadciśnieniu 1 atm przez 30 min, drugą pozostawić bez jałowienia. d) Pozostały bulion zużyć do przygotowania agaru odżywczego. 1.2 Agar odżywczy Skład: bulion odżywczy 200 ml agar-agar w proszku 4g a) Do kolby o pojemności 300 ml odważyć 4 g sproszkowanego agaru i wlać 200 ml przygotowanego bulionu odżywczego (nie mieszać!). b) Kolbę zatkać korkiem z waty, zabezpieczyć folią aluminiową. 6 c) Jałowić w autoklawie przy nadciśnieniu 1 atm przez 30 min. Każdy zespół studentów przygotowuje sobie 200 ml agaru odżywczego na następne ćwiczenia. 1.3. Podłoże Davisa płynne i stałe Podłoże Davisa przygotowuje się przez zmieszanie, oddzielnie przygotowanych wyjałowionych, następujących składników: a) 150 ml wody destylowanej lub 150 ml agaroidu (woda dest. + agar) (zależnie od konsystencji podłoża) b) 40 ml soli Davisa c) 4 ml 20 % glukozy i Przygotowanie składników podłoża: ad. a) - Do 2 kolb o pojemności 300 ml wlać po 150 ml wody destylowanej. - Do jednej z nich niczego nie dodawać - będzie służyła do przygotowania podłoża płynnego. - Do drugiej odważyć 4 g sproszkowanego agaru (nie mieszać!). Otrzymamy w ten sposób agaroid. - Obie kolby zatkać korkami z waty, zabezpieczyć folią aluminiową. - Jałowić w autoklawie przy nadciśnieniu 1 atm przez 30 min. ad. b) - Do kolby o pojemności 200 ml wlać około 90 ml wody destylowanej. - Odważyć wymienione niżej sole i wsypać je do kolby z wodą i wymieszać: K2HPO4 3,5 g KH2PO4 1,0 g MgSO4x7H2O 0,05 g (NH4)2SO4 0,05 g cytrynian sodu 0,25 g - Przelać roztwór do cylindra i uzupełnić wodą dest. do 100 ml, wymieszać. - Rozlać roztwór soli po 40 ml do kolbek à 100 ml. - Jałowić w autoklawie przy nadciśnieniu 1 atm przez 30 min. ad. c) - W kolbie o pojemności 100 ml przygotować 50 ml 20 % roztworu glukozy w wodzie destylowanej. - Rozlać do 2 probówek po około 5 ml, a resztę zostawić w kolbce. - Jedną probówkę pozostawić bez jałowienia. - Drugą probówkę wyjałowić w autoklawie przy nadciśnieniu 1 atm przez 30 min. - Kolbkę z glukozą wyjałowić w aparacie Kocha (tyndalizacja). Zaobserwować zmianę barwy roztworu po wyjałowieniu w autoklawie i ewentualne zmiany w niejałowionym roztworze glukozy. 2. Technika pracy sterylnej a) Dezynfekcja stołów laboratoryjnych za pomocą sterinolu lub alkoholu etylowego. b) Praca w bezpośrednim sąsiedztwie płomienia palnika. c) Sterylizacja ez (wyżarzanie w płomieniu palnika) i głaszczek (opalanie w etanolu). 7 2.1. Praktyczne zastosowanie poznanych technik i metod posiewu bakterii a) Przestrzegając zasad pracy sterylnej rozlać do 3 probówek po 2 ml jałowego bulionu. Po tygodniu sprawdzić jałowość bulionu we wszystkich 4 probówkach (również w tej, z której pobierany był bulion). b) Otrzymaną hodowlę bakteryjną wysiać ezą, według wskazówek prowadzącego zajęcia, na płytkę z agarem odżywczym – posiewem redukcyjnym (p. rysunek 1). Rys. 1. Posiew redukcyjny. 1 – początek linii posiewu; 2 i 3 – miejsca, w których przerywa się posiew i opala ezę w celu usunięcia nadmiaru materiału. III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA 1. Skład podłoży mikrobiologicznych i ich przygotowanie. 2. Kryteria podziału podłoży mikrobiologicznych. 3. Sterylizacja i sposoby jej przeprowadzania. 4. Pasteryzacja, dezynfekcja i zastosowanie tych procesów w praktyce. 5. Metody przedłużania trwałości żywności. 8 Ćwiczenie 2 Temat: Izolowanie drobnoustrojów z różnych środowisk naturalnych Izolowanie czystych kultur I. WPROWADZENIE Woda, gleba i organizmy żywe są środowiskami dogodnymi dla wzrostu różnych mikroorganizmów. Mikroorganizmy znajdują się również w powietrzu, które nie jest jednak środowiskiem sprzyjającym ich rozwojowi. To właśnie mikroorganizmy wytyczają granice biosfery, a tak szerokie rozprzestrzenienie w przyrodzie zawdzięczają następującym cechom: 1) małe rozmiary; 2) krótki czas generacji; 3) różnorodność metaboliczna (zdolność do wykorzystania wielu źródeł węgla, azotu, energii, różnych końcowych akceptorów elektronów); 4) zdolność adaptacji do zmieniających się warunków środowiska; 5) zdolność do życia w warunkach ekstremalnych (dotyczy to temperatury, pH, potencjału oksydo-redukcyjnego, ciśnienia osmotycznego, ciśnienia hydrostatycznego i bardzo niskich stężeń substancji pokarmowych); 6) wytwarzanie form przetrwalnikowych. Na ogół w danym środowisku występują różne mikroorganizmy. Jeśli chcemy wyizolować określony gatunek, musimy zastosować odpowiednie podłoża i warunki hodowli, hamujące wzrost innych mikroorganizmów i prowadzące do selektywnego namnażania mikroorganizmu poszukiwanego. Jest to tzw. hodowla wzbogacająca. Jeśli spodziewamy się, że w danym środowisku jest mało komórek poszukiwanego mikroorganizmu, hodowlę wzbogacającą należy założyć na podłożu płynnym, a dopiero po uzyskaniu wzrostu, przesiać mikroorganizmy na podłoże stałe. Z wyrosłych kolonii możemy następnie założyć czyste kultury, a po ich identyfikacji, uzyskać czystą kulturę poszukiwanego przez nas gatunku. 1. Izolowanie czystych kultur Metody izolowania czystych kultur dzielimy na bezpośrednie i pośrednie. W metodach bezpośrednich pobieramy pojedynczą komórkę mikroorganizmu (np. stosując mikromanipulator) i przenosimy do jałowego podłoża płynnego. W metodach pośrednich izolujemy pojedyncze kolonie na podłożu stałym. Zakładając, że pojedyncza kolonia stanowi potomstwo pojedynczej komórki, pobieramy z niej materiał i przenosimy na podłoże stałe, wykonując posiew redukcyjny. Pojedyncze kolonie możemy uzyskać dzięki posiewowi: 1) powierzchniowemu na podłoże stałe w płytce Petriego, wykonanemu za pomocą: - ezy – posiew redukcyjny (metoda suchych rozcieńczeń); - pipety – metoda rozcieńczeń; zwykle wysiewa się 0,1 ml i rozprowadza po powierzchni płytki głaszczką; 2) wgłębnemu, w którym zawiesinę mikroorganizmów wprowadza się na dno pustej szalki Petriego, a następnie zalewa upłynnionym i odpowiednio schłodzonym podłożem stałym (zwykle wysiewa się 1 ml). Jeśli w badanej próbie jest mało mikroorganizmów, możemy ją przefiltrować, a filtr umieścić na odpowiednim podłożu (p. punkt 3, str. 15). 2. Podstawowe pojęcia mikrobiologiczne Hodowla to podłoże z namnożonymi mikroorganizmami. Hodowle można prowadzić na podłożu płynnym bądź stałym. Hodowle mogą być jednogatunkowe (gdy na podłożu rośnie jeden gatunek bakterii) lub mieszane (gdy rosną w nich przynajmniej dwa gatunki). Kolonia to widoczne gołym okiem skupisko drobnoustrojów na podłożu stałym. Na ogół kolonia powstaje w wyniku podziałów pojedynczej komórki. 9 Czystą kulturą nazywamy hodowlę, w której bakterie stanowią potomstwo jednej, pierwotnie wyosobnionej komórki bakteryjnej. Szczepy to różne klony należące do tego samego gatunku, a wyprowadzone z poszczególnych czystych kultur, izolowanych niezależnie od siebie. II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA 1. Przygotowanie podłoży a) Rozlać na płytki Petriego upłynniony agar odżywczy (przygotowany na poprzednich ćwiczeniach). b) Przygotować podłoże stałe Davisa poprzez zmieszanie: - 150 ml agaroidu - 40 ml soli Davisa - 4 ml 20 % glukozy c) Po zastygnięciu podłoży, płytki wysuszyć, w celu odparowania części wody. d) Przed dokonaniem posiewów płytki należy odpowiednio podpisać flamastrem na denku, uwzględniając rodzaj posiewanej próbki, rozcieńczenie, inicjały osoby wykonującej posiew. 2. Izolowanie drobnoustrojów z powietrza metodą sedymentacyjną Kocha i określanie ich liczby a) Płytki z agarem odżywczym postawić w miejscu, gdzie wykonany będzie posiew. b) Zdjąć wieczko i wystawić pożywkę na działanie powietrza przez 5, 10 lub 15 minut zależnie od przewidywanego skażenia powietrza. Po ekspozycji płytki zakryć. c) Po kilkudniowej inkubacji w temperaturze pokojowej policzyć kolonie mikroorganizmów, a następnie obliczyć ich liczbę (X) w 1 m3 powietrza według zamieszczonego niżej wzoru (według założenia Omeliańskiego na 1 m2 podłoża osiada w ciągu 5 minut tyle mikroorganizmów, ile znajduje się 1 m3 powietrza): nx5 X = --------pxt gdzie: n – uśredniona liczba kolonii na płytce p – powierzchnia płytki w m2 t – czas otworzenia płytki w min Tabela 1. Badanie czystości mikrobiologicznej powietrza Miejsce badania czystości powietrza Liczba drobnoustrojów w 1 m3 powietrza Powietrze atmosferyczne uważamy za: - nie zanieczyszczone, jeśli ogólna liczba bakterii w 1 m3 wynosi mniej niż 1000; - średnio zanieczyszczone, jeśli ogólna liczba bakterii w 1 m3 wynosi od 1000 do 3000; - silnie zanieczyszczone, jeśli ogólna liczba bakterii w 1 m3 wynosi więcej niż 3000. Dopuszczalny stopień mikrobiologicznego mikroorganizmów w 1 m3. zanieczyszczenia powietrza atmosferycznego wynosi 3000 10 Dopuszczalna liczba mikroorganizmów w 1 m3 powietrza pomieszczeń użytkowych wynosi: - pomieszczenia służby zdrowia sala operacyjna - 100 sala opatrunkowa - 150 sala z chorymi – 1000 - pomieszczenia domów mieszkalnych kuchnia i jadalnia – 2000 pokój do przyjęć – 1500 sypialnia – 1000 - pomieszczenia szkolne sale wykładowe – 1500 sale do ćwiczeń – 2000 sale gimnastyczne – 3000 3. Izolowanie mikroorganizmów z naturalnego zbiornika wodnego i określanie ich liczby a) Rozcieńczyć wodę ze zbiornika (10-1 - 10-4) wg schematu przedstawionego na Rys. 2. - Wlać do 4 probówek po 4,5 ml soli fizjologicznej. - Do pierwszej probówki odmierzyć pipetą (à 1 ml) 0,5 ml badanej wody. Pipetę odłożyć, a zawartość probówki dobrze wymieszać. W ten sposób rozcieńczyliśmy badaną wodę dziesięciokrotnie (10-1). - Przenieść 0,5 ml rozcieńczenia 10-1 do następnej probówki z solą fizjologiczną i wymieszać. Uzyskujemy stukrotne rozcieńczenia badanej wody (10-2). - Postępując analogicznie otrzymujemy rozcieńczenia 10-3 i 10-4. wysiew po 0,1ml z każdej probówki na dwie płytki z agarem odżywczym i jedną z podłożem Davisa Rys. 2. Schemat rozcieńczania hodowli bakteryjnej. b) Wysiać po 0,1 ml każdego rozcieńczenia na płytki z: (i) agarem odżywczym w 2 powtórzeniach; (ii) na płytki z podłożem Davisa (po jednej płytce na każde rozcieńczenie). c) Po kilkudniowej inkubacji w temperaturze pokojowej zaobserwować zróżnicowaną morfologię kolonii mikroorganizmów. d) Następnie policzyć kolonie na płytkach. Do liczenia należy wziąć te płytki, na których wyrosło od 30 do 300 kolonii. Określić liczbę mikroorganizmów zdolnych do wytworzenia ookolonii (jednostek tworzących kolonie, jtk) w 1 ml badanej wody (X) wg wzoru: X = a x b x 10 [jtk/ml] gdzie: a – średnia liczba bakterii na płytkach b – odwrotność wysianego rozcieńczenia 10 – przeliczenie na 1 ml 11 Wyniki zapisać w tabeli 2. 