grzybowy enteogen - pomiar grzyba

Transkrypt

Grzybowy enteogen
Pomiar grzyba
(The Mushroom Entheogen - The Measure of the Mushroom)
by
C.B. Gold
zaczerpnięte z PM&E Wolumin piąty (Psychedelic Monographs and Essays)
wersja ang. www.en.psilosophy.info/pxoaqoqvbojabxcdcpafblgb
original text: http://www.erowid.org/plants/mushrooms/mushrooms_article2.shtml
[ tłumaczenie: cjuchu ]
Spis Tresci:
Streszczenie
Testowanie subiektywne i obiektywne
Testowanie subiektywne
Testowanie obiektywne
Ogólna teoria i różne schematy wykrywania i mierzenia
Co jest w grzybie? Co mierzymy?
Test bibułowy p-DMAB
Teoria testu kolorymetrycznego referencyjnego
Inne potencjalne chromofory
Właściwa długość fali do pomiaru chromoforu DMAB
Światło przyspiesza reakcję testu
Określenie rozpuszczalnika ekstrakcyjnego
Waga próbki
Inne oddziaływania na test
Interpretacja testu DMAB
Test kolorymetryczny
Wyposażenie
Chemikalia dla testu kolorymetrycznego
Artykuły
Kolorymetry
Waga
Duże probówki borokrzemianowe
Dobrane kuwety
Uchwyt do probówki
Chemikalia
Plastikowy arkusz
Przygotowanie roztworów testowych
Wywoływacz koloru
Roztwór ekstrakcyjny z kwasu octowego
Para-dimetylobenzaldehydowy test kolorymetryczny
Zakończenie
Bibliograﬁa
soma rights re-served
1
od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/
www.psilosophy.info/pxoaqoqvbojabxcdcpafblgb
Streszczenie
Grzybowy Enteogen bada relacje między twardą chemią mikologiczną a doznaniami wizjonerskimi związanymi
z zastosowaniem psilocybiny. W PM & E wol.1 zaprezentowano optymalne techniki zbierania/przechowywania.
Przedstawiono badanie reakcji niebieszczenia ze sposobami powstrzymania jej początku. W PM & E wol. 2
zostały zaprezentowane związki między środkami obróbki wstępnej grzyba a różnymi formami odwadniania, ze
szczególnym uwzględnieniem optymalnej psychoaktywności. W PM & E wol. 4 podane są instrukcje do
skonstruowania próżniowego systemu odwadniania. Porównania HPTLC (high performance thin layer
chromatography) (wysokowydajna chromatografia cienkowarstwowa) odnotowano na próbkach.
Kontynuujemy tę serię ogólnym zarysem testowania mocy psilocybiny - zarówno w laboratorium jak i poprzez
medytację i psychologiczną/fizjologiczną obserwację. PM & E jest wyjątkowo dumne z możliwości
przedstawienia naszym czytelnikom tego odcinka Grzybowego Enteogenu. Dlaczego więc trzeba sprawdzić
moc grzybów psychedelicznych?
Istnieją dwa dobre powody: albo by sprawdzić wpływ jakichś metod eksperymentalnych na końcowe stężenie
aktywnych tryptamin (tj. psilocybiny i psylocyny) w grzybach (o czym praktycznie jest ten artykuł) lub co
ważniejsze, by poznać subiektywne natężenie dawki, którą planowałbyś przyjąć. Może pamiętasz anegdotę z
poprzedniego artykułu o moim przyjacielu, który przez pomyłkę przyjął zbyt dużą ilość proszku grzybowego.
Bardzo się zbliżył do konieczności jakiejś pomocy medycznej, ponieważ myślał, że traci rozum.
Żaden z nas nie miał pojęcia, że źle zmierzyliśmy dawkę grzybów i wziął on podwójną dawkę tego, co
normalnie byłoby dużą dawką. Ja zakończyłem z około połową dużej dawki. Ze mną było w porządku, lecz on
spanikował, a świadomość tego, że wziąłem, co myślałem, że było taką samą dawką, jeszcze to pogorszyła,
ponieważ moim zdaniem był całkowicie irracjonalny.
Ten krańcowy przykład przedawkowania jest prawdopodobnie rzadkością. To co bardziej powszechne i
frustrujące to niedodawkowanie. Jeśli jesteś taki jak ja, grzybowy trip jest wyjątkowym wydarzeniem, dla
którego muszę zaplanować czas. Przy obowiązkach rodzinnych i pracy nie mogę już, kiedy chcę, wziąć dnia
wolnego podczas weekendu. Zbyt dużo razy zaplanowałem dzień tripu jedynie by zakończyć z łagodnym
brzęczeniem i podwyższonym odczuwaniem, zamiast z odmienionym stanem przytomności i świadomości,
charakterystycznym dla pełnego tripu grzybowego. Potrzebowałem metody testującej grzyba. Wiedząc jakie
jest aktywne stężenie tryptamin przed przyjęciem grzybów można uniknąć potencjalnego problemu
przedawkowania lub niedodawkowania.
Jednym z celów moich badań, poza zmniejszeniem toksyczności grzybów, jest zmaksymalizowanie zawartości
psilocybiny w wyhodowanych grzybach oraz ustabilizowanie jej biosyntetyzowanej ilości z rzutu na rzut w
konkretnej odmianie Psilocybe cubensis, poprzez kontrolę czynników środowiskowych i odżywczych. We
2
własnych badaniach odkryłem, że gdy eksperymentalnie zmieniłem te wpływające na wzrost czynniki,
konkretne stężenia w odmianie, zmierzone metodą testową opisaną pod koniec tego artykułu, wzrosły o
współczynnik cztery lub pięć.
W swych badaniach, Bigwood i Beung zgadzają się z tym wahaniem w stężeniu psilocybiny w kontrolowanej
uprawie Psilocybe cubensis. Ale ze względu na ich duże zróżnicowanie w tym, co uważali za ściśle
kontrolowane środowisko wzrostu, jestem skłonny stwierdzić, że nie nadzorowali wszystkich możliwych
czynników, wpływających na wzrost i biosyntezę psilocybiny. Stwierdzili, że w ich własnej hodowli, stężenia
różniły się o współczynnik cztery, a co gorsza okazy z innych źródeł różniły się aż dziesięć razy4.
Nadchodzący artykuł, stosujący wyniki testowania próbki grzyba ukaże w jaki sposób, poprzez staranną
kontrolę żywieniowych i środowiskowych czynników wzrostu grzyba, można zminimalizować te duże wahania,
z rzutu na rzut, stężenia tryptaminy (głównego ugrupowania molekularnego w psilocybinie/psylocynie i innych
spokrewnionych związkach).
Jeśli zbierzesz próbki ze środowiska naturalnego, wahania z próbki na próbkę będą bardziej pogorszone ze
względu na jeszcze mniejszą kontrolę środowiska i związków odżywczych. Poza różnicami w odmianach (tj.
różnicami genetycznymi), mikrośrodowiskowe i odżywkowe różnice podłoża do wzrostu przyczyniają się do
dużych wahań między okazami, nawet zgromadzonymi blisko siebie. Christiansen et al., odkryli w swych
badaniach stężenia psilocybiny w wielu różnych próbkach Psilocybe semilanceata w Norwegii, że zawartość
różniła się o czynnik nieco wyższy niż dziesięć7.
Jeśli między grzybami tego samego gatunku istnieje dziesięciokrotna różnica, wyobraź sobie wahania między
odmiennymi psychedelicznymi rodzajami. Grzyby, które zawierają halucynogenne tryptaminy obejmują
następujące rodzaje: Conocybe, Panaeolus, Psilocybe, oraz Stropharia12. Jeśli zbierasz któryś z tych rodzajów
do celów psychedelicznych, możesz chcieć przetestować ich względną moc nim je przyjmiesz. Jeśli planujesz
przyjąć grzyby na świeżo, wówczas przy odrobinie doświadczenia w jednym z testów polowych opisanych
później będziesz w stanie oszacować ich względne stężenie. Można to stwierdzić nie tylko z końcowej
intensywności koloru reakcji lecz również z szybkości z jaką próbka nabiera koloru.
Ostatnia uwaga odnośnie potrzeby testu: jeśli jesteś osobą, której zdarzy się kupić grzyby psychodeliczne,
chciałbyś się dowiedzieć co dostajesz za pieniądze. Najlepiej, jeśli byłyby legalne w sprzedaży, wtedy grzybowy
handlarz powinien znać względną moc różnych partii swych grzybów i powinien sprzedawać suszone grzyby
nie wagowo lecz pod względem ilości potrzebnej na umiarkowany trip.
Spis Tresci
Testowanie subiektywne i obiektywne
"Okej", mówisz, "Więc może warto byłoby przetestować grzyby, które kupuję lub uprawiam, lecz nie jestem
chemikiem i chcę czegoś prostego." Istnieją dwa proste typy testowania: subiektywne i obiektywne.
Subiektywne testowanie grzybów jest opisowe. Jest łatwe i tanie i wymaga jedynie skupienia uwagi na
własnym umyśle, ale zajmuje dużo czasu.
Z drugiej strony, testowanie obiektywne, jest ilościowe. Jest proste, zazwyczaj szybkie, powtarzalne, lecz w
niektórych procedurach może wymagać złożonego i drogiego sprzętu. Mimo że określiłem dwie formy
testowania, trzeba znać skuteczność psychedeliku nieznanej partii grzybów lub zakomunikować komuś
innemu, jaka będzie nasza partia grzybów.
Problemem z testowaniem subiektywnym jest znormalizowanie metody. Ze względu na kaprysy umysłu, trzeba
kontrolować nastawienie i otoczenie (set&setting), w których przeprowadza się test subiektywny. Poprzez
kontrolę tych dwóch czynników, choć bardzo trudną, można ustalić wspólną reakcję (np. poziom energii, ilość
halucynacji, ich kolory i kształty, łatwość odczuwania jedności z obiektami zewnętrznymi lub pojęciami, itd.) na
znormalizowaną dawkę. Reakcja ta może być wskaźnikiem, którego używa się do porównania wszystkich
innych testów subiektywnych. Ta subiektywna reakcja na znormalizowaną dawkę pomoże dowiedzieć się, ile
będzie można wziąć później.
3
Problemem z testowaniem obiektywnym jest to, że nie ważne jaką wartość stężenia (zazwyczaj wyrażanego w
mg psilocybiny/gr. grzyba) ustali się ostatecznie w teście, nie wskaże ona jakie będzie doznanie subiektywne.
By dowiedzieć się, jakie będzie doznanie subiektywne, nadal trzeba wziąć psychedelik. Zrobiwszy to
kilkukrotnie dla różnych poziomów stężenia, z nieznanej wartości testu obiektywnego można wywnioskować
subiektywną wartość intensywności, obywając się tym samym bez potrzeby testowania subiektywnego.
Zaletą posiadania wartości stężenia z testu obiektywnego jest to, że może powiedzieć jakie będzie osobiste
doznanie temu, kto poświęci czas by subiektywnie porównać kilka partii grzybów po znalezieniu wartości
stężenia testu obiektywnego dla każdej partii. Przez porównanie swych doświadczeń z kilkoma
odpowiadającymi wartościami liczbowymi, można z nowej obiektywnej wartości testu wywnioskować
intensywność osobistego doświadczenia podczas przyjmowania nieznanej partii grzybów.
Efekty subiektywne mogą znacznie się różnić w zależności od osoby, lecz wraz ze wzrostem wartości testu
obiektywnego zmieni się liniowo intensywność i czas trwania.
Testy subiektywne trzeba zrobić tylko kilka razy (i odnotować dla przyszłych porównań), gdy porównuje się
różne poziomy stężeń grzybowej mocy, po których, do ocenienia nowych próbek grzybów, można polegać
wyłącznie na teście obiektywnym. Natomiast jeśli ktoś decyduje się stosować wyłącznie test subiektywny,
wówczas będzie potrzebował sprawdzać każdą partię poprzez faktyczne wzięcie małej, standaryzowanej dawki.
Następnie z tej żmudnej oceny można określić ilość potrzebną do jakiegokolwiek poziomu tripowania, jaki chce
się później osiągnąć.
Poza problemem pobrania przykładowej dawki z dokładnie każdej partii grzybów, test subiektywny zawiera
kolejną komplikację gdy jest stosowany osobno. Jego wyniki mogą być trudne do zakomunikowania komuś
innemu, ponieważ wyjątkowe doznanie może różnić się radykalnie pomiędzy poszczególnymi osobami. Na
przykład, ktoś może opisać reakcję na trip po pięciu gramach grzybów jako dający poczucie silnej energii
seksualnej z przejmującą świadomością fizycznego ja.
Zważywszy na to, że możesz wziąć dokładnie ten sam proszek grzybowy, a nawet oczekiwać i może liczyć na
podobną reakcję, doświadczysz jedynie bardzo introspekcyjnego tripu, w którym ostatnią rzeczą przychodzącą
na myśl jest seks. Wartość z testu obiektywnego pozwala zakomunikować intensywność tripu grzybowego bez
opisywania wywołanego doznania. Same testowanie subiektywne jest problemowe, lecz uzupełnione
obiektywnym testowaniem ilościowym może stać się dla nas przewidującym narzędziem. Również samo
testowanie obiektywne nie dostarcza nam żadnego realnego znaczenia o subiektywnej naturze tripu. Ponieważ
test obiektywny nie zdradza nam żadnej ważnej osobiście informacji, można wywnioskować, że założeniem
każdego testu ilościowego jest nasze własne testowanie subiektywne.
Przy własnym testowaniu subiektywnym wykorzystałem następujące procedury i wskazówki. Zastosuj swe
własne wskazówki, lecz główną zasadą jest obserwowanie efektów psychedeliku na ciało i umysł. Przed
określeniem zmian spowodowanych przez psychedelik dobrze jest poznać swój umysł. Najlepszym sposobem
na zrozumienie własnego umysłu jest regularne praktykowanie jakiejś formy medytacji umysłowej, w której
nacisk kładziony jest na świadomość uważności w coraz spokojniejszym umyśle.
