WYTWARZANIE I ANALIZA PRODUKTÓW MLECZNYCH

Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia
OCENA AKTYWNOŚCI UTLENIAJĄCEJ BAKTERII
ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS
Reakcje żelaza z udziałem mikroorganizmów
Mikroorganizmy, które biorą udział w reakcjach utleniania/redukcji żelaza można podzielić na następujące grupy:
- Acidofilne chemoautotroficzne mikroorganizmy utleniające żelazo w kwaśnym środowisku (Acidithiobacillus
ferrooxidans, Leptospirillum ferrooxidans, Sulfolobus i Gallionella).
- Mikroorganizmy utleniające zarówno żelazo, jak i mangan w środowisku słabo kwaśnym (Metallogenium, Leptothrix,
Siderocapsa). W tych warunkach następuje wytrącenie wodorotlenku żelaza i manganu.
- Bakterie powodujące redukcję jonów Fe2+ (Bacillus, Pseudomonas, Desulfovibrio i Thiobacillus).
Jony żelaza (II) są dla chemoautotroficznych mikroorganizmów źródłem energii. Bakterie te uzyskują ją w procesie utleniania
jonów żelaza (II) do żelaza (III):
Fe2+ + bakterie ® Fe3+ + ePowstające jony Fe3+ są akceptorami elektronów, które są wykorzystywane przez inne mikroorganizmy. W środowisku
obojętnym jony Fe3+ nie są stabilne i wytrącają się w postaci wodorotlenków. Wiele mikroorganizmów (np. Salmonella
typhimurium, Areobacter aerogenes) wytwarza związki chemiczne o charakterze chelatującym, zwane syderoforami i w ten
sposób zatrzymuje jony żelaza (III) w roztworze.
Inną grupę mikroorganizmów biorących udział w reakcjach z żelazem stanowią tzw. bakterie żelaza lub żelazobakterie, które
powinny być raczej nazywane bakteriami żelazowo-manganowymi, gdyż przede wszystkim powodują wytrącenie MnO2. Do
tej grupy bakterii należą: Metallogenium, Leptothrix, Siderocapsa, które odkładają utlenione formy żelaza i manganu na
zewnątrz bądź wewnątrz komórki.
Bakterie żelazowo-manganowe odkładające utlenione formy żelaza na zewnątrz komórki produkują osady w postaci tlenków
lub wodorotlenków. Złogi te nadają komórkom lub koloniom bakterii zabarwienie czerwonobrązowe (kolor rdzy). Warstwa
wodorotlenku chroni komórkę przed dużymi stężeniem jonów żelaza. Uważa się, że mikroorganizmy te wytwarzają nadtlenek
wodoru (H2O2), który utlenia jony żelaza i manganu. Proces przebiega w obecności katalazy, również wydzielanej przez
bakterie. Bakterie te występują w rurach sieci wodociągowych.
Bakterie chemoautotroficzne utleniające żelazo
Na początku lat pięćdziesiątych dwudziestego wieku z kwaśnych wód kopalnianych wyodrębniono bakterie Thiobacillus
ferrooxidans, obecnie nazywane Acidithiobacillus ferrooxidans. SA to gram-ujemne pałeczki o wymiarach 0,5 x 1,0 mm, które
czerpią energie z procesu utleniania żelaza (II) do żelaza (III), ale także z utleniania siarki, siarkowodoru, siarczków i
tiosiarczanów. Bakterie te pozyskują węgiel z CO2, azot zaś ze związków amonowych. Bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans
są mikroorganizmami mezofilnymi, rozwijają się w temperaturze około 300C, optymalne pH roztworu hodowlanego wynosi
2,0-2,5.