4. Izolowanie mikroorganizmów z gleby i określanie ich liczby a) Przygotować roztwór glebowy. W tym celu odważyć 2 g gleby i wsypać do kolby zawierającej 18 ml soli fizjologicznej i całość wytrząsać kilka minut w celu wymycia mikroorganizmów z cząstek gleby. Poczekać, aż cząstki stałe opadną na dno. b) Przygotować kolejne rozcieńczenia gleby (10-1 - 10-6) tak jak w punkcie 3a, traktując roztwór glebowy jako rozcieńczenie 10-1. Wysiać na dwie płytki z agarem odżywczym po 0,1 ml każdego z rozcieńczeń od 10-2 do 10-6. c) Po kilkudniowej inkubacji w temperaturze pokojowej zaobserwować zróżnicowaną morfologię kolonii mikroorganizmów. d) Policzyć kolonie, a następnie określić liczbę jednostek (mikroorganizmów) zdolnych do wytworzenia kolonii (jtk) w 1 g gleby, stosując wzór z punktu 3d). Wyniki zapisać w tabeli 2. Tabela 2. Określenie liczby bakterii w wodzie i glebie Badana próbka Woda Gleba Średnia liczba kolonii bakterii na agarze odżywczym na rozcieńczeniu: 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 X X X Liczba jtk* w 1 ml wody lub w 1 g gleby X * jtk = jednostka tworząca kolonię (cfu, ang. colony forming unit) e) Porównać: (i) liczebność bakterii w badanej wodzie i glebie i (ii) liczby jtk/ml uzyskane na podłożu Davisa i na agarze odżywczym. . 5. Izolowanie mikroorganizmów z innych środowisk a) Na jednej płytce z agarem odżywczym wykonać posiew dowolny, np. kaszlnąć, dotknąć palcem brudnym i przetartym etanolem, dotknąć jakimś przedmiotem, zrobić posiew materiału pobranego jałową wymazówką, itp. b) Po inkubacji w temperaturze pokojowej obserwować wzrost bakterii. 6. Charakterystyka wybranej kolonii bakteryjnej a) Wybrać jedną z kolonii bakteryjnych i opisać w zeszycie jej morfologię (patrz III.1 Addendum) uwzględniając: - kształt i brzeg kolonii; - wielkość (średnicę) w mm; - wzniesienie; - barwę kolonii i jej otoczenia (barwnik może dyfundować do podłoża); - typ wzrostu (na powierzchni lub częściowo wrośnięta w podłoże); - przejrzystość (przejrzysta, nieprzejrzysta, opalizująca); - powierzchnię (gładka, lśniąca, matowa, pomarszczona, pofałdowana, krzaczkowata, koncentrycznie pierścieniowata); - strukturę (np. ziarnista, włóknista, skórzasta, krucha, ciągnąca się – strukturę bada się za pomocą ezy). 12 Należy przy tym pamiętać, że morfologia kolonii zależy nie tylko od rodzaju mikroorganizmu, ale również od składu podłoża i warunków hodowli. Hodowla danego mikroorganizmu może charakteryzować się też swoistym zapachem. b) Wybraną kolonię bakteryjną (z dowolnej płytki) posiać metodą posiewu redukcyjnego na agar odżywczy (tak jak pokazano na rysunku 1, str. 8). Płytkę inkubować w temperaturze pokojowej. Następnie sprawdzić, czy uzyskana hodowla jest jednorodna i czy pojedyncze kolonie mają taką samą morfologię jak pobrana kolonia wyjściowa. Jeśli tak, to udało się uzyskać czystą kulturę. Posiew redukcyjny należy powtórzyć, pobierając ponownie materiał z pojedynczej kolonii. Należy pamiętać, że mikroorganizmy stanowiące zakażenia mogą charakteryzować się wolniejszym wzrostem, a tym samym ich kolonie mogą pojawić się na płytce w późniejszym czasie. III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA 1. Przyczyny szerokiego rozpowszechnienia mikroorganizmów w przyrodzie. 2. Metody izolowania mikroorganizmów z różnych środowisk naturalnych. 3. Metody izolowania czystych kultur – bezpośrednie i pośrednie. 4. Podstawowe pojęcia mikrobiologiczne – hodowla, czysta kultura, kolonia, szczep, klon. 13 Ćwiczenie 3 Temat: Wzrost hodowli bakteryjnej Określanie liczebności mikroorganizmów I. WPROWADZENIE 1. Hodowle mikroorganizmów Po wsianiu bakterii na odpowiednie podłoże płynne i inkubacji w optymalnych dla danego gatunku warunkach następuje, po pewnym okresie adaptacji, intensywny przyrost liczby bakterii w hodowli. Jednakże skład podłoża takiej hodowli podlega ciągłym zmianom; ubożeje ono w składniki pokarmowe, natomiast nagromadzają się w nim stopniowo metabolity, wykazujące często działanie toksyczne. Tego typu hodowle noszą nazwę hodowli okresowych (Rys. 3A). W hodowlach tego typu obserwuje się kilka faz wzrostu. (i) Faza zastoju (adaptacyjna), następuje po wsianiu bakterii do nowego podłoża. Bakterie przystosowują się do nowego środowiska i ich liczba nie rośnie. (ii) Faza młodości fizjologicznej następuje pod koniec fazy zastoju, komórki rosną i zaczynają się dzielić, więc ich liczba w hodowli zaczyna powoli rosnąć. (iii) Faza wzrostu wykładniczego – wszystkie komórki są w dobrej kondycji fizjologicznej, rosną i dzielą się w stałych odstępach czasu, równych czasowi podwojenia (czasowi generacji). W zamkniętym systemie wzrost nie może trwać wiecznie. W hodowli rośnie stężenie szkodliwych produktów przemiany materii, a stężenie związków odżywczych maleje, w konsekwencji częstość podziałów komórek bakteryjnych zmniejsza się i rozpoczyna się (iv) faza stacjonarna, która składa się z kilku etapów: faza zwolnionego wzrostu, faza równowagi (w tej fazie liczba żywych bakterii nie zmienia się), faza zamierania (liczba żywych komórek stale się zmniejsza, zaś rośnie liczba komórek martwych). Jeżeli chcemy utrzymać hodowlę w fazie intensywnego wzrostu, musimy ciągle uzupełniać zużywane z podłoża składniki pokarmowe i odprowadzać z hodowli nagromadzające się metabolity i nadmiar komórek. W takiej hodowli ciągłej (Rys. 3B) faza wzrostu wykładniczego może trwać przez czas nieograniczony, jeśli nie dopuści się do pojawienia sie warunków obniżających szybkość wzrostu. Jeszcze inny rodzaj hodowli uzyskamy, jeśli wszystkie bakterie będą na tym samym etapie cyklu komórkowego, a więc będą się równocześnie dzieliły. Taka synchroniczna hodowla (Rys. 3C) jest odbiciem zachowania się pojedynczej komórki i przez to może być przydatna w badaniach dotyczących fizjologii bakterii. Rys. 3. Krzywe wzrostu bakterii. (A) hodowla okresowa, (B) hodowla ciągła, (C) hodowla synchroniczna. i 14 2. Określanie liczebności mikroorganizmów Liczebność mikroorganizmów można badać, stosując metody bezpośrednie i pośrednie. W metodach bezpośrednich najczęściej liczymy mikroorganizmy pod mikroskopem, np. w komorze Thomy (p. str. 44), Halbera lub innej. Mikroorganizmy są liczone pod niedużym powiększeniem (obiektyw 40x), a więc można w ten sposób określić tylko liczbę drobnoustrojów odpowiednio dużych (powyżej 4 µm średnicy). Ponadto ich liczba powinna przekraczać 107 komórek/ml. Jeśli mikroorganizmów jest bardzo mało, należy przefiltrować odpowiednią objętość badanej wody przez specjalny czarny filtr membranowy, a następnie wybarwić osadzone na nim komórki, stosując 4,6-diamidyno-2-fenyloindol (ang. 4,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI), który wiąże się z cząsteczkami dwuniciowego DNA. Filtr ogląda się w mikroskopie epifluorescencyjnym (z bocznym światłem UV). Komórki oświetlone światłem o długości np. 365 nm (ultrafiolet) emitują światło o długości fali 420 nm (jasnoniebieskie). Drobnoustroje liczy się w polach siatki narysowanej na okularze. Znając wielkość pól, powierzchnię filtra i objętość przesączonej próby określa się liczbę drobnoustrojów. Metoda ta jest szybka i bardzo dokładna. Metody pośrednie polegają na odpowiednim, ilościowym wysiewie badanego materiału na podłoże stałe i uzyskaniu tylu kolonii, aby (i) można je było policzyć, (ii) błąd statystyczny był jak najmniejszy (zwykle liczy się kolonie na tych płytkach, gdzie jest ich ~ 30-300). Zakłada się, że każda kolonia wyrasta z podziałów pojedynczej komórki mikroorganizmu. Znając liczbę wyrosłych kolonii, objętość wysianej próbki i ewentualne rozcieńczenie materiału, można oszacować liczbę żywych mikroorganizmów, zdolnych do wytworzenia kolonii (ang. viable count) przypadających na 1 mililitr czy 1 g badanego środowiska. W metodzie tej oznaczamy w rzeczywistości nie liczbę żywych komórek, lecz liczbę jednostek tworzących kolonie (jtk/ml) (ang. colony forming unit, cfu). Dokładność metody płytkowej jest zadawalająca w przypadku określania gęstości bakterii w hodowli określonego gatunku o znanych wymaganiach pokarmowych. Metodę tę stosuje się np. w mikrobiologii żywności, w mikrobiologii medycznej, w analizie sanitarnej wody, gdzie ważne jest dla nas poznanie liczby żywych bakterii. W metodach pośrednich stosuje się różne techniki wysiewu, pamiętając o tym, by wysiew robić co najmniej w dwóch powtórzeniach. 1) Posiew powierzchniowy kolejnych rozcieńczeń na płytki Materiał zawierający mikroorganizmy odpowiednio się rozcieńcza i wysiewa po 0,1 ml kolejnych rozcieńczeń na odpowiednie podłoża. 2) Posiew wgłębny (metoda płytek lanych) Jej zaletą jest to, że można wysiać więcej niż 0,1 ml zawiesiny (zwykle 1 ml), ale trzeba pamiętać, że mikroorganizmy będą musiały przez krótki okres czasu znieść temperaturę 45-50oC (p. punkt I.2., str. 9). 3) Metoda filtrów membranowych Jeśli szacuje się, że w badanym środowisku (np. wodzie) liczba drobnoustrojów będzie mała, określoną objętość wody przesącza się przez filtr membranowy. Filtr z osadzonymi bakteriami nakłada się jałową pęsetą na płytkę Petriego z odpowiednim podłożem. Mikroorganizmy rosną i dzielą się, wytwarzając kolonie na filtrze. Po inkubacji liczy się wyrosłe kolonie. 3. Przechowywanie mikroorganizmów Mikroorganizmy można, przez krótki okres czasu (tzn. od kilku dni do kilku tygodni, w zależności od drobnoustroju), przechowywać w lodówce na płytkach Petriego, dbając o to, by podłoże nie wyschło. Lepiej w tych warunkach przechowywać hodowle założone na skosach, a jeszcze lepiej na słupkach w podłożu półpłynnym. Dłuższe przechowywanie wymaga zamrożenia hodowli po dodaniu do niej jałowego glicerolu (stężenie końcowe 15 %). 15 Zastosowanie temperatury -20oC pozwala na przechowywanie kilkumiesięczne, natomiast w temperaturze -70oC mikroorganizmy mogą przetrwać wiele lat. Hodowle mikroorganizmów można też przechowywać bardzo długo w stanie zliofilizowanym. II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Szczepy bakteryjne: - Escherichia coli (dziki szczep) Podłoża i roztwory: - bulion odżywczy - podłoże Davisa (płynne) - agar odżywczy - roztwór fizjologiczny (0,85 % NaCl) 1. Badanie wzrostu bakterii w hodowli okresowej a) Przygotować nocne hodowle szczepu (i) w bulionie odżywczym oraz (ii) w minimalnym podłożu Davisa. b) Każdą z hodowli rozcieńczyć odpowiednim, świeżym podłożem w stosunku 1 : 20. c) Zmierzyć gęstość optyczną (ang. optical density, OD600) każdej z rozcieńczonych hodowli – nie powinna być wyższa niż 0,1. d) Każdą z rozcieńczonych hodowli podzielić na 3 części: - jedną inkubować w warunkach statycznych w 37oC; - drugą – z napowietrzaniem również w 37oC; - trzecią pozostawić w temp. pokojowej bez napowietrzania. e) Inkubację prowadzić przez 3 godziny. Co godzinę pobierać próbki hodowli i oznaczać ich OD600. f) Na podstawie uzyskanych wyników przygotować wykres zależności OD600 każdej z prowadzonych hodowli od czasu. Porównać uzyskane wyniki. 