Spis Tresci
Testowanie subiektywne
1. Można spierać się na temat wpływu nastawienia i otoczenia na doznanie psychedeliczne, ale bez
względu na wynik dyskusji, przy coraz większych dawkach psychedelików ma się zwykle więcej efektów
fizycznych, dłuższy czas trwania i głębokość tripu. Zaobserwuj różnice w długości i głębokości tripu przy
różnych ilościach grzybów, najlepiej z tej samej mieszanki proszku grzybowego (właściwie
przechowywanego tak, by przerwa między testami nie spowodowała degradacji jakości grzybów).
2. Podczas tripu obserwuj swój umysł z niewielkimi lub bez żadnych doznań zmysłowych. Najlepiej to
zrobić zamykając oczy lub będąc w zupełnej ciemności, zatkaj uszy lub znajdź całkowicie ciche otoczenie
i połóż się lub usiądź całkowicie nieruchomo. Po takim kilkuminutowym siedzeniu lub leżeniu, zwróć
uwagę na intensywność kolorów w myślach lub wyprojektowanych w ciemności. Zaobserwuj ostrość
4
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
krawędzi i form. Czy natura form jest łagodna czy złowroga? Czy doznajesz sennych halucynacji czy
wzorów? Czy twój umysł jest czysty, czy senny lub śpiący?
Zaobserwuj naturę swoich postrzeżeń przy otwartych oczach w dobrze oświetlonym otoczeniu. Zwróć
uwagę na efekt falowania wokół przedmiotów. Czy masz kolorowe wzory lub halucynacje rzutowane na
otoczenie. Jest to pewna wskazówka, że wziąłeś silną dawkę.
Posłuchaj dźwięków lub muzyki i poczuj ich wpływ na twoje emocje, a także zaobserwuj jak zmieniają je
halucynacje lub wzory.
Zaobserwuj charakter swej świadomości. Czy jesteś pochmurny, śpiący, ponury, uparty, komunikatywny,
uważny? Zwróć uwagę na wszystkie fizyczne efekty uboczne, takie jak nudności, bóle głowy, bóle
mięśni, skurcze żołądka, zbolałe stawy i inne niekomfortowe objawy. Wiele dolegliwości i bólów może
być rezultatem objawów psychosomatycznych podczas tripu psychedelicznego. Jednak często również
zanieczyszczenia w grzybach mogą zapoczątkować efekty uboczne. Wszystkie powyższe rzeczy są
wskazówkami jakości tripu a w konsekwencji jakości grzybów. Generalnie, ponieważ moją uprawę i
metody przechowywania doprowadziłem do perfekcji, powyższe objawy fizyczne zmalały.
Zaobserwuj jak reagujesz fizycznie. Jaka jest twoja koordynacja, jaka zdolność chodzenia i mówienia?
Zauważyłem, że funkcje lewej półkuli mózgu - związane zazwyczaj z konkretnymi, analitycznymi
procesami myślenia - stają się trudniejsze do przeprowadzenia wraz z rosnącymi dawkami
psychedelików. Czy możesz przeprowadzić proste zadania matematyczne? Czy masz kłopoty w
wyrażaniu pomysłów za pomocą mowy? Czy możesz udzielić wskazówek jak trafić do znajomego
miejsca?
Jak szybko wszedł trip? Jak długi jest "natłok"? Ile minęło przed rozpoczęciem schodzenia
psychedelicznej części tripu? Uważam, że efekty dragu trwają nie dłużej jak sześć do ośmiu godzin, lecz
jak zwiększyłem dawkę lub moc grzybów, trip nadszedł szybciej, natłok trwał nieco dłużej a
psychedeliczna część rosła stopniowo od zaledwie 30 minut aż do pięciu lub sześciu godzin. Przez
ponowne ocenienie swego tripu w miarę postępu, stosując pewne kryteria oceny, jak opisano w
powyższych punktach, możesz dokładnie zaobserwować przebieg tripu i przewidzieć jego długość oraz
intensywność.
Przy ustalaniu subiektywnego punktu odniesienia dla twych tripów, ważne by znormalizować
nastawienie i otoczenie (set and setting) swego tripu, tak by zminimalizować skutki takich zmiennych na
trip. Spróbuj badać go w tym samym otoczeniu, najlepiej o tej samej porze dnia. Nie badaj tripu
klasyfikacyjnego jeśli jesteś w negatywnym nastroju. Mój przyjaciel poleca jogging, lub inne ćwiczenia
aerobikowe, pomagające uwznioślić i ustabilizować nastrój. Grzyby podczas oceniania najlepiej przyjąć
na pusty żołądek, ponieważ różne pokarmy wpłyną na naturę tripu. Pokarm w żołądku spowolni również
wchłanianie psilocybiny i sprawi wrażenie, że wzięło się mniej. Jeśli korelujesz informację o stężeniu z
testu obiektywnego z intensywnościami subiektywnymi, upewnij się, że zawsze stosujesz tę samą ilość
grzybów. Przekonałem się, że do testu wystarczył jeden gram. Zazwyczaj nie wystarczyło to by wysłać
mnie na pełnoobjawowy trip, lecz wystarczyło by zaobserwować wszystkie psychedeliczne przejawy,
zwłaszcza jeśli zamknąłem oczy i wetknąłem słuchawki i ćwiczyłem techniki medytacyjne, które znam.
Określiwszy subiektywnie swe próbki grzybowe jesteś na dobrej drodze do zaplanowania enteogenicznego, lub
ekstatycznego tripu, ponieważ wiesz ile wziąć na pożądane doznanie. Nacisk tych artykułów celowo jest
ograniczony na wykorzystanie grzybów do bardziej introwertycznych i duchowo rozwijających doznań
psychedelicznych. To prawda, że wiele przygotowań, technik uprawy a nawet pewnych sugestii na kierowanie
energii doznania (późniejszy artykuł) może stosować się do tripów, które skupiają się na relacjach
międzyludzkich, a nawet dla tych, którzy chcą jedynie zabawy na popołudnie, lecz dla tych nieenteogenicznych
doświadczeń nie będziesz musiał tak ciężko pracować. Moja przeszłość z psychedelikami, a przede wszystkim z
"magicznymi grzybami", pokazała mi, że najwyższej jakości doznanie grzybowe i stany świadomości
przychodzą z trudem i planowaniem między tripami a także z olbrzymim przypływem tęsknoty podczas
aktualnego tripu.
Zmiana w świadomości wymaga najwidoczniej wysiłku i czasu. Im intensywniejsza koncentracja wysiłku i
pragnienia takiej zmiany, tym szybsza jest zmiana w świadomości. Następna część może być zbędna dla twych
potrzeb jeśli nie skłaniasz się ku tej obiektywnej ocenie swych grzybów. Lecz nawet jeśli zdecydowałeś nie
robić żadnych testów chemicznych grzybów, omówienie to może pomóc ci zrozumieć znaczenie wartości, które
opiszę w nadchodzących artykułach o środowiskowych i odżywieniowych wpływach na wzrost i produkcję
psychedelicznej tryptaminy w Psilocybe cubensis. Więc zachęcam do przeczytania przynajmniej ogólnej teorii i
5
interpretacji wyników testu. Dla tych, którzy chcą wykonać swe własne oceny chemiczne, faktyczna procedura
testowa znajduje się pod koniec artykułu.
Testowanie obiektywne
Ogólna teoria i różne schematy wykrywania i mierzenia
Wyniki testu obiektywnego mogą dać wartość liczbową mówiącą ile, a w przypadku niektórych testów, co, jest
w grzybie. Można znaleźć wartość względnego stężenia lub wartość stężenia absolutnego. Jeśli ma się dostęp
do czystych tryptamin psychedelicznych wówczas można wywieść stężenie absolutne przez zmierzenie
dokładnie odważonych ilości czystej próbki a następnie porównanie tego wyniku z wartością otrzymaną z
próbki nieznanej. Jeśli nie ma się czystej próbki to nie ma znaczenia, ponieważ wyniki testu liczbowego
wskażą, że jedna próbka posiada więcej mierzonej tryptaminy niż inna, oraz w jakim stopniu ma większe
stężenie.
Te liczbowe lub obiektywne wyniki testu bardzo pomagają przekazać względną moc różnych partii grzybów
temu, kto może mieć odmienną interpretację subiektywną niż ty. Każdy pojedynczy związek chemiczny
zachowuje się inaczej od pozostałych związków, ze względu na swą unikalną strukturę. Na podstawie
unikalności każdego związku, możliwe są testy obiektywne. Jeden z rodzajów testowania obiektywnego opiera
się na unikalnym pochłanianiu określonych długości fal światła pochłanianego przez każdy związek chemiczny.
Innymi słowy, każde chemikalium posiada inny kolor, choć "kolor" zazwyczaj nie znajduje się w spektrum
widzialnym. Kolejnym aspektem każdego związku chemicznego stosowanego często w opracowywaniu
procedury testowej jest to, że będzie on oddziaływał lub reagował z innymi związkami zupełnie inaczej.
Rycina 1 - ukazuje pochodne indolu-tryptaminy. Podobieństwa między związkami naturalnie występującymi w ciele a
związkami halucynogennymi dają efekt psychedeliczny.
6
Testy mogą być rozwijane, co także oparte jest na podobieństwie różnych związków przy zrozumieniu, że
powiązana część cząsteczki będzie reagować podobnie. Na przykład, w grzybach enteogennych istnieje kilka
aktywnych składników cząsteczkowych, lecz najważniejszy składnik obejmuje ogólną rodzinę cząsteczek
zwanych tryptaminami. Wszystkie te tryptaminy mają w swym układzie cząsteczkowym wspólny pierścień
indolowy. Testy zostały opracowane by pokazać, czy ten pierścień indolowy (jako część większej cząsteczki
tryptaminowej) obecny jest w roztworze i w jakim stopniu.
Kilka rodzajów testów dostępnych naukowcom obejmuje spektrofotometrię, kolorymetrię oraz chromatografię.
Spektrofotometria mierzy stopień do jakiego badana cząsteczka pochłania światło o określonych długościach
fal. Lecz ponieważ większość cząsteczek organicznych najlepiej pochłania w paśmie podczerwonym lub
ultrafioletowym a przyrządy te są drogie dla przeciętnego hobbysty, nie zająłem się tymi technikami.
Chromatografia jest techniką, która oddziela mieszaniny związków poprzez przepuszczenie mieszaniny w
roztworze przez specjalnie przygotowane podłoże (sorbent) z wysokorafinowanego piasku, zwanego "żel
krzemionkowy" ("silica gel"). Żel krzemionkowy jest najpowszechniej stosowanym sorbentem, lecz można
zastosować inne, mniej powszechne sorbenty. Mieszanina różnych cząsteczek różnie oddziałuje z cząsteczkami
na powierzchni żelu krzemionkowego podczas przechodzenia, zmniejszając tym samym ich ruch w większym
lub mniejszym stopniu.
Po przemieszczeniu się przez żel krzemionkowy na pewną odległość, mieszanina związków rozdziela się na
oddzielne pasma czystych związków. Chromatografia obejmuje ogólnie dwie metody, w zależności od
przyrządu stosowanego z żelem krzemionkowym do oddzielenia próbki - chromatografia cienkowarstwowa
(TLC - thin layer chromatography), oraz chromatografia kolumnowa, z której kolejną techniką tej podgrupy,
powszechnie stosowaną w laboratoriach jest wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC - high
pressure liquid chromatography).
Jak nazwa wskazuje, w TLC, cienka warstwa żelu krzemionkowego nakładana jest na szklaną lub plastikową
płytkę po czym przy spodzie płytki nasmuża się lub nakrapia próbkę. Płytka jest następnie wkładana do
szklanego pojemnika, do którego zostaje wlana niewielka ilość określonej mieszanki rozpuszczalnika,
ustalonego eksperymentalnie. Żel krzemionkowy, będąc porowatym, pozwala działaniu kapilarnemu
podciągnąć rozpuszczalnik, co również wciąga próbkę. W miarę poruszania się próbki, każdy czysty związek
chemiczny w mieszaninie porusza się w różnym stopniu powodując tym samym rozdzielenie na smugi
cząsteczek czystego składnika mieszaniny próbki. Różne techniki umożliwiają uwidocznienie każdego z
czystych pasm chemicznych.
7
Rycina 2 - ukazuje odwzorowanie procesu TLC (Chromatografia cienkowarstwowa). Ta metoda analizy wzrokowej
pozwala na porównanie ze sobą związków chemicznych obecnych w grzybie.
Dla danego sorbentu lub rozpuszczalnika, konkretny związek (np. tryptamina psychedeliczna) zawsze
przemieści się w górę płytki TLC o tę samą względną odległość w porównaniu do odległości, na jaką wespnie
się na płytce rozpuszczalnik. Na przykład pewnego razu, badacz pozwolił rozpuszczalnikowi na płytce TLC
powstawać przez godzinę a rozpuszczalnik przemieścił się wzwyż o 10 cm. Po zastosowaniu chemicznego
barwnika albo lampy UV do wykrycia chromatograficznych plamek, stwierdził, że plamka, którą był najbardziej
zainteresowany przemieściła się wzwyż płytki o 5 cm lub o połowę drogi między punktem startu a frontem
rozpuszczalnika. Kolejnym razem, pozostawił płytkę jedynie na 45 minut a rozpuszczalnik przesunął się jedynie
8 cm. Ponieważ wiedział, że Rf (skrót odnoszący się do względnej odległości przemieszczenia czystego związku
wzwyż płytki TLC) wynosi 0,5, więc w tych samych warunkach dla tego samego związku, obszar
zainteresowania przesunie się o połowę drogi wzwyż płytki lub o 4 cm. I tak było w praktyce.
