ćwiczenie 3/4 ocena aktywności utleniającej bakterii at. ferrooxidans

Biotechnologia ogólna dla kierunku biologia, inżynieria środowiska od 2014/2015
ĆWICZENIE 3, 4 OCENA AKTYWNOŚCI UTLENIAJĄCEJ BAKTERII ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS
Żelazo i mangan w wodzie
Żelazo, chociaż zalicza się do pierwiastków niezbędnych w naszym organizmie, w wodzie wodociągowej stanowi składnik
niepożądany. Już niewielkie ilości żelaza >1 mg Fe/dm3 , mogą powodować powstawanie brudnych, brązowych zacieków na
przyborach sanitarnych. Żelazo w ilościach kilkugramowych może zniszczyć bieliznę w pralce i zmienić diametralnie smak wody
na nieprzyjemny i metaliczny. Tymczasem w wodzie z ujęcia zawartość żelaza dochodzi nawet do 30 i więcej mg Fe/dm3 (wartość
dopuszczalna – 0,2 mg Fe/dm3). W wodach głębinowych żelazo występuje głównie w postaci dwuwartościowej Fe2+, jako
wodorowęglan żelazawy Fe(HCO3)2 lub siarczan żelazawy FeSO4. Oba związki są nietrwałe i dość łatwo ulegają procesowi hydrolizy,
a przy zetknięciu się z atmosferą, wskutek rozpuszczania się w wodzie tlenu, utleniają się do żelaza trójwartościowego, tworząc w
wodzie wodorotlenek żelazowy Fe(OH)3 w myśl reakcji:
Fe(HCO3)2 + H2O → Fe(OH)2 +H2CO3 → Fe(OH)2 + H2O + CO2
2 Fe(OH)2 + O + H2O → 2Fe(OH)3↓
Wodorotlenek żelazowy Fe(OH)3 jest związkiem trudno rozpuszczalnym w wodzie, wydziela się w postaci ciemnoczerwonych
kłaczków i dość łatwo daje się odfiltrować na złożach piaskowych. Proces kłaczkowania nadaje wodzie specyficzną barwę. Jeśli
wyciągniemy wiadro ze studni i po kilku dniach woda zmieni barwę na żółtą, to jest to właśnie efekt wytrącania się związków
żelaza. W wodach powierzchniowych (rzadko w podziemnych), żelazo występuje też w postaci koloidalnych, zawieszonych cząstek
FeS, Fe(OH)3 lub jako związek organiczny (humus). Wszystkie te postacie nie podlegają procesowi hydrolizy i są trudne do usunięcia
z wody, nadając jej naturalną barwę od jasno słomkowej, do koloru herbaty.
Mangan jest pierwiastkiem znacznie rzadziej występującym w wodzie. Stężenie manganu może się wahać od 0-10 mg
Mn/dm3 (wartość dopuszczalna – 0,05 mg Mn/dm3 ), przy czym sporadycznie spotkamy go w wodach powierzchniowych, częściej
natomiast w wodach głębinowych, gdzie obecny jest w postaci rozpuszczalnej dwuwartościowej i tworzy sole (chlorki, siarczany).
W postaci utlenionej jako dwutlenek manganu (MnO2) staje się nierozpuszczalny w wodzie tworząc czarne osady. Mangan,
podobnie jak żelazo jest pierwiastkiem niepożądanym w wodzie z ujęcia, na bieliźnie i przyborach sanitarnych pozostawia brunatne
plamy, stanowi też pożywkę dla bakterii.
Reakcje żelaza z udziałem mikroorganizmów
Mikroorganizmy, które biorą udział w reakcjach utleniania/redukcji żelaza można podzielić na następujące grupy:
Mikroorganizmy utleniające żelazo w środowisku silnie kwaśnym (acidofilne pH 1,5-3,0):
- mezofilne, aerobowe, obligatoryjne chemolitoautotrofy: Acidithiobacillus ferrooxidans i Leptospirillum ferrooxidans (właściwe
bakterie żelaziste)
- termofilne, aerobowe, chemolitoheterotrofy - Sulfolobus (archebakteria izolowana z gorących źródeł, wykorzystuje głównie
S0, HS-, ale również Fe2+ jako donory elektronów; rośnie też w warunkach beztlenowych i wtedy akceptorem elektronów
zamiast tlenu jest Fe3+ lub MnO4-).