2. Określanie liczby bakterii w hodowli metodą pośrednią a) Upłynnić agar odżywczy, rozlać na szalki Petriego; po zakrzepnięciu agaru płytki wysuszyć. b) Otrzymaną hodowlę bulionową E. coli rozcieńczyć w roztworze soli fizjologicznej do wartości 10-6 (milion razy). c) Z rozcieńczeń 10-5 i 10-6 wysiać po 0,1 ml na szalki z agarem odżywczym – każde rozcieńczenie na dwie szalki. d) Inkubować w temp. 37oC przez 24 godz. Policzyć kolonie otrzymane na szalkach. e) Obliczyć liczbę bakterii zdolnych do utworzenia kolonii w 1 ml wyjściowej hodowli (x) wg wzoru: x = a x b x 10 [jtk/ml] gdzie: a – średnia liczba kolonii na płytce b – odwrotność wysianego rozcieńczenia 10 – przelicznik na 1 ml 16 III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA 1. Hodowle bakteryjne – kryteria podziału. 2. Warunki prowadzenia hodowli. 3. Fazy wzrostu w hodowli okresowej. 4. Typy wzrostu bakterii na różnych podłożach. 5. Określanie liczebności mikroorganizmów – metody bezpośrednie i pośrednie. 6. Sposoby przechowywania mikroorganizmów. 17 Ćwiczenie 4 Temat: Barwienie bakterii Formy morfologiczne bakterii I. WPROWADZENIE 1. Barwienia Komórki bakteryjne są zwykle bardzo małe i charakteryzują się małą gęstością – słabo załamują i pochłaniają światło, dlatego też trudno jest odróżnić je od podłoża. Przed oglądaniem w mikroskopie, najczęściej się je wybarwia, stosując różne metody, w zależności od rodzaju bakterii oraz celu, jaki chcemy osiągnąć. W tym celu należy przygotować rozmaz bakterii na szkiełku podstawowym, wysuszyć go, a następnie w odpowiedni sposób utrwalić przed barwieniem. W barwieniu prostym stosujemy tylko jeden barwnik, natomiast w złożonym – co najmniej dwa barwniki, a często również różne bejce (zaprawy) i odbarwiacze. Przykładem barwienia złożonego jest barwienie Grama, które jest podstawą klasyfikacji i identyfikacji bakterii. W metodzie tej stosujemy dwa barwniki (fiolet krystaliczny i safraninę), płyn Lugola jako bejcę i etanol jako odbarwiacz. Z powodu różnic w budowie ściany komórkowej bakterie gramujemne barwią się na różowo, zaś gramdodatnie na fioletowo. Oprócz barwienia pozytywnego, w którym oglądamy wybarwione bakterie na bezbarwnym tle, istnieją też barwienia negatywne, w których „wybarwia się” tło (czyli szkiełko podstawowe) za pomocą tuszu bądź nigrozyny. W ten sposób uwidacznia się otoczki bakteryjne, które trudno barwią się metodami pozytywnymi. 2. Kształt komórek bakteryjnych Podstawowe kształty bakterii to kula (ziarniaki), walec (pałeczki i laseczki) i skręcony walec (przecinkowce, krętki i śrubowce). Istnieją też bakterie o kształtach nieregularnych, np. maczugowce. Bakterie mogą tworzyć charakterystyczne układy komórek, takie jak: dwoinki, pakiety, grona (takie układy tworzą ziarniaki), a także łańcuszki (ziarniaki i laseczki). II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA 1. Barwienie proste preparatów bakteryjnych Szczepy bakteryjne: - pałeczki: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas fluorescens - laseczki: Bacillus subtilis, B. megaterium - ziarniaki: Micrococcus luteus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis Barwniki: - fiolet krystaliczny (barwić 1 minutę) - błękit metylenowy (barwić 5 minut) a) Przygotowanie preparatu - Zrobić rozmaz na szkiełku podstawowym. - Wysuszyć go w temperaturze pokojowej. - Utrwalić, przeprowadzając ostrożnie szkiełko trzykrotnie przez płomień palnika. Przed barwieniem poczekać, aż szkiełko ostygnie. 18 b) Barwienie preparatu - Zalać cały preparat wybranym barwnikiem. - Po określonym czasie zlać barwnik i przemywać szkiełko wodą wodociągową aż do momentu, gdy woda spływająca z preparatu będzie bezbarwna. - Delikatnie usunąć wodę ze szkiełka za pomocą bibuły. - Po całkowitym wyschnięciu preparatu oglądać go pod mikroskopem, najpierw pod małym powiększeniem, a następnie stosując obiektyw immersyjny. - Narysować wszystkie oglądane formy morfologiczne bakterii i tworzone przez te bakterie układy komórek. 2. Barwienie złożone metodą Grama Szczepy bakteryjne: - Escherichia coli i Bacillus megaterium - Proteus vulgaris i Bacillus megaterium - Proteus vulgaris i Micrococcus luteus Roztwory stosowane do barwienia: - fiolet krystaliczny - safranina - płyn Lugola - 95 % etanol a) Przygotowanie preparatu - Na szkiełku podstawowym zmieszać hodowle bakterii gramujemnej (np. E. coli) i gramdodatniej (np. Bacillus megaterium). - Zrobić rozmaz, wysuszyć i utrwalić jak w punkcie 1a). b) Barwienie metodą Grama - Preparat barwić fioletem krystalicznym przez 2 minuty. - Zlać fiolet, wypłukać szkiełko płynem Lugola i zalać je płynem Lugola na 2 minuty. - Spłukać preparat wodą, osuszyć bibułą i zalać na 30 sekund 95 % etanolem. - Spłukać wodą, osuszyć bibułą i dobarwiać safraniną przez 5 minut. - Spłukać wodą, osuszyć i oglądać. - Narysować obraz widziany w mikroskopie, uwzględniając kolor, na jaki wybarwiły się komórki poszczególnych bakterii. III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA 1. Podstawowe kształty komórek bakteryjnych i tworzone przez nie układy. 2. Technika sporządzania preparatów mikroskopowych – wykonanie rozmazu, cel i sposoby utrwalania preparatów. 3. Podział metod barwienia: barwienia proste i złożone; pozytywne i negatywne. 4. Zasada barwienia metodą Grama. 5. Bakterie gramujemne i gramdodatnie. 6. Technika mikroskopowania (w tym zastosowanie immersji). 19 Ćwiczenie 5 Temat: Barwienie bakterii cd. Budowa komórki bakteryjnej I. WPROWADZENIE Strukturami występującymi w każdej komórce bakteryjnej są: nukleoid, błona cytoplazmatyczna i rybosomy. Poza tym, większość bakterii ma ścianę komórkową, a niektóre - otoczki i rzęski. Ściana komórkowa zawiera warstwę mureiny (peptydoglikanu), która u typowych bakterii gramdodatnich jest gruba i silnie usieciowana, zaś u gramujemnych – cienka, słabo usieciowana i pokryta błoną zewnętrzną. Stosując bejce (zaprawy), można pogrubić ścianę komórkową i rzęski, a następnie je wybarwić, dzięki czemu stają się widoczne w zwykłym mikroskopie optycznym. Dzięki rzęskom bakterie poruszają się, co można zobaczyć pod mikroskopem w tzw. kropli wiszącej, stosując szkiełko z łezką. Ruch bakterii można też wykazać, stosując posiew na słupek z podłożem półpłynnym, a w przypadku bakterii zdolnych do wzrostu „rozpełzliwego” (ang. swarming) – punktowy posiew na środek niewysuszonej płytki. Otoczki pełnią rolę: (i) ochronną (przed wysychaniem, fagocytozą, niektórymi bakteriofagami i pewnymi związkami chemicznymi), a także (ii) w adhezji do podłoża stałego, co jest ważne przy kolonizacji środowiska przez mikroorganizmy. Obecność otoczek można wykazać, stosując złożone barwienie negatywno-pozytywne. Pewne gatunki bakterii (np. laseczki) wytwarzają formy przetrwalnikowe, zwane endosporami, które umożliwiają im przetrwanie w niekorzystnych warunkach środowiska. Endospory są niewrażliwe na wysoką temperaturę (niektóre mogą przeżyć ogrzewanie w 100 oC) i działanie toksycznych związków chemicznych. Można je uwidocznić, dzięki barwieniu złożonemu, w którym stosuje się zieleń malachitową (na gorąco), wodę jako odbarwiacz i safraninę. II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Szczepy bakteryjne: Bacillus megaterium Bacillus subtilis Micrococcus luteus Proteus vulgaris Barwniki, utrwalacze, zaprawy i inne: wodne roztwory safraniny (0,01 %; 0,2 %; 0,5 %) wodny roztwór zieleni malachitowej (5 %) roztwór taniny (10 %) tusz chiński alkohol metylowy 1. Barwienie ściany komórkowej a) Przygotować rozmaz z nocnej hodowli Bacillus megaterium. b) Po wysuszeniu preparat utrwalać przez 1 min alkoholem metylowym. c) Zlać alkohol, przepłukać preparat roztworem taniny (bejca) i zalać roztworem taniny na 30 min. d) Spłukać preparat wodą. e) Barwić 30-60 sek. 0,01 % roztworem safraniny. f) Obejrzeć pod mikroskopem najpierw pod małym powiększeniem, potem pod immersją. Narysować obraz mikroskopowy i opisać. 20 2. Barwienie przetrwalników metodą Schaeffer-Fultona a) Wykonać rozmazy z 24- i 48-godzinnej hodowli B. megaterium lub B. subtilis. b) Preparat wysuszyć i utrwalić w płomieniu palnika. c) Barwić zielenią malachitową przez około 8 min, podgrzewając preparat, co pewien czas, płomieniem palnika, aż do ukazania się pary. d) Spłukać wodą. e) Barwić 0,5 % safraniną przez 4 min. f) Spłukać wodą i osuszyć. g) Preparat obejrzeć pod immersją. Przetrwalniki powinny być wybarwione na zielono, a wnętrze komórki na różowo. 3. Barwienie otoczek metodą Burriego-Ginsa a) Na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść kroplę płynnej hodowli Micrococcus luteus (lub B. megaterium) lub zrobić zawiesinę bakterii z hodowli stałej i nanieść kroplę na szkiełko. b) Dodać kroplę tuszu i zmieszać z hodowlą. c) Drugim szkiełkiem podstawowym rozprowadzić zawiesinę po powierzchni szkiełka tak, aby powstała jednorodna, ciemna (lecz nie czarna) warstwa. d) Rozmaz wysuszyć na powietrzu, ostrożnie utrwalić w płomieniu palnika. e) Barwić 0,2 % safraniną przez około 15 sek. f) Spłukać barwnik, preparat osuszyć. g) Obejrzeć pod mikroskopem. Tło powinno być ciemne, bakterie zabarwione na różowo, zaś otoczki są niewybarwione. 4. Wykazanie zdolności bakterii do ruchu a) Z płynnej hodowli Proteus vulgaris przygotować preparat w postaci tzw. kropli wiszącej: - na szkiełko nakrywkowe nanieść maleńką kroplę płynnej hodowli szczepu; - za pomocą wazeliny nałożonej na rogach szkiełka przykleić je nad łezką szkiełka podstawowego. b) Nastawić pod mikroskopem obraz brzegu kropli na małym powiększeniu, a następnie zmienić obiektyw na immersyjny. Obserwować ruch własny bakterii. III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA 1. Budowa i funkcja bakteryjnych struktur komórkowych: ściana komórkowa (w tym błona zewnętrzna bakterii gramujemnych), otoczki, rzęski. 2. Zastosowanie złożonych metod barwienia do uwidocznienia niektórych struktur komórkowych (otoczka, ściana komórkowa, endospory). 3. Metody określania zdolności bakterii do ruchu. 