Dla większości związków, literatura doświadczalna będzie zazwyczaj posiadać wartości tej względnej
odległości, które zazwyczaj są mniejsze niż 1,0 (Rf wynoszące 1,0 wskazuje, że związek pokonał z
rozpuszczalnikiem całą drogę wzdłuż płytki; dlatego jego względna odległość, porównana do odległości, którą
pokonał rozpuszczalnik wyniesie 1,0). Po separacji TLC łatwo zauważyć, czy określony związek jest obecny
poprzez odszukanie pasma, które występuje na właściwej odległości wzwyż płytki. Intensywność koloru pasma
wskaże stężenie związku, lub można tak naprawdę zeskrobać pasmo z płytki i pomierzyć niemal czysty związek
jakimiś innymi dostępnymi technikami.
HPLC (lub wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa) jest formą chromatografii kolumnowej. Próbka jest
nakładana na wierzch kolumny z sorbentem mającej wysokie ciśnienie, następnie poprzez kolumnę
pompowany jest rozpuszczalnik pod wysokim ciśnieniem (zazwyczaj 1000 psi lub większym). Na drugim końcu
kolumny spektrofotometr monitoruje rozpuszczalnik na rzecz absorpcji wskazującej wychodzenie z kolumny
związku organicznego. Eksperymentator może odczytać wynik z fotometru widmowego na wykresie
wyjściowym lub na ekranie video.
Obszary pod szczytami, które reprezentują każdą odrębną cząsteczkę są proporcjonalne do stężenia. Mając
próbki czystych tryptamin, można obliczyć całkowite stężenie badanych związków. Rozpuszczalnik HPLC jest
pompowany przez kolumnę dopóki większość próbki nie zostanie wymyta. Zamiast odległości pokonywanej
poprzez żel krzemionkowy, tak jak w TLC, do określenia cząsteczki, stosowany jest czas potrzebny do wymycia
związku z kolumny nim zostanie wykryty przez spektrofotometr.
Jeśli poczytasz literaturę techniczną zauważysz, że często wspomina się o HPLC. Jego przewagą jest o wiele
większa czułość i zdolność do przeanalizowania o wiele większej ilości związków, które mogą być obecne w
nieznanej próbce. Jego wadą jest koszt. Przeciętny zestaw HPLC może kosztować 10.000$. Podczas gdy do
wykonania TLC, prawie wszystko, czego potrzeba, można kupić za około 100$ do 200$.
Co prowadzi nas do ostatniej powszechnej techniki wykrywania, a wybranej do większości mych badań kolorymetrii. Kolorymetria jest podobna do spektrofotometrii pod tym względem, że roztwór próbki pochłania
światło o określonej długości fal a długość fali i stopień pochłaniania może wiele powiedzieć o próbce. Lecz w
kolorymetrii, światło absorbowane i wynikający kolor mierzony roztworu leży w spektrum widzialnym. Także,
ponieważ punkty szczytowe absorpcji pokrywają znacznie szerszy zakres długości fal niż tylko regiony
ultrafioletowe (UV) lub podczerwone (IR), stosowany spektrofotometr może być o wiele mniej czuły i może
wykorzystywać zgrubniejsze metody rozszczepiania spektrum światła do naświetlenia próbki. Przyrząd
stosowany w kolorymetrii nie nazywa się "spektrofotometr", lecz "kolorymetr", i może wykorzystywać filtry,
zamiast o wiele droższego monochromatoru z siatką dyfrakcyjną, stosowanego w spektrofotometrach.
Sztuczką w kolorymetrii jest wyraźne pokolorowanie próbkowanej cząsteczki, która normalnie nie pochłania
spektrum widzialnego (tj. 400 do 700 nanometrów, co jest długością fali światła od najgłębszych czerwieni do
najsłabszych fioletów). Chemicy odkryli, że istnieją cząsteczki, które same w sobie są bezbarwne lecz
połączone z niektórymi innymi cząsteczkami tworzą kolor. Związki te nazywają się "chromoforami", obecność
koloru wskazuje, że testowana cząsteczka obecna jest w roztworze a intensywność koloru mówi ile znajduje się
w nim związku chemicznego.
8
Problemem przy kolorymetrii jest to, że większość chromoforów nie łączy się konkretnie z unikalną cząsteczką
lecz z częścią cząsteczki poddanej testowi. Na przykład, w teście, który stosowałem w moich badaniach,
chromofor reagował z pierścieniem indolowym tryptamin psychedelicznych, tworząc kolor niebieski lub
fioletowawy. Pierścienie indolowe nie są specyficzne dla tryptamin psychedelicznych. Istnieje wiele cząsteczek
innych niż tryptaminy psychedeliczne, które posiadają pierścienie indolowe.
I by dalej pokomplikować sprawy, chromofor zareaguje z innymi skupiskami zawierającymi azot, choć bez
zwyczajowego zabarwienia niebieskiego lub purpurowego. Wynik netto może być mieszaniną koloru, który w
mniejszym lub większym stopniu pokrywa się z konkretną długością fali, lub kolorem, który postrzega
kolorymetr. Kolorymetr jest niemy; nie zna różnicy między wchłanianiem przy 570 nanometrach, które
powodowane jest przez mocz albo psilocybinę albo przez oba po trochu. Ogólnie, nieaktywne związki posiadają
absorbancje wystarczająco oddalone w widmie świetlnym, tak że nie kolidują z odczytami tryptaminy
psychedelicznej, lecz nie zawsze tak jest. W późniejszej części omówię tę interferencję i jak to się ma do
interpretacji wyników testu.
Teoria spektrofotometryczna mówi nam, że mierzona absorbancja związku jest bezpośrednio związana z jego
stężeniem w roztworze. Innymi słowy, gdy wzrasta absorbancja tak i stężenie. Jeśli przetestujemy jednego
grzyba pod kątem aktywnych tryptamin i stwierdzimy, że ma absorbancję 0,6 a następnie przetestujemy
kolejnego i stwierdzimy, że ma absorbancję 0,9, możemy powiedzieć, że ten drugi posiada większe stężenie
tryptamin niż ten pierwszy. Pewnie, że nie znamy całkowitego stężenia w mg/gram psilocybiny/psylocyny, ale
co tam? W naszym własnym doznaniu subiektywnym spokojnie możemy odnosić się do A 0,6 jak do 2 mg/gram.
Spis Tresci
Co jest w grzybie? Co mierzymy?
Ze względu na możliwość wystąpienia niejasności w wynikach testu przez wielorakie reakcje barwne
chromoforu, wskazanym może być przejrzenie literatury w celu zobaczenia jakie składniki Psilocybe cubensis
inni stwierdzili w swych badaniach. Niektóre z tych innych związków naturalnych zareagują z testem i nadłożą
wartość testu chociaż nie są tryptaminami aktywnymi. A pozostałe są tryptaminami aktywnymi, które ze
względu na swą nieco odmienną aktywność psychologiczną mogą znacznie zmodyfikować trip na lepsze lub na
gorsze. Także musimy się dowiedzieć czym one są.
Jeśli chodzi o aktywne tryptaminy w grzybie, dwoma o największym stężeniu w Psilocybe cubensis są
oczywiście psilocybina i psylocyna 13 str. 109 . "Pochodne tryptaminy" nazywane są tak ze względu na ich
podobieństwo do serotoniny. Klasa ta posiada grupę INDOLOWĄ oraz grupę DIMETYLAMINOWĄ. Pochodne
tryptaminy obejmują substancję przekaźnika mózgu, serotoninę, niezbędny aminokwas, tryptofan, szybko
działający lecz krótko trwający psychedelik, DMT, i oczywiście psylocynę i psilocybinę. "Tryptaminy aktywne"
odnoszą się do różnych tryptamin psychedelicznych, wliczając psilocybinę, psylocynę oraz wszystkie ich
analogi. Zobacz przykłady różnych tryptamin na rysunku 1.
Repke wskazuje, że jakiekolwiek wykrycie psylocyny w próbkach grzyba, może być w rzeczywistości
spowodowane hydrolitycznym oddzieleniem grupy fosfatowej od cząsteczki psilocybiny podczas obchodzenia
się z próbką i przy jej przygotowywaniu14. W rzeczywistości, z łatwością mogą powstać inne analogi poprzez
różne układy enzymów i przez obecność tlenu. Próbowałem zwrócić na to uwagę w pierwszym artykule gdzie
podkreśliłem ważność niskiej temperatury przy suszeniu próżniowym podczas przygotowywania grzybów do
przechowywania lub ostrożności wymaganej przy przygotowywaniu grzybów do spożycia, gdyż to te analogi i
produkty rozpadu powodują najprawdopodobniej bóle głowy, zachmurzenie mentalne oraz obolałość, nie
będące normalnymi efektami ubocznymi psilocybiny syntetycznej.
Większość wzmianek w literaturze, które czytałem stwierdzało, że w grzybach było mało psylocyny. Mogli nie
być w stanie znaleźć żadnej psylocyny przez psilocybinę, ponieważ jest to artefakt lub być może ze względu na
łatwość, z jaką psylocyna się utlenia. Jednak w pracy Bigwooda i Beuga stwierdzono, że po drugim płukaniu
poziomy psylocyny są znacząco wysokie. W rzeczywistości, wahają się od około dziesięciu do trzydziestu
procent całkowitego stężenia (psilocybiny i psylocyny w tej pracy) aktywnych tryptamin4.
9
Baeocystyna, będąca kolejnym psychedelicznym analogiem psilocybiny i psylocyny, odgrywa najwyraźniej
ważną rolę w naturalnej biosyntezie psylocyny i psilocybiny w grzybach, i obecna jest w małych, lecz istotnych
ilościach w Psilocybe cubensis. W oparciu o różne próbki, badane w przytaczanej literaturze, zakres waha się
od 0,001% do 0,02% baeocystyny w suchej próbce grzyba. Repke i inni stwierdzili, że baeocystyna nigdy nie
była znajdowana w grzybach, które nie zawierały już także psilocybiny. Wyjaśniając to w odpowiedniej
perspektywie, psilocybina składa się zazwyczaj na jeden procent suchej masy grzyba. (W obecności odczynnika
Ehrlich'a, który podobny jest do odczynnika testowego, który opisuję pod koniec tego artykułu, baeocystyna
tworzy reakcję kolorystyczną od różowego poprzez fioletowy do niebieskiego.)14
Badacze Beung i Bigwood stwierdzili dzięki swej pracy z TLC, że mogą wyizolować na płytce żelu
krzemionkowego 12 odrębnych miejsc (tj. różnych związków). Poza psilocybiną, psylocyną i baeocystyną, ich
wstępny wniosek mówi, że inne miejsca reprezentują N-metylowe i tryptaminowe analogi psylocyny i
psilocybiny 3 . Kolejną tryptaminą znalezioną w grzybach jest tryptofan 9 . Zareaguje on z odczynnikami
testowymi w podobnym kolorze, co psylocyna i wskutek tego przyda niewielką ilość absorbancji każdemu
wynikowi testu, dając nieco błędnie podwyższony odczyt.
Test, który wykorzystywałem do określenia ilości psilocybiny i psylocyny w grzybach Psilocybe cubensis
reaguje z innymi związkami zawierającymi azot, choć najbardziej wyczulony jest na związki zawierające indol,
gdy odczytywany jest przy zalecanych długościach fali10. Jednym z takich związków zawierających azot, obficie
występującym w grzybach jest powszechny aminokwas, glicyna. 18 . Kolejnym stwierdzonym w grzybie
związkiem na bazie azotu jest mocznik. Zmiana testu na kolor żółty wskazuje obecność jednego z tych
wszechobecnych związków. Na szczęście, żółty przydaje jedynie niewielką ilość absorbancji do wartości
tryptamin aktywnych gdy odczytywany jest przy 570 nm, testowej długości fali3.
Casale wspomina w przeglądzie literatury, że w metanolowych wyciągach z grzybów psilocybe znalezione
także zostały, poza wspomnianymi już związkami, ergosterol, nadtlenek ergosterolu oraz a,a-trehaloza5. Nie
mogłem znaleźć żadnej innej wzmianki w literaturze o innych analogach tryptaminy, toksynach, enzymach lub
hormonach, które mogą być obecne w Psilocybe cubensis i wpływać tym samym na doznanie subiektywne.
Agurell, Blomkvist i Catalfomo1 określili dość długą listę możliwych metabolitów tryptofanu, które mogą
występować w grzybach psilocybe: 6-hydroksytryptofan; kinurenina; tryptofan; kwas kinureninowy; kwas
ksanturenowy; psylocyna; tryptamina; metylotryptamina; dimetylotryptamina; kwas 3-hydroksyantranilowy;
kwas antranilowy; N-acetylotryptofan; oraz kwas indolooctowy. Agurell i Nilsson2 zademonstrowali w swej
pracy wstępny szlak biosyntetyczny psilocybiny dla jakiego w grzybach mogą również występować dowolne ze
związków pośrednich. Szlak syntetyczny postępuje od tryptofanu poprzez tryptaminę, N-metylotryptaminę,
N,N-dimetylotryptaminę, psylocynę do psilocybiny.
W tym samym lub w innym czasie w Psilocybe cubensis można znaleźć jakiekolwiek i chyba wszystkie
prekursory psilocybiny. Niektóre mogą być przyczepione do białek lub enzymów, które mogą je związać dla
jakiejkolwiek reakcji chemicznej lub asymilacji w ciele. Konsekwencją obecności wszystkich tych nieaktywnych
tryptamin lub związków zawierających azot, które reagują z odczynnikiem testowym jest sztuczne
podwyższenie absorbancji lub pozornej koncentracji. Przy testowaniu, zmiana w absorbancji zupełnie nie
koniecznie oznacza zmianę w stężeniu aktywnej tryptaminy (tj. psilocybiny/psylocyny). W niektórych szybkich i
łatwych testach na zakres, lub nie usposobionych technicznie.