4FeSO4 + 2H2SO4 + O2 → 2Fe2(SO4)3 + 2H2O
ΔH 300C = -38 kJxmol-1
Utlenianie jonów żelaza (II) może być reakcją enzymatyczną. Enzymatyczny mechanizm utleniania żelaza (II) przez
Acidithiobacillus ferrooxidans wymusza bezpośredni kontakt jonów Fe2+ z komórką mikroorganizmu. Dla wyjaśnienia tego
zjawiska przyjęto hipotezę chemiosmotyczną. Zakłada ona, że elektrony zostają przekazane od jonów Fe2+ do Fe (II)
oksydoreduktazy cytochromowej następnie do cytochromu C. Kolejnym nosnikiem elektronów jest cząsteczka białka
ruscytycyjanina, która może przenosią elektrony z oksydoreduktazy cytochromowej i cytochromu c do oksydazy
cytochromowej. Mechanizm ten umożliwia transport elektronów przez błonę cytoplazmatyczną ściany komórkowej. Ze
zredukowanego cytochromu c elektrony są przekazywane do oksydazy cytochromowej aa3, która reaguje z O2 i jonami H+, co
prowadzi do utworzenia cząsteczki wody [rysunek 7.3]
Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia
Proces adsorpcji jonów żelaza lub manganu przebiega po zewnętrznej stronie błony komórkowej. Anionowe polimery
wytwarzane przez wiele bakterii mogą adsorbować jony żelaza (II), a w środowisku obojętnym także powstałe
hydroksykationy Fe (III): Fe(OH)2+ i Fe(OH)2+.
Szybkość procesu bioutleniania wzrasta wraz ze wzrostem stężenia jonów Fe2+, maleje zaś ze wzrostem stężenia jonów Fe3+.
Oprócz syderoforów w transporcie żelaza przez błonę cytoplazmatyczną do wnętrza komórki biorą czynny udział białka
peryplazmatyczne i białka receptorowe, które SA zlokalizowane po obu stronach błony cytoplazmatycznej. Proces transportu
zaczyna się od utworzenia kompleksu żelaza z syderoforem wydzielonym przez komórkę. Następnie kompleks żelazosyderofor łączy się z białkiem receptorowym. Żelazo oddziela się od syderoforu i przechodzi przez błonę cytoplazmatyczną.
Wewnątrz komórki następuje redukcja żelaza (III) do żelaza (II).
Wykonanie ćwiczenia (cz. 1)
I. Przygotowanie pożywki do hodowli bakterii Acidithiobacillus ferrooxidans.
Hodowlę prowadzi się w pożywce 9K Silvermana i Lundgrena - zwanej inaczej pożywką 9K, która zawiera 9g
żelaza w 1dm3 roztworu.
Pożywkę Silvermana i Lundgrena sporządza się mieszając dwa oddzielnie przygotowane i wyjałowione roztwory,
w proporcji 7: 3 (I i II roztwór).
I roztwór
(NH4)2SO4
- 0,6 g
KCl
- 0,02 g
K2HPO4
- 0,1 g
MgSO4 x 7H2O
- 0,1 g
Ca(NO3)2
- ślad
H2O
- 140 cm3
Pożywkę przygotować i oddać do sterylizacji (sterylizuje się przez 20 min. w autoklawie).
II roztwór
FeSO4 x 7H2O
- 8,84 g
10n H2SO4
- 0,2 cm3
H2O
- 60 cm3
Pożywkę sterylizuje się filtrując, używając sączków celulozowych 0,45mm.
W tym celu należy zamontować zestaw do filtracji na kolbie filtracyjnej. Przy zamkniętym przepływie nałożyć pincetą
filtr celulozowy jak na rysunku obok. Zamontować lejek i podłączyć wężem kolbę filtracyjną z pompą próżniową.
Przy otwartym przepływie wlewamy pożywkę (II roztwór) do lejka i włączamy pompę. Po zakończeniu filtracji należy
przelać zawartość kolby filtracyjnej do jałowej kolby stożkowej o pojemności 250/300 cm3.
Cały zestaw do filtracji należy dokładnie umyć !!! Filtr pozostawić do wyschnięcia na bibule.
1. Sporządzić roztwór II w kolbie stożkowej o pojemności 250-300 cm3. Dobrze wymieszany roztwór wyjałowić
za pomocą zestawu do filtracji. Do sterylnego roztworu II dodać odpowiednią ilość roztwór I, całość
wymieszać, a następnie połowę przelać do drugiej jałowej kolby stożkowej o pojemności 250-300 cm3
(używać cylindrów miarowych!!!)