21 Ćwiczenie 6 Temat: Metabolizm bakterii - źródła węgla, azotu i energii I. WPROWADZENIE Każdy mikroorganizm musi mieć zapewnione do wzrostu: (i) źródła pierwiastków biogennych (węgla, azotu, siarki i fosforu), (ii) odpowiednie kationy (Na+, K+, Mg2+, itd), (iii) mikroelementy oraz (iv) źródło energii. Typ pokarmowy bakterii wskazuje zwykle na: (i) główny proces, za pomocą którego bakteria zdobywa energię (fototrofy wykorzystują energię świetlną, a chemotrofy – chemiczną), (ii) donory elektronów niezbędne do redukcji NAD lub NADP (litotrofy wykorzystują związki nieorganiczne, a organotrofy – organiczne) i wreszcie (iii) na główne źródło węgla (autotrofy wykorzystują dwutlenek węgla, a heterotrofy – związki organiczne). Chemolitoautotrofy to mikroorganizmy, które wykorzystują pierwiastki chemiczne bądź związki nieorganiczne jako źródło energii, a także donor elektronów. Głównym źródłem węgla jest dla nich dwutlenek węgla, więc potrafią one rosnąć na podłożach mineralnych. Należą do nich np. bakterie nitryfikacyjne, które uzyskują energię z utleniania amoniaku (nitrozobakterie) i azotynów (nitrobakterie), a także bezbarwne bakterie siarkowe, które wykorzystują do tego celu siarkę i jej związki nieorganiczne. Ten typ pokarmowy występuje wyłącznie u mikroorganizmów prokariotycznych (bakterie i archeony) Chemoorganoheterotrofy to mikroorganizmy, dla których związki organiczne są źródłem węgla, energii i elektronów. Każdy związek organiczny pochodzenia naturalnego może być wykorzystany do tego celu przez pewną grupę prokariotów. Pierwsze etapy rozkładu związków wielkocząsteczkowych zachodzą na zewnątrz komórek dzięki wydzielanym przez drobnoustroje ektoenzymom (amylazy, lipazy, proteazy, nukleazy). Prokarioty potrafią wykorzystać jako źródło azotu nie tylko związki nieorganiczne (jony NH4+, NO3-) i organiczne (np. aminokwasy), ale również azot cząsteczkowy. Zdolność do wiązania azotu cząsteczkowego jest cechą występującą u wielu różnych bakterii (zarówno wolnożyjących jak i symbiotycznych, autotroficznych jak i heterotroficznych, tlenowych i beztlenowych), a także u niektórych archeonów. Nitrogenaza jest kompleksem enzymatycznym, który umożliwia zredukowanie cząsteczki N2 do NH3, gdy brakuje w środowisku innych, dostępnych form azotu. Niektóre bakterie potrafią syntetyzować wszystkie związki budujące ich komórki z: (i) jednego, prostego związku węgla (nieorganicznego lub organicznego, w zależności od tego, czy są to autotrofy czy heterotrofy) i (ii) soli mineralnych. Nazywamy je prototrofami. Inne, zwane auksotrofami, nie potrafią syntetyzować pewnych związków organicznych, które muszą tym samym znajdować się w ich podłożu. Związki te, zwane czynnikami wzrostowymi, to aminokwasy, witamy, zasady purynowe i pirymidynowe i inne. II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA 1. Przygotowanie podłoży a) Podłoże AB Zmieszać ze sobą: 50 ml soli A (Na2HPO4, KH2PO4, pH 8,4) 50 ml soli B (NH4Cl, MgSO4, Na2S2O3, pH 7,0) 2 ml roztworu czerwieni fenolowej 22 2 ml soli Tuovinena (wersenian sodu, ZnSO4, CaCl2, MnCl2, FeSO4, (NH4)6Mo7O24, CuSO4, CoCl2, pH 6,0) 100 ml 4 % agaroidu b) Agar odżywczy Skład: wyciąg mięsny, ekstrakt drożdżowy, pepton, NaCl, woda, agar-agar. c) Podłoże dla nitryfikatorów Do 2 kolb à 300 ml wlać po 50 ml wody wodociągowej i dodać do każdej z nich po 2 ml następujących roztworów: 6 % (NH4)2SO4; 0,6 % MgSO4; 0,1 % FeSO4; 0,3 % K2HPO4; 0,6 % NaCl; 20 % CaCO3. d) Agar odżywczy ze skrobią (1 %) e) Agar odżywczy z mlekiem Do upłynnionego agaru odżywczego dodać 8 ml jałowego, odtłuszczonego mleka. f) Agar odżywczy z tłuszczem (3 %) Do upłynnionego agaru odżywczego dodać 6 g wrzącej margaryny. g) Podłoże EMB z laktozą Zmieszać: 190 ml upłynnionego podłoża (o składzie: ekstrakt drożdżowy, hydrolizat kazeiny, K2HPO4, NaCl, woda, agar-agar) 2 ml wodnego roztworu 4 % eozyny 2 ml wodnego roztworu 0,65 % błękitu metylenowego 10 ml 20 % roztworu laktozy. h) Żelatyna odżywcza: woda, żelatyna, pepton. i) Podłoże Davisa dla prototrofa Zmieszać ze sobą: 40 ml soli Davisa (K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, (NH4)2SO4, cytrynian sodu, woda) 4 ml 20 % glukozy 150 ml agaroidu j) Podłoże Davisa dla auksotrofa Do podłoża Davisa, sporządzonego jak wyżej, dodać 2 ml hydrolizatu kazeiny i 2 ml roztworu tiaminy. k) Podłoże dla bakterii wiążących azot Skład: woda, mannitol, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, NaCl, CaCO3, ślady MnSO4, FeCl2, Na2MoO4. l) Podłoże Davisa z różnymi źródłami azotu Zmieszać ze sobą: 40 ml bezazotowych soli Davisa 4 ml 20 % glukozy 2 ml roztworu zawierającego źródło azotu 150 ml agaroidu Źródła azotu to: 10 % roztwór NH4Cl 23 10 % roztwór KNO3 20 % roztwór hydrolizatu kazeiny 2. Źródła węgla i energii a) Określenie typu pokarmowego badanych szczepów Szczepy bakteryjne: Bacillus subtilis Halothiobacillus neapolitanus Paracoccus versutus Micrococcus luteus Podłoża: podłoże mineralne AB agar odżywczy - Płytkę z podłożem AB i z agarem odżywczym podzielić na 4 sektory i odpowiednio podpisać. - Każdy ze szczepów wysiać rysą na oddzielnych sektorach obu podłoży. - Po inkubacji w temperaturze pokojowej określić typ pokarmowy badanych bakterii na podstawie uzyskanych wyników.. Zmiana barwy podłoża AB z czerwonej na żółtą świadczy o jego zakwaszeniu. b) Wykazanie obecności bakterii nitryfikacyjnych w glebie Materiał badany gleba Podłoże podłoże mineralne z punktu 1c) - Podłoże przygotowane w punkcie 1c) rozlać do 2 kolbek à 100 ml. - Do jednej z nich wprowadzić grudkę gleby. Drugą zostawić niezaszczepioną, jako kontrolę. Po 1 i 2 tygodniach inkubacji w temperaturze pokojowej zbadać, czy w hodowli pojawiły się azotyny. Do jednej probówki pobrać około 2 ml pożywki z kolby zaszczepionej glebą, a do drugiej z kolby kontrolnej. Do obu probówek dodać po kilka kropli mieszaniny naftyloaminy z kwasem sulfanilowym lub wsypać odrobinę odczynnika firmy Merck do wykrywania azotynów. Pojawienie się różowego zabarwienia świadczy o obecności azotynów w próbie. c) Badanie zdolności bakterii heterotroficznych do wykorzystywania różnych organicznych źródeł węgla Szczepy bakteryjne: Escherichia coli dzika (Lac+) Escherichia coli mutant (Lac-) Bacillus subtilis Pseudomonas fluorescens Podłoża: agar odżywczy ze skrobią agar odżywczy z mlekiem agar odżywczy z tłuszczem EMB z laktozą żelatyna odżywcza - Płytki z pożywkami podzielić na pół, odpowiednio podpisać i zrobić posiewy: - na agar odżywczy z mlekiem i ze skrobią posiać rysą B. subtilis i dziką E. coli; - na agar odżywczy z tłuszczem posiać rysą E. coli i P. fluorescens; - na podłoże EMB z laktozą posiać posiewem redukcyjnym dziką E. coli (Lac+) i mutanta E. coli (Lac-) lub Proteus vulgaris (Lac-); - Na jeden słupek z żelatyną odżywczą wsiać igłą B. subtilis, a na drugi E. coli. 24 - Płytki z podłożem EMB inkubować w 37oC przez noc (jeśli nie mogą być obejrzane po 24 godz., wstawić do lodówki). - Pozostałe posiewy inkubować w temperaturze pokojowej przez kilka dni. Odczyt posiewów po inkubacji: - Płytki z agarem odżywczym i skrobią należy zalać płynem Lugola. Brak fioletowego zabarwienia wokół strefy wzrostu bakterii świadczy o rozkładzie skrobi. - Na agarze odżywczym z mlekiem obserwuje się przejrzyste strefy wokół linii wzrostu szczepów hydrolizujących kazeinę. - Płytki z agarem odżywczym i tłuszczem należy zalać 20 % roztworem CuSO4. Pojawienie się szmaragdowego zabarwienia wokół linii wzrostu świadczy o rozkładzie tłuszczu. - Na podłożu EMB kolonie bakterii zużywających cukier są fioletowe z metalicznym połyskiem, a kolonie bakterii niezdolnych do zużycia danego cukru są różowe. d) Prototrofy i auksotrofy Szczepy bakteryjne: E. coli dzika E. coli AB1157 thr leu pro his arg thi E. coli 108 pro met thy Podłoża: podłoże Davisa podłoże Davisa z hydrolizatem kazeiny i tiaminą agar odżywczy - Płytkę z agarem odżywczym, podłożem Davisa oraz podłożem Davisa uzupełnionym hydrolizatem kazeiny i tiaminą podzielić na trzy sektory i odpowiednio podpisać. - Na jednym sektorze wszystkich trzech pożywek posiać wężykiem dziką E. coli, a na dwóch pozostałych oba mutanty auksotroficzne. - Po inkubacji zinterpretować otrzymane wyniki. 3. Źródła azotu a) Izolowanie z gleby bakterii wiążących azot cząsteczkowy - Z kolbki zawierającej podłoże bezazotowe (punkt 1k, str.23) odlać do probówki z nakrętką około 10 ml podłoża. - Do probówki dodać „szczyptę” sacharozy. - Probówkę i kolbę zaszczepić grudką gleby. Probówkę szczelnie zakręcić. Inkubować w temperaturze pokojowej. - Po tygodniu zaobserwować wzrost Azotobacter sp. w postaci błonki na powierzchni pożywki. - Pobrać próbkę z błonki na dwa szkiełka podstawowe. - Jedno przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obserwować przyżyciowo komórki Azotobacter sp. oraz jego cysty, widoczne jako okrągłe twory, dość silnie załamujące światło. - Na drugim wykonać preparat tuszowy (ewentualnie dobarwiony błękitem metylenowym). Obserwować komórki z otoczkami. - Wyjałowiona ezą pobrać materiał z kożucha i zrobić posiew redukcyjny na stałe podłoże dla bakterii wiążących N2. Po inkubacji obserwować pojawienie się śluzowatych kolonii Azotobacter spp. 25 - Jeśli w probówce z pożywką bezazotową namnożył się Clostridium pasteurianum, z dna probówki powinny odrywać się pęcherzyki gazu, a po odkręceniu nakrętki czuć jest zapach kwasu masłowego. - Z dennej części probówki pobrać pipetą pasterowską nieco hodowli, nanieść kroplę na szkiełko podstawowe i zmieszać z równą objętością płynu Lugola. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym. - Obserwować w mikroskopie laseczki z zabarwionym na fioletowo materiałem zapasowym (granulozą) wypełniającym komórki. b) Wykorzystywanie różnych innych źródeł azotu - Trzy płytki z podłożem Davisa z trzema różnymi źródłami azotu – NH4Cl, KNO3 i hydrolizatem kazeiny – podzielić na dwie części. - Na jednej połowie posiać rysą E. coli, a na drugiej – B. subtilis. - Po inkubacji zaobserwować, jakie źródła azotu może wykorzystywać każda z badanych bakterii. III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA 1. Źródła pierwiastków biogennych i energii. 2. Typy pokarmowe bakterii. 3. Prototrofy i auksotrofy; czynniki wzrostowe. 4. Różnorodność źródeł węgla i azotu wykorzystywanych przez bakterie. 