Prosty test opisany w High Times na określenie czy nie nabyło się przypadkowo grzybów zaprawianych LSD to
rozgnieść grzyba w jakimś metanolu i dać mu poleżeć przez noc. Następnego dnia przelać metanol i potrzymać
ekstrakt pod światło UV. Jeśli płyn świeci na niebiesko, wówczas masz grzyby zawierające LSD, które z tego,
co wiem, nie istnieją17 str. 252. Norland opisuje kilka testów kolorymetrycznych, które można zastosować do
zidentyfikowania grzybów, które zawierają pochodne tryptaminy13 str. 116. Możesz stwierdzić, że są bardziej
użyteczne niż dłuższa i bardziej skomplikowana procedura testowa, opisana pod koniec tego artykułu. Nie
potrzebujesz kolorymetru dla wyników testu i jeśli potrafisz przeżyć ze wzrokowym porównaniem koloru i swą
pamięcią, możesz przynajmniej oszacować różnice stężeń między grzybowymi rzutami.
1. Prostym testem na związki zawierające indol i tryptaminy jest pokruszenie małego kawałka grzyba do 15
gram wódki lub alkoholu etylowego (dobry jest "spirytus denaturowany" lub rozcieńczalnik ze sklepu z
art. metalowymi) i wymieszanie. Dodanie 3-4 kropli kwasu chlorowodorowego (lub rodzaju ze sklepu z
art. metalowymi o nazwie "kwas solny"), następnie wkroplenie sosnowego płynu po goleniu zmieni, przy
10
obecności indoli, kolor na "fioletowo różowo czerwony" (ang. "cheny red").
2. Kolejny test na indole stosuje mały pokruszony kawałek grzyba w 15 g albo metanolu albo etanolu (lub
wódki). Jeśli zainteresowany jesteś testem na psilocybinę zastosuj metanol; jeśli psylocynę zastosuj
etanol lub wódkę. Różnica w rozpuszczalności między tymi dwiema aktywnymi tryptaminami odpowiada
różnicy w zastosowanych rozpuszczalnikach. Dobrze wymieszaj, następnie przefiltruj. Pozwól przez noc
odparować lub zastosuj łaźnię parową lub suszarkę do włosów w celu osuszenia. Umieść pozostałość na
bibule filtracyjnej i pozwól wyschnąć. Napryskaj lub nakropl poniższy wywoływacz. Aby test zadziałał
skutecznie, wywoływacz musi być przygotowany na świeżo. By przygotować wywoływacz, dodaj jedną
kroplę 37% formaldehydu do 15 kropli stężonego kwasu siarkowego. Psylocyna powinna zmienić kolor
na zielony do czarnego podczas gdy psilocybina na żółty do zielonożółtego; zielony jest normalnie.
Pomarańczowo-brązowy wskazuje amfetaminy lub LSD.
3. Odczynnik Ehrlich'a to nazwa mieszanki stosowanej do wykrywania związków indolowych, które zostały
wyodrębnione na płytce TLC. Po napryskaniu testowanego roztworu na płytkę, w miejscu gdzie leży taki
indolopodobny związek formują się kolorowe plamki. Odczynnik zrobiony jest z 5%
dimetyloaminobenzaldehydu (w skrócie DMAB) w stężonym kwasie chlorowodorowym (HCl)9. Kolejną
odmianą odczynnika Ehrlich'a jest 2% DMAB w HCl-etanolu (1:1). Odczynnik ten nadał następujące
zmiany koloru: psilocybina zmieniła kolor na czerwonawo-fioletowy następnie wyblakła do fioletowego
podczas gdy psylocyna dała mocny kolor niebieski, który wyblakł do fioletu18.
4. Jeśli zainteresowany jesteś wykonaniem testowej procedury TLC, zapoznaj się z różnymi układami
rozpuszczalników u Leunga, Smitha i Paula, które można zastosować do wyodrębnienia składników
grzyba. Będziesz mógł również wykorzystać informacje o oczekiwanych względnych odległościach
(wartościach Rf), które pokona psylocyna i psilocybina wzwyż płytki dla każdego układu
rozpuszczalnika. Informacja ta, plus odczynnik testowy w rodzaju Ehrlich'a, pomoże ustalić, czy w
testowanych grzybach obecna jest psilocybina, psylocyna czy obie9.
Przekonałem się, że przy moim stosowaniu TLC najlepiej działał system rozpuszczalnika, którego używali w
swych badaniach Beung i Bigwood. Okazało się, że mogli oni otrzymać największą rozdzielczość większości
plamek dzięki zastosowaniu dla krzemowych płytek żelowych rozpuszczalnikowej mieszanki n-butanolu +
kwasu octowego + kwaśnej wody (12:3:5)3. Gdy stosowałem ten rozpuszczalnik przekonałem się, że jego
proporcje dobrze się mieszają. W innej literaturze proponuje się mieszanki rozpuszczalników, które po
wstrząśnięciu nie są jednorodne, lecz zamiast tego szybko separują się w dwie warstwy, czyniąc te mieszanki
rozpuszczalników trudnymi do zastosowania w TLC.
W mych własnych separacjach, do wykrywania stosowałem światło UV oraz fluorescencyjną wersję płytek TLC.
Nie miałem dostępu do rozpylacza mgiełkowego, który jest wymagany przy stosowaniu odczynnika Ehrlich'a.
Mogłem odróżnić jedynie sześć plamek, w przeciwieństwie do dwunastu, które stwierdzili Beung i Bigwood gdy
stosowali oba schematy detekcji (tj. odczynnik Ehrlich'a i lampę UV). W kolejnej procedurze testowej
przygotowałem papierek wskaźnikowy, który może wykryć obecność związków indolowych, poprzez
zastosowanie p-DMAB (para-dimetoksybenzaldehydu) jako odczynnika detekcji lub chromoforu. Chociaż
papierek nie jest czuły na niskie poziomy indoli, stwierdziłem, że jest użyteczny do szybkich kontroli
ekstraktów grzybowych na obecność psilocybiny/psylocyny.
Spis Tresci
Test bibułowy p-DMAB
1. Dodaj 1,0 gram p-DMAB do 28 ml etanolu (denaturowanego). Mieszaj aż się rozpuści.
2. Do powyższej mieszanki dodaj wodę aż osiągniesz całkowitą objętość 60 ml.
3. Namocz w tym roztworze trochę bibuły filtracyjnej i pozwól całkowicie wyschnąć. By przyspieszyć
suszenie można wykorzystać suszarkę do włosów, lecz nie stosuj zbyt gorącego powietrza. Gorąco
zniszczy p-DMAB i w konsekwencji przydatność papierka wskaźnikowego. Papierek przechowuj w
szczelnym słoiku w lodówce.
4. W celu zastosowania papierka dodaj na niego kroplę wyekstrahowanej próbki i pozwól wyschnąć.
Potrzymaj papierek wskaźnikowy nad wlotem butelki stężonego kwasu chlorowodorowego. Opary
szybko wywołają kolor fioletowawy/niebieski. Jeśli opary nie wywołają koloru, spróbuj dodać na papierek
11
w pobliżu miejsca z próbką, kroplę kwasu chlorowodorowego. W miarę wnikania kwasu
chlorowodorowego w papierek wskaźnikowy i zbliżania się do próbki, wytworzy się kolor fioletowy lub
niebieski jeśli próbka jest pozytywna pod względem związków indolowych.
Teoria testu kolorymetrycznego referencyjnego
W poprzednich ustępach nakreśliłem generalne parametry testowania kolorymetrycznego a w ostatnim ustępie
wymieniłem procedury dla kilku testów, które są łatwe do zorganizowania i odczytu. Test, który wybrałem do
zmierzenia zawartości aktywnych tryptamin w różnych próbkach eksperymentalnych z ostatnich czterech lat
oparty jest na reakcji kolorystycznej z paradimetyloaminobenzaldehydem (p-DMAB). DMAB jest powszechnym
składnikiem odczynnikowym w kilku innych testach wspomnianych powyżej, wliczając test Ehrlich'a.
W celu ponownego przeglądu ogólnego testu kolorymetrycznego, indolowa część tryptamin reaguje z DMAB w
roztworze sprzyjającym doprowadzeniu reakcji do końca, wytwarzając tym samym kompleks barwny, który
może zostać zwizualizowany lub odczytany kolorymetrem lub spektrofotometrem. Intensywność koloru (tj.
absorbancja) jest proporcjonalna do stężenia zawartości tryptamin w roztworze. W literaturze, zastosowanie
tego testu jest powszechne w nieco innych formatach. Test, który opracowałem do mierzenia związków
indolopodobnych, psilocybiny i psylocyny, był początkowo stosowany w nieco zmodyfikowanej formie do
mierzenia alkaloidów sporyszu16. Kwas lizergowy i winian ergotaminy są pochodnymi sporyszu - oba są
prekursorami LSD i innych farmaceutyków i mogą być testowane za pomocą DMAB.
Poza bardziej czułymi lecz bardziej złożonymi procedurami testowymi HPLC (wysokociśnieniowa
chromatografia cieczowa), różni badacze stosowali różne środki do ilościowego określenia psilocybiny i
psylocyny. Leung i Paul stosowali ilościową metodę TLC (chromatografia cienkowarstwowa), w której
najmniejsza ilość chemicznie czystej psilocybiny powodującej reakcję z odczynnikiem Ehrlich'a (5% roztworem
p-DMAB w kwasie chlorowodorowym) była porównywana z najmniejszą ilością próbki testowej z
ekstraktowanej tkanki grzyba, potrzebną do wywołania zmiany koloru. Zakłada się, że w obu przypadkach
stężenie psilocybiny jest równe, a następnie, znając ilość wyekstrahowanego grzyba, wylicza się procentowe
stężenie psilocybiny w grzybie11.
Inne potencjalne chromofory
Test nie musi być ograniczony do DMAB jako chromoforu. Chociaż w następującej procedurze testowej i w
całej literaturze technicznej, jako środek wywołujący kolor stosowany był para-dimetyloaminobenzaldehyd,
wykorzystany może być kolejny związek chemiczny, paradimetyloaminoaldehyd cynamonowy. Ten konkretnie
środek wywołujący dostarczy o wiele bardziej intensywnego koloru niż DMAB i wskutek tego będzie bardziej
czuły.
Ta dodatkowa czułość może być konieczna jeśli stosujesz bardziej prymitywny kolorymetr z szerokim filtrem
pasmowym (tj. więcej niż 30 NM). Zamiast akceptowalnego odczytu długości fali 570 nm stosowanego dla
testu DMAB, powinieneś zastosować 625 nm dla para-dimetyloamino aldehydu cynamonowego15. Lecz przy
większości zastosowań ta zwiększona czułość spowoduje powstanie zbyt ciemnego koloru reakcji, dlatego
będzie ciężka do odczytania na skali kolorymetru.
Jeszcze jednym odczynnikiem stosowanym podobnie do DMAB (odczynnik Erlich'a) jest odczynnik Pauley'a.
Odczynnik ten wykorzystuje diazotowy kwas sulfanilowy. Jest on bardziej szczegółowy niż DMAB w tym, że nie
reaguje z psilocybiną lub mocznikiem, lecz tylko z psylocyną, dając głębszy kolor czerwono pomarańczowy18.
(Nie mam szczegółów w jakiej długości fali mierzyć kolor tej reakcji.)
Właściwa długość fali do pomiaru chromoforu DMAB
Kilku badaczy stosowało DMAB w swym teście kolorymetrycznym i generalnie długość fali, jaką zwykle
odczytywali dla związków zawierających indol wynosiła 570 nm. Spektrofotometryczny szczyt zarówno
psilocybiny jak i psylocyny po zareagowaniu z DMAB jest wystarczająco szeroki, że można zastosować inną
długość fali bliską 570 nm bez wpływania na czułość testu. Może być to ważne jeśli stosuje się kolorymetr
12
filtrowy a dostępne filtry nie obejmują konkretnej długości fali 570 nm.
Na rysunku 3 przedstawiłem wykres absorbancji spektralnej na pozytywny test DMAB dla jakiegoś proszku
grzybowego. Odczyty transmitancji przyjąłem co każde 10 nm, od 400 nm do 610 nm a następnie
przekonwertowałem wartości transmitancji na absorbancję, którą później wykreśliłem. Najlepsza długość fali
do odczytu testu kolorymetrycznego leży zazwyczaj na jednym ze szczytów absorbancji. Jak widać, bazując na
tym kryterium, test można odczytać na więcej niż jednej długości fali. Kolejne możliwe maksimum absorbancji
prócz orientacyjnego szczytu 580 nm jest na szczycie 550 nm. Istnieje prawdopodobieństwo, że te dwa szczyty
reprezentują psylocynę i psilocybinę. Duży szczyt w okolicy 410 nm może być drugim szczytem dla psilocybiny,
który jest zazwyczaj widoczny jako fioletowy - kombinacja czerwonego i niebieskiego.
Analizując wykres pamiętaj, że przedstawia on absorbancję spektralną a nie transmitancję. Dlatego dla koloru
niebieskiego, szczytu absorbancji można szukać w obszarze czerwonym spektrum (tj. w pobliżu 600 nm).
Rycina 3 - ukazuje spektrum p-DMAB testowych reakcji. Test ten uwzględnia reakcje kolorowe, które przedstawiają ilości
konkretnych związków chemicznych przy porównaniu.