Mikroorganizmy utleniające zarówno żelazo, jak i mangan w środowisku obojętnym (pH 6,0-7,6):
- aerobowe, chemolitautotrofy: Gallionella ferruginea (bakteria ta tworzy „ochrę” – żółtą glinkę zawierającą uwodniony
Fe(OH)3, w środowisku obojętnym jony Fe3+ nie są stabilne i wytrącają się w postaci wodorotlenków)
- aerobowe ale również mikroaerofilne, chemoorganotrofy: Metallogenium, Leptothrix discophora, Siderocapsa – nazywane
również bakteriami żelazowo-manganowymi, gdyż odkładają utlenione formy żelaza i manganu w postaci tlenków lub
wodorotlenków na zewnątrz bądź wewnątrz komórki. Złogi te nadają komórkom lub koloniom tych bakterii zabarwienie
czerwonobrązowe (kolor rdzy). Warstwa wodorotlenku chroni komórkę przed dużym stężeniem jonów żelaza. Uważa się, że
mikroorganizmy te wytwarzają nadtlenek wodoru, który utlenia jony żelaza i manganu. Proces przebiega w obecności
katalazy, również wydzielanej przez te bakterie.
Bakterie powodujące redukcję jonów Fe3+:
Bacillus, Pseudomonas, Desulfovibrio, Geobacter - żelazo może być wykorzystywane jako końcowy akceptor elektronów w procesie
beztlenowym, lub redukcja żelaza może być wynikiem reakcji z końcowymi produktami metabolizmu komórkowego jak mrówczan
lub siarkowodór.
Shewanella putrefaciens – zdolna do przeprowadzenia dysymilacyjnej redukcji Fe3+; bakteria ta w warunkach beztlenowych
wykorzystuje octan jako źródło węgla i donor protonów oraz żelazo (III) jako akceptor elektronów (oddychanie żelazowe). Powstała
mieszanina Fe(II) i Fe(III) przekształca się w Fe3O4 (magnetyt) – związek o silnych właściwościach ferromagnetycznych.
Charakterystyka bakterii At. ferrooxidans
Gram-ujemne bakterie wyodrębnione przez Colmera i Hinkla w 1947r. Kształt krótkich pałeczek o rozmiarach 0,5 - 1,0 μm z jedną
polarną rzęską. Ściana komórkowa posiada złożoną strukturę, która reguluje przenikalność substratów i produktów metabolizmu
poprzez wiązanie i zatrzymywanie cząsteczek i jonów. Bakterie te posiadają zdolność utleniania zredukowanych związków siarki
(S2O32-, S2), a nawet siarki elementarnej (wolniejsza kinetyka procesu niż u At. thiooxidans) do jonów siarczanowych. Jednak
najbardziej charakterystyczne dla tych bakterii jest utlenianie jonów żelaza(II) do żelaza(III). U At. ferrooxidans utlenianie Fe2+ i S2zachodzi jednocześnie (utlenianie siarczku żelaza), co wymaga współistnienia i działania na zewnętrznej osłonie komórki dwóch
systemów enzymatycznych oksydazy żelazowej i oksydazy siarczkowej.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Biotechnologia ogólna dla kierunku biologia, inżynieria środowiska od 2014/2015
ĆWICZENIE 3, 4 OCENA AKTYWNOŚCI UTLENIAJĄCEJ BAKTERII ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS
Proces utleniania Fe(II) przez bakterie At. ferrooxidans przebiega 105-106 razy szybciej niż proces chemiczny, a ilość energii
wydzielająca się w tej reakcji jest większa od ilości energii wydzielającej się w czasie utleniania siarczków i tiosiarczków.
4FeSO4 + 2H2SO4 + O2 → 2Fe2(SO4)3 + 2H2O
ΔH 300C = -38 kJxmol-1
At. ferrooxidans należą do chemoautotrofów. Reakcje utleniania jonów Fe2+ i jonów S2- sprzężone są z reakcjami fosforylacji
oksydacyjnej i energia magazynowana jest w wysokoenergetycznych wiązaniach ATP. Rozwój At. ferrooxidans najlepiej przebiega
przy pH około 2,0-3,6 a zanika przy pH = 4,5 . Optymalna temperatura wzrostu około 28-300C. Ponieważ są to bakterie aerobowe
ich hodowla wymaga ciągłego napowietrzania.