26 Tabela 3. Właściwości metaboliczne badanych bakterii (źródło węgla, azotu i energii) Wzrost na podłożu BAKTERIA AO AB Rozkład związków wielkocząsteczkowych Typ pokarmowy żelatyna skrobia (amylazy) kazeina wzrost/ upłynnienie proteazy Escherichia coli Micrococcus luteus Serratia marcescens Pseudomonas stutzeri Pseudomonas fluorescens Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis Enterococcus faecalis Paracoccus versutus Halothiobacilus neapolitanus 27 tłuszcz (lipazy) Źródła azotu na podłożu Davisa z NH4Cl KNO3 hydrolizat kazeiny Wymagania pokarmowe Ćwiczenie 7 Temat: Metabolizm bakterii - procesy oddechowe i fermentacje I. WPROWADZENIE Chemotrofy uzyskują energię z utleniania jakichś pierwiastków bądź związków chemicznych. Proces utleniania zachodzący z udziałem łańcucha transportu elektronów i egzogennego końcowego akceptora elektronów nazywamy oddychaniem. W tym procesie ATP powstaje w wyniku fosforylacji oksydacyjnej. Ilość uwalnianej energii jest tym większa, im dłuższy jest łańcuch transportu elektronów, dlatego też najbardziej wydajne energetycznie jest oddychanie tlenowe, w którym końcowym akceptorem jest tlen. Organizmy zdolne do wykorzystania tlenu w oddychaniu nazywamy tlenowcami. Wśród tlenowców wyróżniamy (i) tlenowce bezwzględne – nie potrafią wykorzystać innych niż tlen akceptorów elektronów, (ii) tlenowce warunkowe – potrafią wykorzystać inne niż tlen akceptory i (iii) mikroaerofile – wykorzystują tlen, ale rosną wówczas, gdy jego stężenie jest niższe niż w powietrzu (od 1 do 15 %, w zależności od mikroorganizmu). Istnieje duża grupa prokariotów, które potrafią oddychać beztlenowo, wykorzystując inne niż tlen końcowe akceptory elektronów. Mogą to być pierwiastki chemiczne (np. siarka), utlenione związki nieorganiczne (np. azotany, siarczany), a także pewne związki organiczne (np. fumaran). Do oddychania beztlenowego zdolne są nie tylko beztlenowce, ale także niektóre tlenowce warunkowe, np. bakterie denitryfikacyjne. Bakterie te, gdy w środowisku brakuje tlenu, a występują w nim azotany, przerzucają się z oddychania tlenowego na oddychanie azotanowe. Do beztlenowców zdolnych do uzyskiwania energii w procesie oddychania należą np. bakterie redukujące siarczany, które wykorzystują siarczany jako końcowy akceptor elektronów. Wśród beztlenowców możemy wyróżnić grupę (i) beztlenowców aerotolerancyjnych, które, choć nie potrafią wykorzystać tlenu jako akceptora elektronów, mogą przeżyć pewien okres w warunkach tlenowych i (ii) beztlenowców bezwzględnych, którym szkodzi wszelka ekspozycja na działanie tlenu, więc ich hodowle trzeba prowadzić w specjalnych urządzeniach zwanych anaerostatami. Prokarioty mogą też uzyskiwać energię z utleniania związków organicznych, bez udziału łańcucha transportu elektronów, z wykorzystaniem endogennych akceptorów elektronów. Taki sposób uzyskiwania energii nazywamy fermentacją. Do fermentacji zdolne są niektóre warunkowe tlenowce (np. E. coli) i niektóre beztlenowce (np. Clostridium spp.). W metabolizmie fermentacyjnym ATP powstaje w wyniku fosforylacji substratowej. Nazwy fermentacji wywodzą się od najbardziej charakterystycznego produktu końcowego, którym jest związek (lub związki) organiczny. II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Szczepy bakteryjne: Escherichia coli Bacillus subtilis Pseudomonas fluorescens Pseudomonas stutzeri Enterococcus faecalis Paracoccus versutus Staphylococcus epidermidis Micrococcus luteus Serratia marcescens Podłoża i roztwory: bulion odżywczy bulion odżywczy z KNO3 (0,1 %) mleko z lakmusem 20 % roztwór glukozy 0,3 % roztwór błękitu metylenowego woda utleniona jałowa parafina 28 1. Określenie stosunku bakterii do tlenu a) Przygotowane w probówkach podłoża zaszczepić jedną kroplą nocnej hodowli bulionowej bakterii wg wskazówek prowadzącego zajecia: - bulion odżywczy z dodatkiem 0,5 % glukozy – wysoki słup podłoża, ogrzanego przed posiewem we wrzącej łaźni wodnej szybko schłodzonego w lodzie; - bulion odżywczy – niski słup podłoża. b) Po posiewie – wysoki słup podłoża należy zalać jałową parafiną, aby uniemożliwić dostęp powietrza. Zaszczepione podłoża inkubować w 30 lub 37oC (w zależności od bakterii) przez 24 godz. c) Obserwować wzrost lub jego brak w poszczególnych probówkach. Wyniki zamieścić w tabeli 4. Określić stosunek badanych bakterii do tlenu. 2. Wykazanie obecności katalazy w wybranych szczepach bakterii Nocne hodowle szczepów bakterii na płytkach z agarem odżywczym zalać wodą utlenioną. Wydzielanie się pęcherzyków gazu świadczy o obecności katalazy – enzymu rozkładającego nadtlenek wodoru na wodę i tlen. 3. Oddychanie azotanowe (w tym denitryfikacja) a) Probówki zawierające bulion odżywczy z KNO3 (wysoki słup pożywki i rurka Durhama) zaszczepić bakteriami wg wskazówek prowadzącego zajęcia; jedną probówkę pozostawić nieszczepioną jako kontrolę. b) Po inkubacji obserwować obecność gazu w rurkach Durhama, sprawdzić obecność jonów NO2- w hodowli (za pomocą odpowiedniego odczynnika firmy Merck). c) Na podstawie uzyskanych wyników określić, który ze szczepów jest zdolny do oddychania azotanowego. Wyniki zamieścić w tabeli 4. 4. Fermentacja i peptonizacja mleka a) Do probówek zawierających odtłuszczone, jałowe mleko z lakmusem wsiać kolejno: Enterococcus faecalis, E. coli, B. subtilis, czwartą probówkę pozostawić nie zaszczepioną. b) Inkubować 24 godz w 37oC, zaobserwować zmiany w podłożu: zakwaszenie lub alkalizację, powstanie skrzepu kazeiny, hydrolizę kazeiny, redukcję lakmusu. c) Na podstawie zaobserwowanych zmian określić zdolność badanych szczepów do fermentacji lub peptonizacji mleka. Wyniki zamieścić w tabeli 4. Mleko odtłuszczone zawiera laktozę, kazeinę, sole mineralne i witaminy – jest więc znakomitą pożywką, na której może rozwijać się ogromna liczba gatunków bakterii. Jeśli bakterie fermentują laktozę, wówczas powstaje kwas mlekowy w takiej ilości, że wytrąca się kazeina jako tzw. skrzep kwaśny. Następuje zmiana barwy lakmusu na różową. Wskutek wytworzenia się warunków prawie beztlenowych w dolnej części słupa pożywki następuje redukcja lakmusu, który pełni rolę końcowego akceptora elektronów. Bakterie, które nie fermentują laktozy mogą wykazywać zdolność do peptonizacji kazeiny po jej uprzednim wytrąceniu przez podpuszczkę (tzw. skrzep słodki). W tym przypadku obserwuje się alkalizację mleka (zmiana barwy lakmusu na niebieską), a następnie w miarę upływu czasu – upłynnienie skrzepu. 29 Tabela 4. Właściwości metaboliczne badanych bakterii (procesy oddechowe i fermentacje) BAKTERIA Bulion odżywczy wysoki słup niski + glukoza słup + ogrzanie + parafina Bulion odżywczy + KNO3 Mleko z lakmusem Stosunek bakterii do tlenu Escherichia coli Micrococcus luteus Serratia marcescens Pseudomonas stutzeri Pseudomonas fluorescens Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis Enterococcus faecalis Paracoccus versutus 5. Test redukcji błękitu metylenowego (wykorzystanie błęktu metylenowego jako końcowego akceptora elektronów) a) Ponumerować pięć probówek. b) Do każdej probówki dodać 0,1 ml wodnego roztworu błękitu metylenowego. c) Przygotować rozcieńczenia młodej hodowli bulionowej E. coli wg schematu: nr probówki 1 2 3 4 5 (kontrola) bulion (ml) 9 7 5 10 hodowla (ml) 1 3 5 10 - d) Zawartość probówek dokładnie wymieszać i wstawić je do termostatu o temp. 37oC. 30 e) W odstępach 10-minutowych obserwować zabarwienie zawartości probówek. Zanotować czas odbarwienia błękitu w poszczególnych probówkach. e) Po zakończeniu obserwacji zawartość probówek ponownie wymieszać. Wyjaśnić obserwowane zmiany zabarwienia. III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA 1. Stosunek bakterii do tlenu: tlenowce bezwzględne i względne, mikroaerofile, beztlenowce bezwzględne i aerotolerancyjne. 2. Metody hodowli tlenowców, mikroaerofilów i beztlenowców. 3. Porównanie procesów oddechowych i fermentacji: a) końcowe akceptory elektronów b) końcowe produkty c) zysk energetyczny w różnych typach oddychania i w fermentacjach. 31 Tabela 5. Podsumowanie właściwości metabolicznych badanych szczepów BAKTERIA Bakterie nitryfikacyjne Halothiobacillus neapolitanus Paracoccus versutus Escherichia coli Serratia marcescens Pseudomonas stutzeri Azotobacter sp. Clostridium pasteurianum Bacillus subtilis Enterococcus faecalis Micrococcus luteus Staphylococcus epidermidis 32 Źródło węgla Sposób uzyskiwania energii Typ pokarmowy Źródło azotu Wymagania pokarmowe Końcowy akceptor elektronów Stosunek do tlenu Ćwiczenie 8 Temat: Koniugacja u bakterii I. WPROWADZENIE 1. Plazmidy i koniugacja Koniugacja jest jednym ze sposobów przekazywania materiału genetycznego u bakterii, warunkujących horyzontalny transfer genów. Proces ten wymaga bezpośredniego kontaktu dwu komórek, z których jedna pełni rolę dawcy, a druga biorcy DNA. Zdolność do przekazywania materiału genetycznego (bycia dawcą) jest uwarunkowana obecnością w komórce plazmidu koniugacyjnego. Plazmidy to dwuniciowe, autonomiczne cząsteczki DNA (najczęściej koliście zamknięte), zdolne do replikacji w komórce odpowiedniego gospodarza. Niektóre z nich zawierają geny nadające komórce określony fenotyp. Plazmidy koniugacyjne (np. plazmid F; rys. 4A) mają zestaw genów tra, warunkujących między innymi (i) syntezę pilusów, które umożliwiają wytworzenie pary koniugacyjnej i (ii) miejsce oriT (ang. origin of transfer), od którego rozpoczyna się transfer plazmidu od dawcy do biorcy. Jednym z badanych na ćwiczeniach plazmidów jest plazmid F (ang. fertility) E. coli. Może on występować albo w stanie autonomicznym (w szczepach nazwanych F+), w którym replikuje się niezależnie od chromosomu gospodarza, albo w stanie zintegrowanym z chromosomem (w szczepach Hfr; ang. high frequency of recombination), w którym replikuje się jako jego część. Szczepy E. coli bez plazmidu F określa się jako F- (rys. 4B). Rys. 4. A. Organizacja genetyczna plazmidu F (uproszczony schemat). B. Typy komórek E. coli w zależności od obecności plazmidu F. W wyniku koniugacji biorcy F- z dawcą F+ powstają transkoniuganty, które uzyskują plazmid F (rys. 5). Koniugacja biorcy F- z dawcą typu Hfr prowadzi do ukierunkowanego przekazywania chromosomu dawcy, w wyniku czego mogą powstawać z dużą częstością rekombinanty chromosomowe (nie zawierające plazmidu F). Częstość pojawiania się różnego typu rekombinantów jest zależna od odległości danego genu od punktu początkowego transferu – oriT i jest tym większa, im bliżej tego punktu leży dany gen. W zależności od miejsca integracji plazmidu F z chromosomem bakteryjnym, 33 powstają różnego typu szczepy Hfr. Każdy z nich ma plazmid włączony w inne, ściśle określone miejsce. Ponieważ transfer koniugacyjny DNA zawsze rozpoczyna się od miejsca oriT, każdy typ Hfr przekazuje inne geny chromosomowe jako pierwsze. Zastosowanie