Światło przyspiesza reakcję testu
Zarys zasady testu, który tu prezentuję, odkryłem w pracy Agurella, Blomkvista i Catalfomo1. W pracy tej
zasugerowali wykorzystanie światła UV, które przyśpieszy reakcję z chromoforem DMAB. Krok ten zastąpiłem
dając reakcji rozwijać się w świetle fluorescencyjnym przez dłuższy okres czasu. Nawet po tym, reakcja
kontynuuje rozwój przez 24 godziny po zapoczątkowaniu. Badacze wspomnieli również o stworzeniu krzywej
kalibracyjnej, która może okazać się przydatna. Lecz badacze ci nie tylko ekstrahowali psilocybinę lecz przed
przetestowaniem próbek oczyszczali ją także do pewnego stopnia. Poprzez wnioskowanie z tej krzywej i
poprzez oczyszczenie swego ekstraktu grzybowego możesz być w stanie uzyskać "przybliżone" absolutne
stężenie w mg/gram grzyba. Jeśli jesteś zainteresowany, sprawdź odnośnik po więcej szczegółów o
oczyszczaniu. (Przyszły artykuł przedstawi procedurę oczyszczania).
13
Reakcja DMAB wymaga przynajmniej trzydziestu minut by osiągnąć plateau wywołania koloru w świetle
fluorescencyjnym. Zobacz rysunek 4, który to pokazuje. Ponieważ reakcja faktycznie trwa aż do 24 godzin,
będzie trzeba dokładnie zmierzyć czas wywoływania a następnie znormalizować go dla wszystkich testów. Ja
stosuję 30 minut, ponieważ w tym czasie zaszły największe zmiany koloru i wolę nie czekać zbyt długo na
wyniki. Kolejnym dobrym powodem dla stosowania krótszego czasu wywoływania jest to, że jeśli psylocyna i
inne spokrewnione tryptaminy, które są obecne, pozostają w roztworze podczas wywoływania testu, stopniowo
się rozkładają, zmieniając tym samym wartość stężenia aktywnych tryptamin.
Rycina 4 - ukazuje skalę czasu absorpcji otaczającą test kolorymetryczny.
Spis Tresci
Określenie rozpuszczalnika ekstrakcyjnego
Badacze, Agurell, et al. testowali wyekstraktowaną i trochę oczyszczoną psilocybinę. Nie robili testu na
psylocynę. By uniknąć nużącego i długiego przygotowywania próbki, chciałem wyekstraktować, następnie
odczytać próbkę grzybową bez oczyszczania. Najlepiej, to chciałem wykorzystać wodny roztwór by uniknąć
rozpuszczalników organicznych i by podczas tego samego testu przetestować zarówno psilocybinę jak i
psylocynę. Lecz w wodzie psylocyna trudno się rozpuszcza, a psilocybina jest w niej łatwo rozpuszczalna.
Ponieważ psylocyna jest szczególnie niestabilna w roztworze zasadowym, uważałem, że jako rozpuszczalnik
najlepszy byłby kwaśny roztwór wodny19. Wiele testów TLC potwierdziło, że roztwór kwas octowy-woda, na
który się ostatecznie zdecydowałem, w rzeczywistości, ekstraktuje zarówno psilocybinę jak i psylocynę.
By dokładniej wyodrębnić psylocynę i psilocybinę a także, by obniżyć pH, tak by aktywne tryptaminy były
14
stabilniejsze, stosuję roztwór ekstrakcyjny kwasu octowego-wody. Bez kwasu octowego roztwór szybko
zareaguje z tlenem atmosferycznym w obecności enzymów endogennych wytwarzając mocno niebieski produkt
i niszcząc w tym procesie część psilocybiny/psylocyny. Sam kolor niebieski zaingeruje również w wyniki testu,
gdyż reakcja nadaje tryptaminom kolor niebieski lub fioletowy. Konkretnie, psylocyna nada kolor
ciemnobrązowo niebieski a psilocybina żółtozielony i fioletowy. Natomiast LSD zareaguje z DMAB tworząc
kolor niebiesko fioletowy17.
Najwyraźniej inni również stwierdzili, że rozcieńczony roztwór kwasu octowego jest doskonałym
rozpuszczalnikiem dla zarówno psylocyny jak i psilocybiny. Roztwór nie tylko kompletnie ekstraktuje obie
tryptaminy lecz także w mniejszym stopniu wyodrębnia inne substancje zakłócające. Casale zauważa również,
że jeśli roztwór ekstrakcji rozcieńczonego kwasu octowego podgrzeje się do 70°C przez dziesięć minut,
wówczas psilocybina całkowicie przekształci się w psylocynę poprzez defosforylację5.
Przekonałem się na własną rękę, że rozgrzanie roztworu kwasu octowego wyeliminowało jakąkolwiek reakcję
niebieszczenia w enzymowo denaturowanym środowisku roztworu ekstrakcji o niskim pH. To że psilocybina
jest przekształcana w psylocynę również jest plusem. Oznacza to, że reakcja kolorystyczna utworzy czystszy
kolor i dlatego będzie łatwiejsza do zinterpretowania w wynikach testu.
Oprócz zmierzenia koloru wywołanego odczynnika gdy się nieco ustabilizuje, ważne jest również zmierzenie
próbki ekstrakcji grzybowej tak szybko, jak się da. Rozcieńczony kwas octowy spowalnia rozpad
psylocynopodobnych tryptamin lecz nie zatrzymuje całkowicie tego rozpadu. Im dłużej czekasz by wykonać test
na swej próbce, tym niższa będzie wartość. Uważam, że rozpad ten wynosi po 20 godzinach średnio 10%. Co
ciekawe, im większe stężenie aktywnych tryptamin, jak zmierzono na świeżej próbce, tym większy wpływ czasu
na zmniejszenie pozornego stężenia.
Waga próbki
Do wagi próbki 0,5 grama sproszkowanych grzybów doszedłem poprzez przeprowadzenie testu na czterech
masach próbki: 0,2 grama, 0,5 grama, 1,0 gram oraz 1,5 grama. Przy objętości ekstrakcji 20 mililitrów,
najlepiej sprawdza się próbka 0,5 grama. Większe próbki grzybów mają tendencję do unoszenia się na
powierzchni roztworu ekstrakcyjnego w dużej kolbie testowej i muszą być stale mieszane, tak by proszek
pozostawał w roztworze ekstrakcyjnym. Mniejsze ilości proszku grzybowego coraz trudniej dokładnie i
precyzyjnie odważyć. Mniejsze próbki dają również mniej koloru w wywołanej reakcji sprawiając, że trudniej je
odczytać spektrofotometrem.
Inne oddziaływania na test
Interesujący, lecz niewyjaśniony wpływ na kolor testu pochodzi od nieznacznej, lecz najwyraźniej znaczącej,
zmiany w mej procedurze standardowej. Jeśli przy przygotowaniu materiału grzybowego z jakiegoś powodu
zastosowałem rozpuszczalniki i grzybów tych nie wyekstrahowałem, ale potem całkowicie odparowałem
rozpuszczalnik pozostawiając początkowy proszek grzybowy pozornie niezmieniony, kolor testu przesunął się
do koloru bardziej różowego i w związku z tym zmienił absorbancję z 570 nm. Tę zmianę koloru zauważyłem
przede wszystkim gdy stosowałem metanol. Być może metanol reaguje z czymś w grzybie i produkt ten z kolei
reaguje z DMAB. Chodzi o to, że z wynikami testu nie mogą być porównane inne wyniki testu, dla którego
zmodyfikowało się procedury testowe. Zdrowy rozsądek może podpowiadać, że konkretna modyfikacja może
nie mieć znaczenia, lecz w rzeczywistości, modyfikacja ta może drastycznie zmienić wyniki.
Bardziej radykalny przykład próby porównania jabłek z pomarańczami miał miejsce podczas testu
kolorymetrycznego dla psilocybiny/psylocyny gdy próbowałem wstępnie oczyścić próbkę proszku grzybowego
przy pomocy ekstrakcji. Moje ekstrakcje były próbami oczyszczenia proszku grzybowego z nieaktywnych
tryptamin. Test kolorymetryczny miał czystszy kolor lecz ponieważ usunięte zostały inne substancje chemiczne,
które również reagują z DMAB, całkowita absorbancja spadła, dając natychmiastowe wrażenie, że w próbce
proszku grzybowego istnieje nie tyle psilocybiny/psylocyny, ile faktycznie istnieje.
15
Interpretacja testu DMAB
Test DMAB reaguje nie tylko z psylocyną/psilocybiną. Test kolorymetryczny DMAB nie jest testem doskonałym.
Wyniki liczbowe mogą być nieco mylące gdy stosowane są do oznaczania stężenia psilocybiny/psylocyny,
dwóch najpowszechniejszych psilocybinowych analogów w Psilocybe cubensis. W powyższym rozdziale "co jest
w grzybie i co mierzymy?", pokazałem, że test nie jest właściwy tylko dla tych dwóch tryptamin. Test reaguje z
indolami zawierającymi azot, w których tryptaminy są większą cząsteczką zawierającą grupę indolową. Test
jest najbardziej wyczulony na związki zawierające indole, lecz może też reagować z innymi indolami poza
tryptaminą.
DMAB reaguje tworząc różne kolory z innymi związkami zawierającymi indol lub innymi reaktywnymi
cząsteczkami zawierającymi azot. Na przykład, psylocyna zazwyczaj jest niebieska a psilocybina jest fioletowa
lub fioletowo zielona. A tryptofan, który chemicznie jest podobny do obu daje kolor ciemno niebieski, który jest
wystarczająco od nich odmienny by był trudny w użyciu jako standardowy, jak miałem nadzieję.
Dowody, jakie można uzyskać z różnych reakcji kolorystycznych dla różnych związków indolowych mogą
pomóc oszacować wyniki testu. Odnotuj mieszankę kolorów po wywołaniu testu. Zarejestruj różne kolory. Jak
czyste są kolory? Im czystszy kolor tym większa czystość tryptamin obecnych w grzybie. W mej własnej pracy z
TLC niezmiennie dostrzegałem cztery odrębne pasma reagujące z DMAB:
Strefa
Rf
Kolor z DMAB
1
0,137
ciemny fiolet
2
0,275
czysty fiolet
3
0,550
szaro niebieski
4
0,965 różowo pomarańczowy
Każda z powyższych "stref" przedstawia różne związki chemiczne w grzybach, które testowałem.
Wiedząc, że test DMAB reaguje z innymi związkami indolowymi poza psylocyną/psilocybiną, można
wywnioskować, że wyniki liczbowe testu reprezentują zsumowaną absorbancję (tj. stężenia) różnych tryptamin
lub innych związków reaktywnych obecnych w grzybie, nie tylko absorbancję psilocybiny i psylocyny.
Należy mieć na uwadze, że test DMAB może prowadzić do niejednoznacznych wyników przy próbie wyciągania
wniosków o środowiskowych lub odżywczych oddziaływaniach na biosyntezę psilocybiny/psylocyny. To, co
może mieć miejsce, to zmiana różnych tryptamin grzyba w mieszance wraz z rosnącym lub malejącym lub
statycznym wynikiem testu. Ostatecznym potwierdzeniem byłby test subiektywny, ponieważ zmiana w stężeniu
tryptamin zmieni naturę tripu psychedelicznego.
Wyniki testu można omyłkowo zinterpretować na inne sposoby. Oprócz dodatkowej absorbancji, gdyż DMAB
reaguje z innymi związkami przy ekstrakcji grzybowej, poza tymi, którymi jesteśmy najbardziej zainteresowani,
DMAB może być wykorzystywany jako substrat przez ogólną klasę enzymatyczną oksydaz fenolowych, które
powszechnie występują w różnych gatunkach grzybów i mogą w ten sposób sztucznie zredukować absorbancję
testu. Poprzez zredukowanie stężenia DMAB, enzymy te wpływają na fałszywe zaniżenie wartości dla
tryptamin. Jest to kolejny powód, dla którego stosuję niskie pH roztworu ekstrakcyjnego (tj. kwas octowy w
wodzie) i podgrzewam mieszankę ekstrakcyjną. Oba te detale proceduralne powinny zredukować
prawdopodobieństwo utraty DMAB przez aktywność enzymatyczną8, str.108.
Jak zauważono w artykule o zbieraniu i przechowywaniu, niektóre jony zainterferują z wywoływaczem koloru
DMAB. Jak pokazuje moje doświadczenie, reakcję hamują w szczególności jony wodorosiarczanu.
Wodorosiarczan sodowy może być alternatywą dla witaminy, C przy przechowywaniu grzybów, jako
przeciwutleniacz i inhibitor enzymatyczny.
Ilościowe określenie udziału niepsilocybinowych/psylocynowych czynników, które reagują z DMAB. Gdy
rozpocząłem subiektywne badanie wpływu czynników odżywczych na wzrost mojej odmiany Psilocybe
16
cubensis, zauważyłem, że wzrost absorbancji testu DMAB, który odnosi się do zwiększenia stężenia, nie wydaje
się proporcjonalny do dużego wzrostu subiektywnych skutków proszku grzybowego. Mały pozorny wzrost w
stężeniu (wartości absorbancji) testu DMAB podwoił subiektywne efekty grzybów. Moje najwcześniejsze
wartości stężenia dla przetestowanych grzybów wynosiły 0,6 A (jednostki absorbancji). Gdy subiektywnie
przetestowałem grzyby, które wzrosły do 0,8 A, byłem zaskoczony tripem, który zdawał się dwukrotnie
silniejszy.
Po rozważnym przemyśleniu, wywnioskowałem, że wstępna wartość stężenia składała się z dwóch lub więcej
składowych barwnych, które zwiększają całkowitą wartość, i że aktywne tryptaminy, które umożliwiają trip
były stosunkowo małym procentem całościowego natężenia koloru.