2. Do jednej z kolb wprowadzić 2 cm3 aktywnej hodowli bakterii A. ferrooxidans. Do drugiej zamiast hodowli
bakterii niewielką ilość sproszkowanego tymolu.
(hodowlę bakterii pobierać sterylnymi pipetami).
3. Tak przygotowane układy badawcze zatkać korkami z waty/ligniny i dokładnie opisać.
4. W przygotowanych układach badawczych oznaczyć zawartość jonów Fe2+ i Fe3+. Po wykonaniu oznaczenia,
kolby inkubować w temperaturze pokojowej przez okres 7 dni.
II. Oznaczanie zawartości jonów Fe2+ i Fe3+.
1. Oznaczenie przeprowadzić metodą kompleksometryczną, miareczkując roztwór z jonami żelaza roztworem
EDTA wobec wskaźnika, którym jest roztwór kwasu sulfosalicylowego.
2. Przygotować trzy czyste kolbki stożkowe do miareczkowania (o pojemności 50 cm3), do każdej wprowadzić po
1 cm3 hodowli i po 10cm3 wskaźnika.
Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia
(jeżeli w roztworze są obecne jony Fe3+ powinien się on zabarwić na kolor fioletowy).
Kolby ogrzewać do początku wrzenia roztworów, a następnie gorące roztwory miareczkować 0,025M
roztworem EDTA do odbarwienia z koloru fioletowego na słomkowy. Zanotować ilości a cm3 EDTA.
Następnie do kolb dodać nadmiar nadsiarczanu amonu (zmiana barwy na fioletową) i powtórnie miareczkować
EDTA do odbarwienia na kolor słomkowy – b cm3.
(Ilość nadsiarczanu amonu powinna być tak dobrana, żeby po zakończonym miareczkowaniu i wprowadzeniu niewielkiej ilości
utleniacza barwa roztworu nie uległa zmianie).
3. Powyższe czynności powtórzyć dla próby kontrolnej.
4. Ze wzorów obliczyć zawartość jonów Fe2+ i Fe3+ w 1 dm3 badanego roztworu:
A g/dm3 Fe3+ = a cm3 x 1.396
B g/dm3 Fe2+ = b cm3 x 1.396
UWAGA!!! roztwory pobierać sterylnymi pipetami
Wykonanie ćwiczenia (cz. 2)
1. Oznaczyć zawartość jonów Fe2+ i Fe3+ w układzie z bakteriami i układzie kontrolnym.
III. Opracowanie wyników
1. Na podstawie uzyskanych wyników przedstawić na wykresie zmianę zawartości jonów Fe2+ i Fe3+ w obydwu
układach ( z bakteriami i kontrolnym).
2. Znając ilość utlenionego przez bakterie żelaza (wykresy) obliczyć ilość energii zmagazynowanej w ATP, w
oparciu o równanie reakcji utleniania żelaza. Obliczenia należy wykonać dla żelaza Fe2+ lub Fe3+.
3. Uzasadnić uzyskane wyniki. Wyciągnąć wnioski.
IV. Zagadnienia teoretyczne
1.
2.
3.
4.
5.
Reakcje żelaza z bakteriami
Charakterystyka bakterii chemoautotroficznych
Sposoby odżywiania bakterii.
Miareczkowanie kompleksometryczne.
Umiejętność wyliczania ilości utlenionego żelaza.
V. Literatura
1.
2.
3.
4.
5.
Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; 1998
Russel S.; Biotechnologia; Wyd. PWN; Warszawa; 1990
Kowal K., Libudzisz Z.; Mikrobiologia techniczna, Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000
Ostrowski M., Sokołowska A., Małe bakterie wielka miedź – czytelnia (B.W. ul. Oleska).
Sadowski Z., Biogeochemia – wybrane zagadnienia, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej,
Wrocław 2005.