różnych typów Hfr pozwoliło, wiele lat temu, na określenie położenia różnych genów w chromosomie E. coli. Podobnie jak plazmid F mogą być przekazywane inne plazmidy koniugacyjne. Niosą one często, poza genami warunkującymi replikację i transfer koniugacyjny, także geny nadające komórce gospodarza określone cechy fenotypowe, np. oporność na antybiotyki, metale ciężkie, czy też zdolność do metabolizowania określonych źródeł węgla (np. toluenu). Cechy te w pewnych warunkach środowiska mogą stać się selektywnie korzystne dla bakterii, która uzyskała plazmid. Na ćwiczeniach badany jest transfer koniugacyjny plazmidu pMAO– oriT, warunkującego oporność na ampicylinę i kanamycynę. Stosując odpowiednie podłoża selekcyjne, można uzyskać kolonie transkoniugantów, a więc komórek biorcy, które uzyskały plazmid dzięki transferowi koniugacyjnemu. Podłoże selekcyjne musi mieć taki skład, aby możliwy był wzrost kolonii transkoniugantów, natomiast zahamowany wzrost komórek biorcy i dawcy. Stosując tę samą zasadę, można wyselekcjonować kolonie rekombinantów chromosomowych po koniugacji szczepu F- i Hfr. Rys. 5. Koniugacja szczepów F- (biorca) i F+ (dawca) E. coli. 1. Fenotyp i genotyp Geny i operony prokariotów oznacza się, stosując symbole trzyliterowe, pisane małą literą i kursywą (np. operon lac), które pochodzą od nazw angielskich (np. lac od ang. lactose). Wielka litera po tej nazwie trzyliterowej oznacza konkretny gen (np. lacZ – gen β-galakto34 zydazy), którego produkty uczestniczą w danym szlaku biosyntezy, degradacji, itd. Fenotyp (np. rekombinantów) zapisuje się wielką literą, zamieszczając w górnej frakcji „+” lub „-”, np. Lac+ – oznacza bakterię zdolną, a Lac- – niezdolną, do wykorzystania laktozy jako źródła węgla i energii. Oporność lub wrażliwość na antybiotyki zapisuje się symbolami dwuliterowymi, np. Apr, jeśli geny oporności znajdują się w plazmidzie lub trzyliterowymi, np. Amps, jeśli geny mają lokalizację chromosomową (Ap i Amp oznaczają ampicylinę). Występujące w górnej frakcji symbole „s” i „r”, oznaczają, że szczep jest odpowiednio – wrażliwy (ang. sensitive) lub oporny (ang. resistant) na dany antybiotyk. Zapis: E. coli lacZ met Strr oznacza, że ten szczep E. coli (i) ma mutację w genie lacZ, kodującym β-galaktozydazę (a więc jest niezdolny do wykorzystania laktozy jako źródła węgla), (ii) ma mutację w jakimś genie związanym z biosyntezą metioniny (więc wymaga metioniny do wzrostu) i (iii) jest oporny na streptomycynę, ale przyczyna tej oporności nie jest znana. Pozostałe geny są takie jak w szczepie dzikim. II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Szczepy bakteryjne: Escherichia coli a) F 108 Hfr C pro met thy Strr prototrof Strs - biorca - dawca Rifr Apr Kmr - biorca - dawca b) DH5αR TG1 (pMAO1-oriT) Podłoża i roztwory: - agar odżywczy - podłoże Davisa płynne (150 ml wody dest., 40 ml soli Davisa, 4 ml 20 % glukozy) - podłoże Davisa stałe (150 ml agaroidu, 40 ml soli Davisa, 4 ml 20 % glukozy) - roztwór fizjologiczny - roztwór hydrolizatu kazeiny (20 %) - roztwory aminokwasów: metioniny i proliny (1 mg/ml) - roztwór tyminy (3 mg/ml) - roztwór streptomycyny (5 mg/ml) - roztwór ampicyliny (5 mg/ml) - roztwór kanamycyny (5 mg/ml) - roztwór ryfampicyny (5 mg/ml). Uwaga: Studenci otrzymują gotowe, jałowe roztwory metioniny, proliny, tyminy i antybiotyków. Należy dodawać je w ilości 1 ml na 100 ml podłoża. Każdy zespół wykonuje jedną z koniugacji: 1) F-108 x HfrC 2) DH5αR x TG1(pMAO-oriT) Koniugacja 1 1. Szczepy rodzicielskie hodować przez 18 godz., w temp. 37oC, w podłożu Davisa uzupełnionym wymaganymi przez szczep czynnikami oraz hydrolizatem kazeiny. 35 2. Nocną hodowlę każdego szczepu rozcieńczyć 1:20 świeżym podłożem i inkubować w 37oC do osiągnięcia wykładniczej fazy wzrostu (2,5-3 godz.). 3. Hodowle dawcy i biorcy zmieszać w stosunku 1:10 (4,5 ml hodowli F- i 0,5 ml hodowli Hfr). 4. Mieszaninę koniugacyjną wstawić do termostatu o temp. 37oC na 60 min. 5. Rozcieńczyć hodowlę szczepu dawcy i wysiać (rozc. 10-6 i 10-7) na płytki z agarem odżywczym w celu określenia liczby komórek użytych do koniugacji (jtk/ml). Płytki inkubować przez 24 godz. w 37oC. 6. Po zakończeniu koniugacji mieszaninę koniugacyjną rozcieńczyć i wysiać na odpowiednie podłoża selekcyjne wg schematu: a) selekcja rekombinantów Pro+Strr – na podłożu Davisa z dodatkiem metioniny, tyminy i streptomycyny – wysiać rozcieńczenie 10-2 i 10-3 (po dwa powtórzenia); b) selekcja rekombinantów Met+Strr – na podłożu Davisa z dodatkiem proliny, tyminy i streptomycyny – wysiać rozcieńczenie 10-1 i 10-2 (po dwa powtórzenia). Inkubować w 37oC przez 48 godzin. 7. Policzyć kolonie rekombinantów i szczepu dawcy, a następnie przeliczyć na jtk/ml; obliczyć częstość rekombinacji (X) wg wzoru: liczba rekomb. w 1 ml miesz. koniug. [jtk/ml] x 100 % X = ---------------------------------------------------------------------liczba dawcy w 1 ml miesz. koniug. [jtk/ml] 8. Otrzymane wyniki wstawić do tabeli 6 i zinterpretować. Koniugacja 2 1. Szczepy rodzicielskie hodować przez 18 godz., w temp. 37oC, w bulionie odżywczym: szczep DH5αR – bez dodatków, TG1(pMAO1-oriT) – z ampicyliną (stęż. 50 g/ml) lub z kanamycyną (50 g/ml). 2. Nocne hodowle rozcieńczyć 10-krotnie świeżą pożywką bez antybiotyku i inkubować w 37oC do uzyskania wykładniczej fazy wzrostu (2-3 godziny). 3. Zmieszać w probówce hodowle biorcy i dawcy (w wykładniczej fazie wzrostu) w stosunku 1:1 i inkubować 60 min w 37oC. 4. Rozcieńczyć mieszaniny koniugacyjne i wysiać rozcieńczenia 10 -1 – 10-3 na podłoża selekcyjne: a) agar odżywczy z ryfampicyną i ampicyliną (po 50 g/ml) – dla transkoniugantów RifrApr; b) agar odżywczy z ryfampicyną (50 g/ml) i kanamycyną (50 g/ml) – dla transkoniugantów RifrKmr. Płytki inkubować w 37oC przez 24 godziny. 5. Rozcieńczyć hodowlę szczepu dawcy i wysiać (rozc. 10-5 i 10-6 lub 10-6 i 10-7, według wskazówek prowadzącego zajęcia) na płytki z agarem odżywczym w celu określenia liczby komórek użytych do koniugacji. Płytki inkubować przez 24 godz. w 37oC. 6. Policzyć kolonie transkoniugantów i szczepów dawców, a następnie przeliczyć na jtk/ml; obliczyć częstość przekazywania plazmidu (X) wg wzoru: liczba transkoniug. w miesz. koniug. [jtk/ml] x 100 % X = ------------------------------------------------------------------liczba dawcy w miesz. koniug. [jtk/ml] 36 7. Otrzymane wyniki wstawić do tabeli 6 i zinterpretować. Tabela 6. Koniugacja u bakterii Rodzaj wysiewu Koniugacja I Fenotyp selekcjonowanego rekomb. lub transkon. Średnia liczba kolonii rekomb., transkoniug. lub dawców uzyskanych z rozcieńczenia: 10-1 10-2 10-3 10-5 10-6 10-7 [%] rekomb./ transkon. jtk/ml Fenotyp I XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX XXX Fenotyp II Koniugacja II Fenotyp I Fenotyp II Dawca I XXXXXXXXXX XXX XXX XXX XXXXXXX XXXXXXXXXX XXX XXX XXX XXXXXXX Dawca II III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA 1. Plazmidy i koniugacja. 2. Różne typy dawców w koniugacji warunkowanej plazmidem F. 3. Przekazywanie cech chromosomowych i plazmidowych. 4. Selekcjonowanie różnych typów rekombinantów i transkoniugantów. 37 Ćwiczenie 9 Temat: Analiza mikrobiologiczna wody Oznaczanie bakterii grupy coli I. WPROWADZENIE W wodach powierzchniowych, oprócz typowej mikroflory wodnej, mogą się też znajdować mikroorganizmy, które zostały wypłukane z gleby lub przedostały się do niej wraz ze ściekami. W skład mikroorganizmów ściekowych wchodzą mikroorganizmy stanowiące normalną mikroflorę przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt oraz mikroorganizmy chorobotwórcze. Woda jest konsumowana w znacznych ilościach, więc jeśli nawet zawiera niewielką liczbę mikroorganizmów patogennych (takich jak Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae, enterowirusy, itd.) może stanowić źródło zakażenia. Zmusza nas to do prowadzenia stałej kontroli sanitarnej wody pitnej, wód zbiorników powierzchniowych i wody w basenach. O możliwości występowania w badanej wodzie mikroorganizmów patogennych wnioskuje się pośrednio, badając obecność tzw. bakterii wskaźnikowych, które stale żyją jako saprofity w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt wyższych. Najważniejszą bakterią wskaźnikową jest Escherichia coli, która wchodzi w skład tzw. grupy coli. Bakterie grupy coli to gramujemne pałeczki, nieprzetrwalnikujące, względnie tlenowe, fermentujące laktozę po 48 godz. z wytworzeniem kwasu oraz gazu i tworzące na podłożu różnicującym z laktozą charakterystyczne kolonie (np. na podłożu Endo i EMB – kolonie bordowe z metalicznym połyskiem). Bakterie grupy coli dzielą się na dwa typy: (i) kałowy (fekalny), w skład którego wchodzą bakterie fermentujące laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w 37o i 44oC (E. coli); (ii) ziemny, w skład którego wchodzą bakterie ziemne, zdolne do fermentacji laktozy w temperaturze 37oC, ale nie w 44oC (Citrobacter sp. i Enterobacter sp.). Obecność w badanej wodzie bakterii grupy coli świadczy o jej skażeniu ściekami bytowymi (jeśli wykrywa się bakterie grupy coli typu kałowego) lub glebą (jeśli wykrywa się bakterie grupy coli typu ziemnego). Analiza sanitarna wody obejmuje następujące badania mikrobiologiczne: (i) badanie obecności bakterii grupy coli, z zastosowaniem (w zależności od spodziewanego stopnia skażenia badanej wody): - metody fermentacyjno-probówkowej - metody filtrów membranowych. Miano coli jest to najmniejsza objętość badanej wody (wyrażona w cm3), w której znajdują się jeszcze bakterie grupy coli. (ii) oznaczanie liczby: - bakterii psychrofilnych (typowych autochtonicznych bakterii wodnych) - bakterii mezofilnych (bakterii allochtonicznych, pochodzących z gleby lub ścieków). W tym celu badaną wodę (lub jej rozcieńczenia) sieje się na agar odżywczy, metodą posiewu powierzchniowego lub wgłębnego, w zależności od spodziewanej liczby bakterii. Płytki inkubuje się w dwóch temperaturach: (i) 20 oC – w celu określenia jtk/ml bakterii psychrofilnych i (ii) 37oC – w celu określenia jtk/ml bakterii mezofilnych. 