Aby otrzymać dowody potwierdzające lub przeczące tej hipotezie, zastosowałem proces chromatografii
bibułowej by rozdzielić przy pomocy testu DMAB trzy różne próbki proszku grzybowego, mierzące średnio 0,60
A, 0,80 A, 0,85 A. Po rozdzieleniu ekstraktów grzybowych, wyciąłem strefę, która korespondowała z
psilocybiną, stosując znaną dla niej wartość Rf dla chromatografii bibułowej i 2% roztwór DMAB w etanolu i
kwasie chlorowodorowym (1:1) by ostatecznie zidentyfikować szerokość strefy poprzez jej barwną reakcję. Po
wycięciu strefy psilocybiny, ekstrahowałem ją przez całą noc w 5% skrystalizowanym kwasie octowym w
temperaturze pokojowej. Powtórnie przetestowałem tę ekstrakcję i porównałem wyniki z ekstrakcją i testem
reszty pociętej bibuły chromatogramu, zawierającej inne czynniki ekstrakcji grzybowej.
Po skorygowaniu różnic w objętościach próbki naniesiono na bibułę i pomimo słabego oddzielenia,
osiągniętego na bibule w porównaniu z żelem krzemowym TLC, wyniki wyraźnie wykazały, że inne nieznane,
lecz reagujące z DMAB, czynniki w grzybie, zwiększyły swe stężenie przy rosnącej absorbancji w tempie
wolniejszym niż psilocybina. Innymi słowy, stężenie psilocybiny wzrosło ze wzrostem absorbancji, co wynika z
teorii kolorymetrycznej, lecz gdy absorbancja wzrastała, stężenie psilocybiny wniosło większy odsetek do
całkowitej intensywności koloru różnych składników, które reagują z DMAB. Pozostaje to w bezpośredniej
sprzeczności z teorią kolorymetryczną, która twierdzi, że stężenie roztworu o absorbancji 1,0 jest
dwukrotnością roztworu o absorbancji 0,5. Lecz teoria kolorymetryczna jest dla roztworu z jedną absorbującą
cząsteczką a jak uprzednio stwierdzono, w grzybie może być aż dwanaście różnych składników reagujących z
DMAB, każdy zwiększający stężenie w różnym stopniu, poprzez stymulację zmianami odżywczymi i
środowiskowymi.
Więc w miejscu tym można jedynie stwierdzić, że wraz ze wzrostem absorbancji testu, wzrasta stężenie
aktywnych tryptamin - lecz wciąż nie wiemy o ile. Aby spróbować odpowiedzieć na to pytanie, pod koniec mych
czteroletnich badań, zestawiłem diagram bazujący na mych doświadczeniach subiektywnych siły tripu
porównanych z absorbancją testu DMAB. Mój rejestr pokazuje, że miałem przynajmniej kilka tripów o kilku
różnych poziomach stężeń: przy absorbancji 0,5 do 0,6; przy absorbancji 0,7 do 0,9; przy absorbancji 0,9 do
1,1 i przy absorbancji większej niż 1,1. Wykorzystując jako odniesienie, intensywność, czas trwania oraz
doznania zjawiskowe z doświadczenia przy absorbancji 0,5, porównałem każde plateau z poprzednim a
następnie przekształciłem wzrost na jednostki doznania bazowego odniesienia. Wiem na przykład, z mych
zapisków z doświadczeń, że drugie plateau (0,75 A) odczułem dwa razy silniej niż pierwsze (0,5 A) a trzeci
poziom jest 1,5 razy silniejszy niż drugi, i tak dalej. Wyniki te pokazuje diagram (Rycina 5).
Rycina 5 - ukazuje moc psychedelicznego transu porównaną z testami kolorymetrycznymi.
17
Jest kilka punktów, które możemy zebrać z wykresu:
1. Wzrost w aktywnych tryptaminach jest w rzeczywistości liniowy dla tego zakresu i tej odmiany Psilocybe
cubensis. Najwidoczniej dla każdego wzrostu w testowej wartości grzyba od 0,2 do 0,3 A, intensywność
doznania wzrasta o równowartość doznania grzybowego 0,5 A.
2. Omówiony wcześniej eksperyment ekstrakcji chromatografią bibułową uzyskał wartość absorbancji
czynników innych niż psilocybina w wysokości 0,35 A dla proszku grzybowego 0,6 A. Test był
nieprzekonujący w tej kwestii, ponieważ chromatografia bibułowa jest przybliżoną procedurą
separacyjną, lecz sugeruje, że wartość absorbancji dla czynników innych niż psilocybina wzrasta jedynie
nieznacznie wraz ze wzrostem absorbancji. Co ciekawe, jeśli ekstrapoluje się wykres doznania
subiektywnego do punktu "0" doświadczenia, otrzymana absorbancja odpowiada punktowi, po którym
zaczyna się doświadczać psilocybiny. Ta ekstrapolowana absorbancja wynosi w przybliżeniu 0,3 A, co
wspiera wyniki chromatografii bibułowej, które ukazały, że pierwsze 0,3 A wartości testowej grzyba jest
kolorem od nieaktywnych tryptamin i innych związków reagujących z DMAB. Wartość ta oznacza
również, że wszystkie próbki mają przynajmniej 0,3 A nieaktywnych, lecz reagujących z DMAB śmieci w
grzybie. Oczywiście niektóre z aktywnych tryptamin, mogące intensyfikować trip, mogą też nie
koniecznie być przyjemnym dodatkiem do tripu.
3. Choć moja praca nad zwiększeniem stężenia aktywnych tryptamin poprzez manipulację środowiskową i
odżywkową była udana, mój drugi cel zredukowania stężenia śmieci w grzybie nie był szczególnie
udany. Najwyraźniej, poziom substancji nieaktywnych, lecz reagujących z DMAB, pozostał taki sam.
Niemożliwe bym bez bardziej rozległych badań, stosujących HPLC dowiedział się, czy w miarę wzrostu
stężenia, w proszku grzybowym zmienia się mieszanka i względne stężenie różnych aktywnych
tryptamin, takich jak psilocybina, psylocyna, baeocystyna oraz ich analogów.
Podsumowując zatem, czytając nadchodzący/e artykuł(y) o czynnikach wzrostu Psilocybe cubensis, pamiętaj, że
w miarę wzrostu wartości testowych zwiększa się także intensywność doznania subiektywnego. Lecz, wzrost
wartości obiektywnej testu nie może być stosowany do przewidzenia procentowego odpowiednika, wzrostu
doznania subiektywnego. W rzeczywistości, moje doświadczenie pokazało, że skromny wzrost absorbancji
testowej zwiększył subiektywną ilość aktywnych tryptamin dwa lub nawet trzy razy.
Spis Tresci
Test kolorymetryczny
WYPOSAŻENIE I MATERIAŁY
(Pozycje oznaczone * posiadają dodatkowe uwagi i objaśnienia pod listą wyposażenia i materiałów.)
Wyposażenie
Kolorymetr / spektrofotometr*
Płyta grzejna
Garnek litrowy
Waga zdolna odmierzać przynajmniej jeden gram
z dokładnością do 0,1 g*
Elektryczny młynek do kawy
Chemikalia dla testu kolorymetrycznego*
25 gram p(para)-dimetyloamino benzaldehydu
0,5 litra (1 pinta) stężonego kwasu siarkowego
0,5 litra (1 pinta) skrystalizowanego kwasu octowego
125 g chlorku żelaza
woda dejonizowana
18
Artykuły
1 szt. plastikowy cylinder z podziałką 250 ml
1 szt. borokrzemianowa zlewka 250 ml
2 szt. bursztynowe butelki z wąskim wlewem z korkami 125 ml
1 szt. butelka z korkiem 1000 ml
12 szt. probówki na kulturę ze szkła borokrzemianowego 20 x 150 mm*
6 szt. kuwet dobranych do kolorymetru*
Poliestrowe kulki kosmetyczne (dostępne w większości supermarketów)
6 szt. małe (60 mm) lejki plastikowe
1 szt. stojak na wiele lejków
1 pudełko bibuły filtracyjnej: 9 cm, grubej (jak Whatman 4) oraz 9 cm, średniej (1 lub 2)
1 szt. plastikowa podstawka na probówki (by wstawić około 10 probówek 20 mm)
1 szt. plastikowa podstawka na probówki (Nalge 5900-0007)$
1 szt. szczotka do czyszczenie probówek
1 szt. pipeta objętościowa 20 ml
1 szt. pipeta 10 ml co 1/10 ml
1 szt. pipeta 1 ml co 1/100 ml
1 szt. pipetor (albo Bel-Art F-37989 albo Nalge 3780-0100)
1 szt. szklany pręt do mieszania
1 szt. nierdzewna szpatułka, podwójna o zaokrąglonym ostrzu i kwadratowa
1 szt. plastikowa tryskawka 500 ml
1 szt. połysk do paznokci w jasnym kolorze lub klej do modeli
1 szt. mały plastikowy arkusz polipropylenowy mający około 10 cm kwadratowych*
1 szt. termometr od 0 do 110 stopni Celsjusza
*UWAGI
Kolorymetry
Ja nabyłem używany Bausch & Lomb Spectronic 20. Rozumiem, że nie każdy jest w stanie tak łatwo kupić taki
sprzęt. Spróbuj poszukać w książce telefonicznej sprzedawców używanego sprzętu laboratoryjnego. Jeśli nie
zostali wymienieni, spróbuj dostawców laboratoryjnych. Zazwyczaj mają oddział serwisowy i mogą mieć
używane spektrofotometry lub kolorymetry. Niektórymi markami do znalezienia są starsze modele Bausch &
Lomb Spectronic 20, Coleman Jr. oraz Turner. Firmy te przez wiele lat sprzedały dużo tych niskocenowych
spektrofotometrów i może będziesz w stanie kupić jeden stosunkowo niedrogo, powiedzmy 100 do 200
dolarów.
Kolejną opcją jest kupienie nowego kolorymetru lecz bez wszystkich drogich funkcji, jakie mają powyższe
jednostki. Do zastosowania dla odczytu na stałej długości fali i przy szerokim szczycie kolorystycznym, takim
jak w tym teście, wszystkim czego trzeba jest kolorymetr niskocenowy. Wszystko czego mu potrzeba to
właściwy filtr (tj. jak najbliższy 570 nm), kuweta lub uchwyt na probówki oraz skala o przepuszczalności
procentowej.
Są trzy firmy, jakie znam, oferujące kolorymetry w niskiej cenie:
Chemtrix (P.O. box 1359, Hillsboro OR 97123; 800-821-1358) ma kolorymetr (20A) za $269;
Hach (P.O.Box 389 Loveland, Colorado 80539; 800-525-5940) ma jedno parametrowy kolorymetr DR100
za około $200 (skontaktuj się z Hach w sprawie dostarczenia skali przepuszczalności i właściwego filtru)
Hellige (877 Stewart Ave., Garden City, N.Y. 11530; 516-222-0302) posiada fotometr z licznikiem za
około $125.
Waga
Waga Ohaus triple-beam jest rozpoznawalnym standardem wagi z laboratorium szkolnego. Obecnie kosztują
one około 80$ do 90$ u niemal każdego dostawcy laboratoryjnego lub nawet w sklepach hobbystycznych lub
19
jakichś specjalistycznych sklepach metalowych. Lecz dla tego testu i większości pracy z grzybami, nie będziesz
potrzebował ważyć dużych, jak również małych mas, oferowanych przez tę wagę. Nie posiadam nazw firm lecz
w ogłoszeniach High Times widziałem małe, niedrogie wagi, które mogą dokładnie ważyć do 30 gram.
Duże probówki borokrzemianowe
Z dwunastu probówek sześć odłóż na bok. Zostaną wykorzystane "jak są" bez dopasowywania. Pozostałe sześć
musi być oznaczona objętościowo dla standardowej objętości ekstrakcji 20 mililitrów. By to zrobić, po prostu
napełnij pipetę miarową 20 ml wody, następnie wlej wodę do oznaczanej probówki stojącej w uchwycie na
probówki. Następnie zaznacz spód menisku niezmywalnym flamastrem. To samo zrób z pozostałymi pięcioma
probówkami.
Dobrane kuwety
Kuwetki powinny mieć jeden centymetr średnicy wewnętrznej, lecz z uwagi na odchylenia w procesie
wytłaczania probówek średnica wewnętrzna nieco się różni. Ta nieregularność średnicy wewnętrznej i
sporadyczne smugi lub wahania grubości szklanych ścianek probówek są przyczyną międzykuwetkowych
różnic w ilości światła z filtru kolorymetru przechodzącego przez kuwetkę i roztwór. Odchylenie to może
wynosić aż pięć procent transmitancji. By zwiększyć dokładność z testu na test, niektórzy producenci
wymienionych powyżej kolorymetrów oferują jako opcję dopasowane kuwetki. Wybrane kuwetki zostały
dopasowane, tak że ilość światła, która pochłaniana jest przez ścianki kuwetki jest zasadniczo taka sama dla
każdej kuwetki. Za tę cenę zazwyczaj łatwiej je kupić. Jeśli musisz przygotować dopasowane kuwetki wykonaj
poniższą procedurę:
1. Probówki o średnicy zewnętrznej 13 mm będą miały nominalną średnicę wewnętrzną 10 mm. Kup
przynajmniej parę tuzinów.
2. Wybierz kilka i napełnij je wodą. Włóż je do swego kolorymetru i nastaw długość fali na 570 nm lub na
wartość najbliższą, na jaką pozwala twój filtr.
3. Nastaw miernik na dowolną pozycję środkową. Następnie powoli obracaj kuwetką. Zwróć uwagę na
różnicę gdy obracasz kuwetką o pełne 360 stopni. Wybierz probówkę o najmniejszej różnicy.
4. Kontynuuj z kolejnym zestawem kilku kuwetek i wybieraj najmniej zmienne kuwetki aż będziesz miał
sześć do dziesięciu kuwetek.
5. Teraz dopasuj kuwetki robiąc dowolne oznaczenie połyskiem do paznokci lub emalią modelarską na
wolnej krawędzi kuwetki tak, by oznaczenie to można wykorzystać do dopasowania kuwetki w uchwycie.