38 II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Materiał: woda wodociągowa woda ze zbiornika naturalnego ścieki komunalne Podłoża: 1) agar odżywczy 2) podłoże Eijkmana o składzie: - pepton - laktoza - NaCl - purpura bromokrezolowa 1. Badanie wody wodociągowej a) Pobrać próbkę wody wodociągowej. - W tym celu wylot kranu należy wymyć, wytrzeć do sucha i opalić palnikiem. - Następnie spuszczać wodę z kranu przez 10 minut. - Po tym czasie, nie zakręcając dopływu, pobrać około 200 ml wody do jałowej kolby à 300 ml. Kolbę zamknąć jałowym korkiem. b) Oznaczyć liczbę bakterii psychrofilnych i mezofilnych metodą posiewu wgłębnego. - W tym celu na 4 płytki Petriego wlać po 1 ml pobranej wody. - Następnie na każdą z nich wlać 20 ml upłynnionego agaru odżywczego ostudzonego do temperatury około 46o C. - Całość rozprowadzić równomiernie po powierzchni płytki. - Po zakrzepnięciu dwie płytki inkubować w 20oC (przez 72 godz.) i dwie w 37oC (przez 24 godz). - Po inkubacji policzyć liczbę kolonii na płytkach i uśrednić. Porównać liczbę psychrofili i mezofili. c) Oznaczyć bakterie grupy coli. - Do 10 probówek zawierających po 10 ml podłoża Eijkmana wlać po 1 ml wody wodociągowej - 5 probówek inkubować w 37oC, a 5 w 44oC. - Po 24 i 48 godzinach inkubacji obserwować zmiany pożywki. Zakwaszenie podłoża (zmiana barwy podłoża z fioletowej na żółtą) i obecność gazu w rurce Durhama świadczą o występowaniu bakterii grupy coli. Takie zmiany podłoża obserwowane w probówkach inkubowanych w obu temperaturach wskazują na obecność bakterii grupy coli typu fekalnego. Brak gazu i zakwaszenia po 48 godzinach uznaje się za wynik ujemny. 2. Badanie wody ze zbiornika naturalnego a) Pobrać próbkę wody ze zbiornika. b) Oznaczyć liczbę bakterii psychrofilnych i mezofilnych. - Rozcieńczyć badaną wodę 10-1 do 10-4. - Po 0,1 ml każdego z rozcieńczeń wysiać na 4 płytki z agarem odżywczym. - Dwie z nich inkubować w 37oC, a dwie w temperaturze pokojowej. - Policzyć wyrosłe kolonie. Na podstawie wzoru z punktu 3d ze str. 12 obliczyć liczbę bakterii psychrofilnych i mezofilnych w 1 ml badanej wody. Wyniki zamieścić w tabeli 7 i krytycznie je porównać. c) Oznaczyć miano coli metodą fermentacyjno-probówkową. - Do probówek zawierających po 10 ml podłoża Eijkmana i rurki Durhama, ponumerowanych od 1 do 10 dodajemy kolejno wg schematu: 39 1 ml wody nierozcieńczonej 1 ml wody rozcieńczonej 10-1 1 ml wody rozcieńczonej 10-2 1 ml wody rozcieńczonej 10-3 1 ml wody rozcieńczonej 10-4 probówka nr 1 i 2 probówka nr 3 i 4 probówka nr 5 i 6 probówka nr 7 i 8 probówka nr 9 i 10 - Szereg probówek o numerach parzystych inkubować w temperaturze 37oC, a o numerach nieparzystych w 44oC. Obserwacje należy przeprowadzić po 48 godz. inkubacji. Zakwaszenie podłoża (zmiana barwy podłoża z fioletowej na żółtą) i obecność gazu w rurce Durhama świadczą o występowaniu bakterii z grupy coli, przy czym jeśli takie zmiany podłoża obserwuje się w probówkach inkubowanych w 44oC – bakterii z grupy coli typu fekalnego. Ostatnia probówka w szeregu z wynikiem pozytywnym stanowi podstawę do oznaczenia miana coli i miana coli typu fekalnego. Brak gazu i zakwaszenia po 48 godz. przyjmuje się jako wynik ujemny. Tabela 7. Liczba bakterii z grupy coli w próbach wody pobranych z wód powierzchniowych Woda powierzchniowa Temperatura inkubacji 22oC Wysiane rozcieńczenie i jtk/ml otrzymana liczba kolonii bakterii Temperatura inkubacji 37oC Wysiane rozcieńczenie i jtk/ml otrzymana liczba kolonii bakterii Zbiornik I Zbiornik II 3. Oznaczenie bakterii z grupy coli w ściekach komunalnych metodą fermentacyjnoprobówkową a) Przygotować rozcieńczenia badanych ścieków 10-1 do 10-6. b) Oznaczyć miano coli metodą fermentacyjno-probówkową tak jak w punkcie 2c). III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA 1. Właściwe bakterie wodne. 2. Mikroorganizmy chorobotwórcze, które mogą się dostać do wody wraz ze ściekami. 3. Bakterie wskaźnikowe świadczące o skażeniu wody. 4. Sanitarna analiza bakteriologiczna wody. 5. Wykrywanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjno-probówkową i metodą filtrów membranowych. 6. Miano coli. 40 Ćwiczenie 10 Temat: Podstawowe techniki pracy z bakteriofagami I. WPROWADZENIE 1. Etapy infekcji fagowej Bakteriofagi, zwane w skrócie fagami, to wirusy będące bezwzględnymi, wewnątrzkomórkowymi pasożytami bakterii i archeonów. Jak wszystkie wirusy, mają one budowę niekomórkową. Cząstka wirusa (wirion) zawiera tylko jeden rodzaj kwasu nukleinowego, otoczony przez białkowy kapsyd. Fagi są zdolne do namnażania się w komórkach właściwego gospodarza, ale nie mają własnego metabolizmu. Wykorzystują do tego celu aparat metaboliczny tych prokariotów, które są w stanie zainfekować. Zwykle dany bakteriofag infekuje tylko określony gatunek, bądź nawet szczep czy grupę szczepów bakterii. Kolejne etapy infekcji fagowej: to (i) adsorpcja do wrażliwej komórki, posiadającej określony receptor; (ii) przedostanie się kwasu nukleinowego do komórki; (iii) replikacja kwasu nukleinowego wirusa; (iv) synteza podjednostek białkowych kapsydu; (v) łączenie się podjednostek białkowych kapsydu i pakowanie kwasów nukleinowych do kapsydu (czyli tworzenie potomnych cząstek wirusa); (vi) uwolnienie namnożonych cząstek wirusa z komórki, najczęściej w wyniku jej lizy (np. fag λ). Niektóre fagi nitkowate po namnożeniu opuszczają komórki gospodarza, nie doprowadzając do ich lizy (np. fag M13). Fagi łagodne (umiarkowane, np. fag λ) mają zdolność do wejścia w stan stabilnej równowagi (zwanej lizogenią) z komórkami gospodarza. W czasie infekcji populacji bakterii fagiem łagodnym większość komórek ulega lizie, a tylko niewielka część populacji – lizogenizacji. W szczepach E. coli zlizogenizowanych fagiem λ [E. coli (λ)], genom faga jest zintegrowany z chromosomem gospodarza (w postaci tzw. profaga) i replikuje się wraz z nim. Bakterie te są odporne na superinfekcję tym samym wirusem. Z niewielką częstością w populacji E. coli (λ) genom profaga ulega wycięciu z chromosomu i dochodzi do cyklu litycznego, dzięki któremu powstają cząstki wirusów potomnych. 2. Techniki pracy z fagami Fagi hoduje się i bada na (i) podłożu stałym porośniętym gęsto bakteriami (tzw. murawa bakteryjna), gdzie w wyniku ich działalności można obserwować tzw. łysinki, lub (ii) w płynnej hodowli bakterii wrażliwych, gdzie aktywność fagów przejawia się stopniowym spadkiem mętności hodowli, w miarę lizy komórek gospodarza. Łysinka jest to widoczna gołym okiem strefa przejaśnienia w gęstym wzroście bakterii na podłożu półpłynnym (tzw. metoda płytek dwuwarstwowych), powstająca najczęściej wskutek lizy części lub wszystkich komórek przez fagi. Zwykle łysinka powstaje w wyniku pierwotnej infekcji jednej bakterii przez jeden wirion. Morfologia łysinki, tzn. wielkość, kształt brzegów, stopień przejrzystości, może być pomocna w identyfikacji faga, np. fagi zjadliwe tworzą łysinki przejrzyste, zaś fagi łagodne – mętne, gdyż nie lizują wszystkich komórek. Dzięki możliwości uzyskiwania łysinek nie tylko (i) identyfikujemy niektóre fagi, ale także (ii) mianujemy lizaty fagowe i (iii) uzyskujemy czyste klony fagów. II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Szczepy bakteryjne: E. coli JM109 F’ lub TG1 Podłoża: agar odżywczy 41 E. coli DH1 lub DH5 E. coli( ) agar odżywczy półpłynny (0,7 %) bulion odżywczy Fagi: vir i M13 1. Oznaczenie miana faga techniką agaru dwuwarstwowego a) Rozcieńczyć odpowiednio zawiesinę faga w bulionie odżywczym (wg wskazówek osoby prowadzącej zajęcia). b) Do 4 probówek wlać po 0,1 ml hodowli E. coli DH1, a następnie dodać po 0,1 ml sąsiednich rozcieńczeń zawiesiny faga w dwóch powtórzeniach (np. do dwóch 10-4 i do dwóch 10-5). Uwaga! Zawiesinę bakterii i faga wlewać bezpośrednio na dno probówki, nie po ściankach! Inkubować 20 min w 37oC. c) Do każdej probówki dodać po 3 ml upłynnionego i schłodzonego do około 46oC agaru półpłynnego. Wymieszać, obracając probówkę między dłońmi. d) Natychmiast wylewać zawartość probówki na szalkę z agarem odżywczym (uprzednio odpowiednio podpisaną) i rozprowadzić szybko i równomiernie po całej jej powierzchni. Szalkę położyć poziomo, aby agar zastygł. e) Po zastygnięciu agaru, inkubować płytki w 37oC przez 24 godziny. f) Obliczyć liczbę łysinek fagowych. Uśrednić wyniki z dwóch płytek i uwzględniając rozcieńczenie obliczyć miano faga (X) wg wzoru: X = a x b x 10 [pfu/ml] a - średnia liczba łysinek b - odwrotność rozcieńczenia 10 - przeliczenie na 1 ml wyjściowej zawiesiny (pfu – ang. plaque forming unit, jednostka tworząca łysinkę) 2. Rodzaje łysinek fagowych a) Do probówki dodać 0,1 ml hodowli E. coli TG1 (wlewać bezpośrednio na dno probówki, nie po ściankach!) i 3 ml upłynnionego, schłodzonego agaru półpłynnego. Wymieszać i wylać na szalkę z agarem odżywczym, rozprowadzając szybko i równomiernie po całej powierzchni. b) Po zastygnięciu podzielić płytkę na 3 sektory i na każdy z nich nałożyć kroplę (nie więcej niż 10 l!) zawiesiny: - faga vir - faga M13 - hodowli E. coli( ) c) Po wsiąknięciu zawiesin, odwrócić płytki do góry dnem i inkubować w 37oC. d) Opisać rodzaje stref lizy na murawie bakteryjnej. 3. Test wrażliwości na infekcję fagiem (cross-streaking) a) Na szalkę z agarem odżywczym nanieść w postaci rysy, za pomocą ezy, zawiesinę faga vir i równomiernie ją rozprowadzić wzdłuż linii posiewu (Rys. 6). b) Równolegle w podobny sposób nanieść faga M13. 42 c) Po wsiąknięciu zawiesin fagowych nabrać na ezę hodowlę E. coli TG1 i jednym ruchem posiać ją rysą w poprzek posiewu faga vir. d) Ezę opalić, ponownie nabrać hodowli tego samego szczepu i posiać ją rysą w poprzek faga M13. d) W taki sam sposób posiać E. coli DH5 . e) Po wsiąknięciu hodowli w pożywkę inkubować płytki w 37oC. f) Ocenić wrażliwość obu szczepów na badane fagi. Rys. 6. Określanie wrażliwości bakterii na fagi (test cross-streaking). F1 i F2 – linie posiewu fagów; B1 i B2 – linie posiewu bakterii III. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA 1. Charakterystyka bakteriofagów. 2. Etapy infekcji fagowej w cyklu litycznym i lizogennym. 3. Wrażliwość szczepów bakterii na infekcję fagami. 4. Charakterystyka faga λ i faga M13. 5. Podstawowe techniki pracy z bakteriofagami i ich zastosowanie. 6. Łysinka fagowa. 43 III. ADDENDUM 1. Opis kolonii bakteryjnych 2. Komora Thomy Rys. 7. Komora Thomy. (A) Widok ogólny. (B) Duży „kwadrat”. (C) Mały „kwadrat”. Komora Thomy zawiera kwadratową siatkę, którą tworzą pionowe i poziome linie, wydzielające 16 dużych „kwadratów”. Każdy z nich składa się z 16 małych „kwadratów” o boku długości 1/20 mm. W rzeczywistości każdy mały „kwadrat” jest prostopadłościanem o powierzchni podstawy równej 1/400 mm2 i wysokości 0,1 mm, zatem jego objętość wynosi 1/4000 mm3. Znając średnią liczbę komórek badanego mikroorganizmu, określoną na podstawie ich liczby w 50 kolejnych prostopadłościanach, można określić zagęszczenie tego drobnoustroju w 1 ml zawiesiny. 44 IV. KRÓTKA CHARAKTERYSTYKA BAKTERII STOSOWANYCH NA ĆWICZENIACH (na podstawie „Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology”, wydanie II, tomy 2-5, 2001-2012, Springer) TYP FIRMICUTES Rodzaj Bacillus (łac. bacillum – laseczka/pałeczka) Laseczki gramdodatnie, poruszające się za pomocą rzęsek. Występują pojedynczo lub tworzą łańcuszki. Tlenowce lub warunkowe tlenowce. Chemoorganoheterotrofy – są wśród nich prototrofy i auksotrofy. Tworzą endospory. Ich pierwotnym siedliskiem jest gleba, ale dzięki endosporom można je izolować z najróżniejszych środowisk. Niektóre gatunki są patogenami, np. B. anthracis (laseczka wąglika). B. megaterium (laseczka olbrzymia) (gr. mega – wielki; gr. teras – potwór, bestia) Tworzy łańcuszki. Centralnie położone endospory nie powodują rozdęcia komórki macierzystej. Prototrof. Temp. optymalna 30oC. B. subtilis (laseczka sienna) (łac. subtilis – wysmukły, cienki) Tworzy łańcuszki. Centralnie położone endospory nie powodują rozdęcia komórki macierzystej. Prototrof. Temp. optymalna 37oC. Łatwo można wyizolować tę bakterię z siana. Rodzaj Clostridium (gr. kloster – wrzeciono; clostridium – małe wrzeciono) Laseczki gramdodatnie. Beztlenowce. Chemoorganoheterotrofy. Tworzą endospory owalne bądź okrągłe, często o średnicy większej od średnicy komórki macierzystej. Niektóre gatunki są chorobotwórcze, np. C. tetani (laseczka tężca), C. botulinum (laseczka jadu kiełbasianego). C. pasteurianum (łac. pasteurianum – należący do Pasteura) Prototrof zdolny do wiązania azotu cząsteczkowego. Gromadzi granulozę. Owalne endospory położone są subterminalnie i powodują rozdęcie komórki macierzystej. Temp. optymalna 3037oC. Występuje w glebie na całym świecie. Rodzaj Enterococcus (paciorkowce) (gr. enteron – jelito; gr. kokkos – pestka, ziarno, jagoda; Enterococcus – ziarniak jelitowy) E. faecalis (paciorkowiec kałowy, dawniej Streptococcus faecalis) (łac. faex – odchody; faecalis – kałowy) Gramdodatni, nieruchliwy ziarniak występujący w parach i krótkich łańcuszkach. Beztlenowiec aerotolerancyjny. Metabolizm fermentacyjny. Fermentuje węglowodany z wytworzeniem głównie kwasu mlekowego (bez gazu). Chemoorganotrof, auksotrof. Występuje w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt. Można go też znaleźć w glebie, na owadach i roślinach, a także w żywności (np. produkty mleczne, mięso). Zdolny do wzrostu w temp. 10o i 45oC, w obecności 6,5 % NaCl i pH 9,6. Patogen oportunistyczny 45 odpowiedzialny za wiele zakażeń szpitalnych, np. powoduje infekcje dróg moczowych, zakażenia ran pooperacyjnych. Rodzaj Staphylococcus (gronkowce) (gr. staphyle – winne grono; gr. kokkos – pestka, ziarno, jagoda) S. epidermidis (gronkowiec skórny, dawniej gronkowiec biały) (łac. epidermidis – skórny) Gramdodatni ziarniak występujący głównie w postaci dwoinek i tetrad (tworzy też grona). Nieruchliwy. Wytwarza biały barwnik. Warunkowy tlenowiec. Chemoorganoheterotrof, auksotrof. Wzrost w temp. 15o-45oC (temp. optymalna 30-37oC). Rośnie w podłożach zawierających do 7,5 % NaCl. Powszechnie występuje na skórze i błonach śluzowych zwierząt i ludzi. Może stać się patogenem oportunistycznym. TYP ACTINOBACTERIA Rodzaj Micrococcus (gr. micros – mały; gr. kokkos – pestka, ziarno, jagoda) M. luteus (pakietowiec żółty) (łac. luteus – złoto-żółty) Gramdodatni, nieruchliwy ziarniak, tworzący układy złożone z 4 komórek (pakiety), a także nieregularne skupiska pakietów. Tlenowiec, metabolizm ściśle oddechowy. Chemoorganoheterotrof, auksotrof. Temp. optymalna 25-37oC. Występuje na skórze ludzi i zwierząt, w glebie, wodzie, kurzu, mleku i jego przetworach. TYP PROTEOBACTERIA I Klasa Alphaproteobacteria Rodzaj Paracoccus (gr. para – podobny do; gr. kokkos – pestka, ziarno, jagoda) P. versutus (łac. versutus – zmienny) Gramujemna pałeczka. Warunkowy chemolitoautotrof zdolny do wzrostu autotroficznego na podłożu mineralnym z tiosiarczanem. Prototrof. Rośnie chemoorganotroficznie na pożywkach zawierających różne związki organiczne jako jedyne źródło węgla i energii. Warunkowy tlenowiec. Zdolny do denitryfikacji. Temp. optymalna 30oC. Występuje w glebie. II. Klasa Gammaproteobacteria Rodzina Enterobacteriaceae (pałeczki jelitowe) Gramujemne pałeczki. Chemoorganoheterotrofy. Warunkowe tlenowce. Rodzaj Escherichia (Teodor Escherich – mikrobiolog niemiecki, który wyizolował tę bakterię) 46 E. coli (pałeczka okrężnicy) (gr. colon – jelito grube/okrężnica; miejsce występowania tej bakterii) Pałeczka jelitowa. Warunkowy tlenowiec. Chemoorganoheterotrof. Prototrof. Temp. optymalna 37oC. Występuje w jelicie grubym człowieka i licznych zwierząt. Szeroko rozpowszechniona w środowisku życia człowieka. Najlepiej poznana bakteria pod względem fizjologicznym i genetycznym. Rodzaj Proteus (pałeczka odmieńca) (gr. Proteus – grecki bożek morski zdolny do przybierania różnorodnych kształtów) P. vulgaris (łac. vulgaris – pospolity) Urzęsiona pałeczka, bardzo ruchliwa. W czasie wzrostu na wilgotnych podłożach stałych komórki wielu szczepów podlegają cyklicznym przemianom. Formy osiadłe są krótkie (1-3 m długości) i mają nieliczne rzęski. Po osiągnięciu pewnego zagęszczenia przekształcają się one w formy długie (20-80 m długości), posiadające liczne rzęski. Formy długie migrują (ang. swarming), a następnie osiadają i tworzą formy krótkie. Takie powtarzające się cykle dają w rezultacie wzrost w postaci koncentrycznych pierścieni wokół pierwotnego punktu posiewu (wzrost „rozpełzliwy”). Bakteria odgrywa ważną rolę w rozkładzie materii organicznej. W organizmie człowieka jest na ogół komensalem, ale niekiedy staje się patogenem. Może powodować wtórne infekcje u ludzi dorosłych, zakażenia układu moczowego oraz biegunki i zatrucia u niemowląt. Rodzaj Serratia (Serafino Serrati – włoski fizyk) S. marcescens (pałeczka cudowna, pałeczka krwawa) (łac. marcescens – zwiędły, przekwitły) Prototrof. W temp. poniżej 30oC, w warunkach tlenowych, wiele szczepów wytwarza czerwony barwnik prodigiozynę. Występuje na roślinach, w glebie i wodzie, niekiedy jest komensalem człowieka. Może by patogenem oportunistycznym u ludzi hospitalizowanych. Inne rodziny: Rodzaj Pseudomonas (gr. pseudes – fałszywy, rzekomy; gr. monas – jednostka, monada) Gramujemne pałeczki poruszające się dzięki rzęskom. Tlenowce, niektóre wykorzystują azotany jako końcowe akceptory elektronów. Większość to chemoorganoheterotrofy, prototrofy. Niektóre gatunki są warunkowymi chemolitoautotrofami, zdolnymi do wykorzystania H2 lub CO jako źródła energii. P. fluorescens (pałeczka fluoryzująca) (łac. fluorescens – fluoryzująca) Chemoorganoheterotrof, prototrof. Zdolny do denitryfikacji. Temp. optymalna 25-30oC. Występuje w wodach i glebie. Może spowodować zanieczyszczenie żywności. P. stutzeri (łac. stutzeri – należący do Stutzera; Albert Stutzer – mikrobiolog niemiecki, który wyizolował tę bakterię) 47 Chemoorganoheterotrof, prototrof. Zdolny do denitryfikacji. Temp. optymalna 30-35oC. Występuje w wodach i glebie. Rodzaj Halothiobacillus (gr. hals – morze, sól; gr. thios – siarka; bacillum – pałeczka/laseczka) Gramujemne pałeczki. Tlenowce. Bezwzględne chemolitoautotrofy. Uzyskują energię z utleniania siarki i jej związków nieorganicznych. Niektóre szczepy są umiarkowanymi halofilami, wymagającymi NaCl (opt. stęż. 0,4-1,0 M). H. neapolitanus (łac. neapolitanus – neapolitański) Wyizolowany w 1902 r. z Zatoki Neapolitańskiej. Występuje w wodzie morskiej i na korodującym betonie. 48 V. SŁOWNICZEK POLSKO-ANGIELSKI (terminy mikrobiologiczne) l.m. – liczba mnoga l.p. – liczba pojedyncza agar odżywczy – nutrient agar barwienie – staining barwienie Grama – Gram staining barwienie proste –simple staining bulion odżywczy – nutrient broth czynnik wzrostowy – growth factor czysta kultura – pure culture endospora – endospore eza – loop faza zastoju (adaptacyjna) – lag phase gęstość optyczna – optical density głaszczka – spreader grupa coli – coliform hodowla – culture hodowla ciągła – continuous culture hodowla okresowa – batch culture hodowla synchroniczna – synchronized culture hodowla wzbogacająca – enrichment culture jednostka tworzaca kolonię (jtk) – colony forming unit (cfu) kolonia – colony komora Thomy – Thoma chamber kropla wisząca – hanging-drop metoda rozcieńczeń – spread plate metod metoda suchych rozcieńczeń (posiew redukcyjny) – streak plate laseczka – rod mureina – murein odporność – immunity oporność – resistance otoczka – capsule pałeczka – rod peptydoglikan – peptidoglycan pipeta – pipette płytka Petriego – Petri plate, Petri dish podłoże mikrobiologiczne – l.p. medium, l.m. media podłoże mineralne – mineral medium podłoże minimalne – minimal medium podłoże płynne – liquid medium podłoże półpłynne – semi-solid medium podłoże różnicujące – differential medium lub indicator medium podłoże selekcyjne – selective medium podłoże stałe – solid medium podłoże syntetyczne – synthetic medium lub defined medium podłoże wzbogacone – enriched medium 49 podłoże złożone – complex medium lub undefined medium posiew powierzchniowy – spread plate posiew redukcyjny (metoda suchych rozcieńczeń) – streak plate posiew wgłębny – pour plate method rozmaz – smear rzęska – l.p. flagellum, l.m. flagella skos – slant słupek – stab szczep – strain szczepić – inoculate szkiełko nakrywkowe – cover-slip (cover-glass) szkiełko podstawowe – slide (microscope slide) szkiełko z łezką – depression slide ściana komórkowa – cell wall utrwalanie – fixation ziarniak – l.p. coccus, l.m. cocci 50 VI. ZALECANA LITERATURA 1) Kunicki-Goldfinger W.J.H. „Życie bakterii”. PWN, 2001. 2) Madigan M.T., Martinko J.J., Parker J. „Brock biology of microorganisms”. Pearson Education, Inc. Upper Saddle River, 2003. (oraz wszystkie następne wydania tej książki) 3) Schlegel H.G. „Mikrobiologia ogólna”. PWN, 1996. 4) Salyers A.A, Whitt D.D. „Mikrobiologia – różnorodność, chorobotwórczość i środowisko”. PWN, 2003. 5) Baj J., Markiewicz Z. (red.) „Biologia molekularna bakterii”. PWN, 2006. 6) Różalski A. „Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej – skrypt dla studentów biologii”. Wyd. Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź, 1996. 7) Duszkiewicz-Reinhard W., Grzybowski R., Sobczak E. „Teoria i ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i technicznej”. Wyd. SGGW, Warszawa, 1996. 8) Grabińska-Łoniewska (red). „Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej”. Oficyna Wyd. Politechniki Warszawskiej, Warszawa, 1996. 51