Zanotuj odczyt miernika.
6. Weź kolejną wybraną kuwetką i obracaj nią aż dopasujesz transmitancję do pierwszej oznaczonej
kuwetki. Oznacz ją także połyskiem lub farbą.
7. Kontynuuj aż wszystkie kuwetki zostaną dopasowane i oznaczone. Stosując kuwetki do mierzenia
transmitancji testowanej reakcji DMAB, upewnij się by zawsze wyrównać oznaczenie z wcześniej
ustaloną pozycją ustawienia na uchwycie kuwetki. Zazwyczaj sam uchwyt posiada oznaczenie lub
grzbiet do odtworzenia właściwej pozycji kuwetki.
8. Możliwe, że wstępna kuwetka, którą oznaczyłeś dowolnie może nie pasować do żadnej lub jedynie do
kilku innych kuwetek. Wystarczy zacząć od nowa, lecz jako wyjściową kuwetkę odniesieniową
wykorzystaj kolejną kuwetkę.
Uchwyt do probówki
Konkretny uchwyt, który stosuję jest w stylu otwartym, w którym jest jedna probówka wszerz i siedem wzdłuż.
Stosuję ten uchwyt do podgrzewania roztworu ekstrakcyjnego w litrowym garnku. By dopasować go do
garnka, przeciąłem uchwyt na dwie części mające po trzy probówki każda. Stosując ten uchwyt z probówkami
upewnij się by zrównoważyć ciężar probówek w trzech slotach. Uchwyt ma tendencję wypływać. Na przykład,
jeśli włożysz pojedynczą probówkę na koniec uchwytu, uchwyt wypłynie zrzucając probówkę do podgrzej wody,
marnując w ten sposób próbkę grzybową. By uniknąć utraty próbki, przy ekstrahowaniu pojedynczej próbki,
włóż probówkę na środek uchwytu, lub jeśli stosujesz dwie probówki, włóż je na oba końce uchwytu.
20
Chemikalia
W czasie moich wszystkich testów stosowałem chemikalia klasy technicznej. Klasa techniczna jest nieco mniej
czysta niż klasa odczynnikowa i zazwyczaj tańsza. Kwas siarkowy mógłby być klasy odczynnikowej, która jest
nieco czystsza niż lekko żółto brązowa klasa techniczna. Kwas siarkowy jest stosowany w roztworze
wywoływacza koloru i jest czytany w kolorymetrze, więc czystość i brak unoszących się cząsteczek mógłby
wspomóc czytelność i powtarzalność. Nie miałem problemów z tańszą klasą techniczną przez to, że zawsze
stosowałem pustą próbkę do porównania wszystkich próbek testu grzybowego. Pusta próbka stosowana jest w
kolorymetrii by ustawić punkt "zero". Jest to zazwyczaj raczej odczynnik testowy próbki z wody destylowanej
niż materiał lub ekstrakt do przetestowania. Jeśli przed jakąkolwiek reakcją odczynnik testowy jest zabarwiony
w obszarze widma testu, wówczas poprzez zastosowanie pustej próbki można skompensować kolorymetr przez
ten poziom koloru, tak, że wynik testu nie jest sztucznie zawyżony.
Plastikowy arkusz
Wszystko, czego trzeba to kawałek plastiku do zakrycia kciuka, tak, że gdy wstrząsasz probówką kultury z
mieszanką testową, kwas siarkowy nie poparzy ci skóry. Kawałek mający parę centymetrów kwadratowych
powinien wystarczyć. Większość plastików nie jest naruszana kwasem siarkowym.
Przygotowanie roztworów testowych
Wywoływacz koloru
Mieszanka ta jest faktycznym roztworem, który w obecności związku indolowego lub indolopodobnego, pokaże
kolor w niemal bezbarwnym roztworze.
1. Odważ 0,2 grama p-dimetyloaminobenzaldehydu (DMAB) i wrzuć go do 250 ml zlewki.
2. Przygotuj 20% wodny roztwór chlorku żelazowego odważając 20 g chlorku żelazowego w 100 ml
destylowanej lub dejonizowanej wody w 250 ml wyskalowanym cylindrze. Załóż rękawiczki. Chlorek
żelazowy może być żrący. Upewnij się, że cały znajdzie się w roztworze. Jeśli jakakolwiek cząsteczka
pozostanie nierozpuszczona, przefiltruj roztwór. Gotowy roztwór przechowuj w 125 ml butelce i
ometkuj. Wypłucz wyskalowany cylinder.
3. Stosując 1 ml pipetę i pipetor (nigdy nie zasysaj żrących lub toksycznych związków chemicznych do
pipety!) wciągnij 0,3 ml przechowywanego roztworu chlorku żelazowego (powyższy punkt 2). Dodaj go
do 250 ml zlewki ze znajdującym się tam już DMAB.
4. Wlej 35 ml wody destylowanej lub dejonizowanej do 250 ml zlewki i wymieszaj wodę by jak najlepiej
rozpuścić DMAB.
5. Dodaj z wyskalowanego cylindra 65 ml kwasu siarkowego do zlewki z DMAB. Bądź ostrożny z kwasem
siarkowym. Załóż rękawiczki, fartuch i najlepiej osłonę na twarz. Przy dodawaniu kwasu, zlewkę postaw
na stole. Nie trzymaj jej w ręku. Gdy dodasz kwas do wody znajdującej się w zlewce zajdzie reakcja
egzotermiczna i będzie ona zbyt gorąca do utrzymania. Delikatnie wymieszaj mieszankę. Ciepło z
kwasowo-wodnej mieszanki zamieni w roztwór pozostały DMAB.
6. Pozwól mieszance ostygnąć i napełnij tym wyjściowym roztworem 125 ml butelkę i ją ometkuj. Nie
wlewaj do butelek gorących płynów; mogą pęknąć.
Roztwór DMAB przechowuj w ciemnym chłodnym miejscu, najlepiej w zamrażalniku lodówki. Jeśli nie
przechowasz go gdzieś w zimnie, roztwór stopniowo pociemnieje i będzie bezużyteczny w kolorymetrii. Z
powodzeniem przechowywałem mój roztwór zapasowy w zamrażalniku przez ponad rok i nie ściemniał
zauważalnie. W temperaturze pokojowej będziesz prawdopodobnie musiał wyrzucić roztwór po kilku
miesiącach.
Spis Tresci
21
Roztwór ekstrakcyjny z kwasu octowego
Ten zapasowy roztwór stosowany jest by wyekstrahować z grzyba aktywne tryptaminy. Następnie próbka tego
ekstraktu testowana jest przy zastosowaniu powyższego roztworu wywoływacza koloru DMAB.
1. Odmierz 50 ml skrystalizowanego kwasu octowego w wyskalowanym 250 ml cylindrze. Napełnij cylinder
wodą dejonizowaną lub destylowaną do wysokości 250 ml i wlej ją do butelki 1000 ml. Wypłucz cylinder
wodą dejonizowaną w ilości 3 x 250 ml do 1000 ml butelki by otrzymać łącznie 1000 ml zapasowego
roztworu 5% kwasu octowego.
2. 5% kwas octowy można zastąpić octem destylowanym (tj. "octem białym"). Ocet destylowany jest w
przybliżeniu 5% kwasem octowym.
Para-dimetylobenzaldehydowy test kolorymetryczny
Rycina 6 - ukazuje podstawową procedurę testowania kolorymetrycznego (p-DMAB).
1. Ustaw na stole lub ławce, na której przeprowadzisz test, wyposażenie z powyższej ilustracji. Włącz
kolorymetr lub spektrofotometr by zaczął się nagrzewać i ustaw lub wyreguluj właściwą długość fali
(570 nm lub blisko tego). Większość ma źródła światła, które muszą być włączone przez 20 do 30 minut
by ustabilizowało się widmo wyjściowe. Starsze modele mają także wolno nagrzewającą się elektronikę.
2. Włącz płytę grzewczą i zacznij rozgrzewać wodę w litrowym rondlu. Nie dopuść do zagotowania wody.
Wrzenie przewróci probówki z próbkami wylewając je do wrzącej wody.
3. Jeśli tego nie zrobiłeś, wykorzystaj młynek do kawy by zmielić suszone grzyby, które chcesz sprawdzić.
Odważ 0,5 grama zmielonych grzybów. Stosując wagę, najlepiej wykorzystać kawałek papieru, na
którym odważysz grzyby. Zanim nasypiesz proszek grzybowy, sprawdź ile waży sam papier, następnie
dodaj ten ciężar do wymaganej połowy grama próbki. Tę całkowitą wagę w gramach powinieneś ustawić
na skali, jeśli masz wagę z potrójną belką. Mając na papierze odważony proszek grzybowy, zwiń papier
by utworzyć rynienkę i wsyp próbkę do pustej, dużej (20 mm x 150 mm), nieoznaczonej probówki.
4. Dodaj do próbki 20 ml 5% skrystalizowanego kwasu octowego. Zamieszaj próbkę szklanym prętem,
upewniając się, że cały proszek grzybowy jest namoczony w roztworze kwasu octowego. Wstaw
probówkę w plastikowy uchwyt i zanurz go w podgrzanej wodzie bliskiej wrzenia. Zanotuj czas lub
uruchom czasomierz. Podgrzewaj tę zawiesinę przez 30 minut. Czas ten nie jest krytyczny. Jeśli
podgrzejesz ją dłużej niż trzydzieści minut nie sprawi to większej różnicy. Zbyt długo utleni psylocynę w
roztworze i spowoduje fałszywie niski odczyt próbki. Wyparuje również roztwór kwasu octowego.
22
5.
6.
7.
8.
Co każde dziesięć minut, lub coś koło tego, zamieszaj zawiesinę prętem do mieszania. Proszek grzybowy
ma tendencję do unoszenia się na powierzchni roztworu kwasu octowego, co nie pozwala optymalnie go
wyekstrahować, gdy nie jest zanurzony. Wierzch proszku może być również wystawiony na działanie
powietrza przez co utleni się na ciemno niebiesko. Ponownie, może to doprowadzić do fałszywie niskiego
odczytu.
Zanurzenie skrystalizowanego kwasu octowego z proszkiem grzybowym w wodzie bliskiej wrzenia
podczas fazy ekstrakcyjnej testu jest ważne by zdezaktywować wszelkie enzymy, które powodują
niebieszczenie, a tym samym utratę tryptamin w grzybach.
Bez ciepła i wraz z czasem roztwór ekstraktu grzybowego powoli zmieni kolor na niebiesko zielony aż po
kilku dniach stanie się ciemno niebieski.
Jak wskazano w powyższym rozdziale o teorii, zastosuj termometr by upewnić się, że roztwór ekstrakcji
przez co najmniej dziesięć minut osiąga 70 stopni Celsjusza. Temperatura ta przekształca całą
psilocybinę w psylocynę, co przyczynia się do czystszego koloru testowego.
Podczas ekstrakcji proszku grzybowego, przygotuj następny krok: filtrowanie i wywoływanie próbki. Dla
każdej próbki zastosuj jeden mały lejek filtrujący. Włóż do lejka kulkę poliestrową. Namocz kulkę
kosmetyczną wykorzystując tryskawkę, następnie wyciśnij palcami nadmiar wody z kulki. Wylej tę wodę
jeśli poszła do probówki zbiorczej.
Po 30 minutach lub coś koło tego, wyjmij z kąpieli wodnej uchwyt na probówki. Wyłącz płytę grzejną
(lub palnik). Tuż przed filtrowaniem wstępnym jeszcze raz zamieszaj zawiesinę. Wlej zawartość próbek
testowych przez wierzch poliestrowej kulki kosmetycznej w małym lejku filtracyjnym, która spłynie do
dużej probówki (20 x 150 mm), na której zaznaczyłeś poziom 20 ml. Nie przejmuj się, jeśli nie
wydobędziesz z probówki zawiesiny do ostatniej kropli.
Niech filtrat całkiem przeleci przez mały filtr dzięki grawitacji. Dzięki uciśnięciu kulki kosmetycznej uda
się czasem wycisnąć z włókien poliestrowych więcej wodnego ekstraktu. Krok ten jest ważny, ponieważ
jeśli w końcowej próbce testowej nie uzyskasz całego początkowego nierozcieńczonego ekstraktu, twoja
wartość stężenia będzie fałszywie niska. Ja przypadkowo zapomniałem wykonać tego etapu wyciskania i
miałem odczyty mniejsze o 25%.
Choć bardziej spójne wyniki mógłbyś uzyskać stosując jedynie bibułę filtracyjną zamiast kulki
kosmetycznej, filtrując niegęsto śluzowatą zawiesinę grzybową przy pomocy kulki kosmetycznej możesz
zaoszczędzić dosłownie godziny czekania aż cała zawiesina przeleci przez bibułę filtracyjną.
Teraz wykorzystaj tryskawkę napełnioną wodą destylowaną (lub dejonizowaną) i przepłucz kilkoma
mililitrami wody ścianki probówki użytej do wyekstrahowania próbki grzybowej. Zauważ, że ekstrakt
przefiltrowany przez kulkę kosmetyczną nie sięga oznaczenia 20 ml na probówce. Ta utrata płynu
pochodzi głównie z parowania gdy podgrzewałeś zawiesinę grzybową.
Ze względu na standaryzację, wszystkie nasze roztwory testowe muszą mieć całkowitą objętość 20 ml.
Wstrząśnij nieoznakowaną probówką, do której właśnie wlałeś trochę wody z płukania i wlej szacunkową
ilość tej wody przez filtr z kulki kosmetycznej, co dopełni probówkę do 20 ml. Przemycie to usunie
większość resztek ekstraktu, pozostałego na poliestrowej kulce i rozcieńczy początkowy filtrat do 20 ml.
Starannie obserwuj filtrowanie i usuń filtr do zlewu gdy poziom osiągnie oznaczenie 20 ml.
Największe błędy mogą się pojawić przy krokach filtrowania i rozcieńczania. Jeśli w procesie
przemywania filtratu i doprowadzania przefiltrowanej objętości do 20 mililitrów, wlejesz na filtr lejka
zbyt dużo wody, to rozcieńczysz część wyekstrahowanej próbki, która wówczas nie przejdzie przez filtr.
Po osiągnięciu oznaczenia 20 ml zmuszony jesteś pozbyć się wody, która może zawierać część twojej
próbki. Wyniki mogą być wówczas sztucznie zaniżone. Rozwiązanie: dodaj mniejsze ilości wody z
płukania przy pomocy butelki ssącej, tak by na filtrze nie został płynny ekstrakt grzybowy, który nie
stanie się wówczas częścią testu.
Jeśli w procesie przepłukiwania próbki na kulce kosmetycznej i dostosowywania do objętości 20 ml,
przepełnisz probówkę ponad oznaczenie 20 ml, skoryguj po prostu końcową absorbancję mnożąc
absorbancję przez ułamek, którego licznikiem jest przefiltrowana objętość (ponad 20 mililitrów), a
mianownikiem jest 20.
Ten z grubsza przefiltrowany ekstrakt jest twą próbką testową lecz musi być ponownie przefiltrowany,
tak by był czysty i z powodu zmętnienia nie zwiększył absorbancji odczytu z kolorymetru. Przelej ten
ekstrakt przez kolejny mały lejek ze złożonym kawałkiem bibuły filtracyjnej. Złóż bibułę filtracyjną na
trzy (tj. w ósemki).
Większość ekstraktów będzie mieć w sobie trochę zawiesiny koloidowej, co sprawi, że będą wyglądać
nieco mętnie. Nawet przefiltrowanie go przy pomocy drobnego filtru nie usunie całej mętności. W
23
9.
10.
11.
12.
przypadku większości filtracji trzeba będzie usunąć jedynie cząstki gruboziarniste i wystarczy bibuła
filtracyjna Whatman #4. Do cięższych zawiesin zastosuj drobniejszą, lecz wolniejszą bibułę filtracyjną
Whatman #2. Ideą jest tutaj otrzymanie sensownie czystej próbki, która ma najmniej zmętnienia. Jeśli
zmętnienie jest nadmierne da fałszywe wysokie odczyty z kolorymetru.
Na pojemnik odbierający ten filtrat wykorzystaj kolejną dużą probówkę. Jeśli chcesz, to po tym, jak
przeleci kilka mililitrów płynu, możesz zatrzymać proces. Ja wolę zazwyczaj wystarczającą ilość
przygotowanej próbki, przynajmniej dla paru testów (każdy test wymaga 0,5 lub 1,0 ml próbki), tak na
wszelki wypadek gdybym chciał powtórzyć odczyt.
Powyższy dwustopniowy proces filtrowania powinien trwać od 10 do 15 minut. Podczas filtrowania, przy
użyciu pipetora i 10 ml pipety, wciągnij 2 ml odczynnika DMAB i wlej go do dopasowanych
kuwetek/małej probówki. Wlewaj odczynnik DMAB do kuwetki dla każdej próbki lub testu, który chcesz
przeprowadzić. Teraz jesteś gotów wywołać kolor i odczytać końcową absorbancję. Jeśli przechowujesz
testowy roztwór DMAB w zamrażalniku, pozwól mu przed zastosowaniem w teście, powrócić do
temperatury pokojowej.
Przy pomocy pipetora i 1 ml pipety, zassij 1 ml próbki ekstraktu grzybowego do przetestowania. Jeśli
przewidujesz odczyt absorbancji powyżej 0,700 A lub około tego, wówczas zassij jedynie 0,5 ml próbki,
lecz przed zrobieniem tego dodaj 0,5 ml wody dejonizowanej lub destylowanej do małej odczynnikowej
probówki/dopasowanej kuwetki.
Powód tego rozcieńczenia jest taki, że dla kolorymetrów ze skalą transmitancji, większość czytelnej
części skali leży powyżej transmitancji 20%. Transmitancja niższa, odpowiada wyższej absorbancji i
większej możliwości błędów odczytu i słabej precyzji. Sprawdziłem by upewnić się, czy oba sposoby
testowania dały tę samą wartość po potrzebnym przemnożeniu rozcieńczonych próbek przez dwa.
Całkowita łączna objętość testowa musi wynosić 3 ml dla obu próbek i odczynnika DMAB. Wodnista
próbka nie zmiesza się od razu z gęstszym odczynnikiem DMAB lecz pozostanie na wierzchu aż do
wymieszania.
Upewnij się, że stoper jest gotowy. Połóż kciuk na probówce reakcyjnej z arkuszem plastiku między
kciukiem a probówką i odwróć probówkę do góry dnem i z powrotem. Nie wstrząsaj ponieważ
potrząśnięcie wprowadzi bąbelki, które mogą pozostać na ściankach probówki i zakłócić później odczyt
kolorymetru. Albo uruchom stoper albo natychmiast zanotuj godzinę. Dokładnie po 30 minutach,
odczytaj transmitancję na kolorymetrze (lub absorbancję, jeśli twój przyrząd ma bezpośrednią konwersję
liniową z transmitancji na absorbancję).
Czasem mieszanka reakcyjna zmętnieje mimo przefiltrowania próbki. Jeśli tak, rozcieńcz ją 3 ml wody
dejonizowanej, odczytaj i podziel wynik absorbancji przez dwa. Rozcieńczenie zazwyczaj rozmyje
zmętnienie na tyle by można było odczytać test.
Ważne by prędko przetestować roztwór ekstrakcji grzybowej, w przeciwnym razie niebieszczenie i inne
reakcje utleniania rozłożą aktywne tryptaminy i sprawią, że otrzymasz fałszywie niską wartość
absorbancji testu. Testując roztwór ekstraktu grzybowego w regularnych odstępach, przekonałem się,
że żadne istotne zmniejszenie stężenia aktywnej tryptaminy nie następowało aż do sześciu do ośmiu
godzin po.
Zawsze przeprowadzałem ten test pod dwiema 40 watowymi lampami fluorescencyjnymi. W świetle tej
pracy badawczej, stosującej UV do przyśpieszenia kolorystycznej reakcji DMAB6, lampy fluorescencyjne
mogą mieć więcej mocy widmowej w bliskim UV niż światła żarowe lub światło słoneczne, przechodzące
przez szklane okno. Brak takiego oświetlenia w obszarze testowym może spowolnić reakcję i
spowodować tym samym, że otrzymasz po 30 minutach niższe odczyty od moich. Nie potwierdziłem
tego, lecz zdawaj sobie sprawę z tej możliwości.
Pod koniec 30 minuty, odczytaj skalę kolorymetru i zanotuj wartość dla późniejszego odniesienia.
Podczas odczytywania (chyba, że miernik jest cyfrowy) patrz na skalę bezpośrednio pod igłą. Jeśli
spojrzysz na igłę pod kątem, twój odczyt nie będzie dokładny, ani powtarzalny. Gdy wartość
transmitancji maleje, błędy odczytu robią większą różnicę w ostatecznej wartości absorbancji (lub
stężenia). Niektóre mierniki mają pod skalą lusterko. Patrząc na igłę tak by nie widzieć jej odbicia,
będziesz patrzył na miernik bezpośrednio w dół. Jeśli igła znajdzie się między dwiema podziałkami i
ukaże część zarejestrowanej wartości (np. 14,6%) spróbuj interpolować lub szacunkowo określić
wartość. Jeśli masz kolorymetr lub spektrofotometr z bezpośrednim odczytem absorbancji, wartość testu
będzie wprost proporcjonalna do stężenia tryptamin obecnych w próbce grzybowej. Jeśli, z drugiej
strony, twój kolorymetr ma skalę transmitancji (tj. 0-100%) i tylko logarytmiczną skalę absorbancji (tj.
odległość między liczbami całkowitymi maleje wraz ze wzrostem liczby), będziesz musiał przekształcić
24
transmitancję na absorbancję. Wzór jest taki: Logarytm absorbancji (1/0,01 x transmitancja w %).
Najłatwiejszym sposobem obliczenia tego jest nabycie niedrogiego kalkulatora z logarytmami i z "1/x"
lub z funkcjami wzajemnymi. Wówczas obliczasz wprowadzając transmitancję jako liczbę między jeden a
sto, dzielisz przez 100, wciskasz klawisz "1/x", następnie wciskasz "log". Wynik będzie absorbancją
proporcjonalną do stężenia.
Spis Tresci
Zakończenie
Mam nadzieję, że powyższe informacje pomagają wyjaśnić wartości testowe, które będą zastosowane w
nadchodzących artykułach. Następny artykuł o środowiskowych i odżywkowych wpływach na rozwój i
biosyntezę psilocybiny w Psilocybe cubensis skorzysta obszernie z tego testu. Ostatni rozdział tego artykułu,
jest oczywiście dla tych osób, które skłonne są robić swe własne badania. Zachęcam każdego z jakimkolwiek
zapleczem chemicznym do wypróbowania tego testu. Wartości testowe niezmiernie pomogą w planowaniu
własnych doznań enteogenicznych z "magicznym grzybem".
Bibliografia
1. Agurell, S., Blomkvist,S. and Catalfomo, P., "Biosynthesis of Psilocybin in Submerged Culture of Psilocybin cubensis: Part I.
Incorporation of labeled tryptophan and tryptamine," Acta Pharm. Suecica, Vol. 3 (1966), 37-44.
2. Agurell, S., Lars, J. and and Nilsson, C., "Biosynthesis of Psilocybin: Part II. Incorporation of Labelled Tryptamine Derivatives,
Acta Chemica Scandinavica, Vol. 22, No. 4 (1968), 1210-1218.
3. Beung, M.W. and Bigwood, J., "Quantitative Analysis of Psilocybin and Psilocin in P. Baeocystis by HPLC and by Thin-Layer
Chromatography, Journal of Chromatography, Vol. 207 (1981), 379-385.
4. Bigwood, Jeremy and Beug, Michael W., and others, editors. "Variation of Psilocybin and Psilocin Levels with Repeated
Flushes (Harvests) of Mature Sporocarps of Psilocybe Cubensis (Earle) Singer," Journal of Ethnopharmacology, Vol. 5 (1982),
287-291.
5. Casale, John F., "An Aqueous-Organic Extraction Method for the Isolation and Identification of Psilocin from Hallucinogenic
Mushrooms," Journal of Forensic Sciences, Vol. 30, No. 1(Jan., 1985), 247-250.
6. Catalfomo, P. and Tyler, V. E., Jr., "The Production of Psilocybin in Submerged Culture by Psilocybe cubensis, Lloydia, Vol. 27,
No.l (March 1964), 53-63.
7. Christiansen, A.L. and Rasmussen, K.E., and others. "The Content of Psilocybin in Norvegian Psilocybe semilanceata," Planta
Medica: Journal of Medicinal Plant Research, Vol. 42 (1981), 229-235.
8. Haard, Richard and Karen. Poisonous & Hallucinogenic Mushrooms, 2nd Edition. Cloudburst Press, 1977.
9. Leung, A. Y. and Smith, A. H., and others. "Production of Psilocybin in Psilocybe Baeocystis Saprophytic Culture, Journal of
Pharmaceutical Sciences, Vol. 54, No. 11 (November 1965), 1576-1579.
10. Leung, A.Y. and Paul, A. G., "Baeocystin and Norbaeocystin: New Analogs of Psilocybin from Psilocybe baeocystis," Journal of
Pharmaceutical Sciences, Vol. 57, No. 10 (October 1968), 1667-1671.
11. Leung, A.Y. and Paul, A.G., "The Relationship of Carbon and Nitrogen Nutrition of Psilocybe baecocystis to the Production of
Psilocybin and its Analogs," Lloydia, Vol. 32, No. 1(March, 1969), 66-71.
12. Lewis, Waiter H., Medical Botany: Plants affecting Man's Health. Chapter 18, Hallucinogens. Wiley-Interscience, John Wiley &
Sons, 1977.
13. Norland, Richard. What's in a Mushroom. Pear Tree Publications, 1976.
14. Repke, David B. and Leslie, Dale Thomas, and others. "Baeocystin in Psilocybe, Conocybe and Panaeolus," Lloydia, Vol. 40,
No.6 (Nov-Dec 1977), 566-578.
15. Sarvicki,editor. Photometric Organic Analysis, Vol 31. Wiley-Interscience, 1970.
16. Snell & Snell,editor. CoIorzetric Methods of Analysis, 3rd Edition, Volume IV. Van Nostrand, 1954.
17. Stafford, Peter. Psychedelics Encyclopedia. From Chapter 4, "Mushrooms". Berkeley, California: And/Or Press, 1977.
18. Weeks, Amold R. and Singer, Rolf, and others. "A New Psilocybian Species of Coplandia," Journal of Natural Products, Vol. 42,
No. 5 (1979), 469-474.
19. Windholz, Martha, editor. The Merck Index. Ninth Edition, Entries #7711 and #7712. Rahway,N.J.: Merck & Co., Inc., 1976.
[ tłumaczenie: cjuchu ]
25

grzybowy enteogen - pomiar grzyba

Transkrypt

Podobne dokumenty

TO Test Osobowości Autorzy testu: Erich Mittenecker i Walter Toman

BENTON - Test Pamięci Wzrokowej Bentona Autor testu: Artur L

„Drzewo przeżyć” to forma testu socjometrycznego

Instrukcja korzystania z platformy e

Orchid ImmunoStrip Test

Arkusz oceny dokumentu “Podsumowanie testu” [0..15] skala ocen

PepMV ImmunoStrip Test