Utlenianie żelaza przez At. ferrooxidans
Utlenianie jonów żelaza (II) i transport elektronów przez
błonę cytoplazmatyczną jest procesem enzymatycznym.
Proces adsorpcji jonów żelaza przebiega po zewnętrznej
stronie błony komórkowej. Występujące w niej anionowe
polimery adsorbują jony żelaza(II) tworząc kompleks.
Istotnym składnikiem tego kompleksu są jony siarczanowe,
których obecność jest konieczna do procesu bakteryjnego
utleniania Fe2+. Szybkość procesu bioutleniania wzrasta
wraz ze wzrostem stężenia jonów Fe2+, maleje zaś ze
wzrostem stężenia jonów Fe3+.
Utleniania żelaza(II) nie jest hamowane nawet przez duże
stężenie jonów miedzi, niklu, co może wskazywać, że
miejsca wiązania żelaza nie są dostępne dla tych kationów.
Po związaniu Fe(II) w siarczano-organiczny kompleks ulega
ono utlenieniu przez oksydazę żelazową. Powstałe
elektrony zostają przekazane do Fe (II) oksydoreduktazy
cytochromowej, a następnie do cytochromu C. Kolejnym nośnikiem elektronów jest cząsteczka białka rustycyjanina, która może
przenosić elektrony z Fe(II) oksydoreduktazy cytochromowej i cytochromu c do oksydazy cytochromowej (cytochrom aa3).
Mechanizm ten umożliwia transport elektronów przez błonę cytoplazmatyczną ściany komórkowej do wnętrza komórki. Ze
zredukowanego cytochromu c elektrony są przekazywane do oksydazy cytochromowej aa3, która reaguje z O 2 i jonami H+, co
prowadzi do utworzenia cząsteczki wody [rysunek 7.3].
Transport jonów wodorowych do wnętrza komórki przez ścianę komórkową tłumaczy model chemiosmotyczny Mitchella. Zakłada
ona, że aktywność łańcucha oddechowego komórek powoduje przepływ H przez selektywnie nieprzepuszczalną dla nich
membranę. Powoduje to wytworzenie w obrębie membrany gradientu stężenia H i potencjału elektrostatycznego. Wiązanie
protonów w komórce (tworzenie cząsteczki wody) powoduje ciągłe podtrzymywanie gradientu pH, który komórki wykorzystują
do syntezy ATP (fosforylacja oksydacyjna).
Bioutlenianie manganu
Utlenianie związków manganu przez mikroorganizmy przebiega głównie w glebie i w roztworach wodnych. Gdy migrujące jony
Mn2+ osiągają obszar o wysokim potencjale oksydacyjno-redukcyjnym oraz o małym stężeniu substancji organicznych, dochodzi
do bioutlenienia Mn(II) do Mn(IV). Szybkość utleniania manganu(II) i żelaza(II) zależy od pH. Proces utleniania staje się intensywny
po przekroczeniu wartości pH 8,5.
Można wyróżnić cztery podstawowe mechanizmy enzymatycznego bioutleniania manganu(II):
Utlenianie jonów Mn2+ w roztworze z udziałem takich mikroorganizmów, jak chemolitotrofy: Leptothrix discophora. Atom tlenu
jest wykorzystywany jako akceptor elektronu:
Mn2+ + 1/2O2 + H2O = MnO2 + 2H+
Utlenianie jonów Mn2+ połączonych z Mn(IV), np. na powierzchni tlenków żelazowo-manganowych:
Mn∙MnO3 + 1/2O2 + 2H2O = 2H2MnO3
Utlenianie manganu(II) w obecności H2O2 i katalazy jako enzymu. Takie mikroorganizmy jak: Metallogenium, Leptothrix
pseudoochracea i Arthrobacter siderocapsulatus tak szybko wytwarzają nadtlenek wodoru, że enzym katalaza nie jest w stanie go
rozłożyć. Dochodzi wówczas do utleniania manganu(II) nadtlenkiem wodoru:
Mn2+ + H2O = MnO2 + 2H+
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Biotechnologia ogólna dla kierunku biologia, inżynieria środowiska od 2014/2015
ĆWICZENIE 3, 4 OCENA AKTYWNOŚCI UTLENIAJĄCEJ BAKTERII ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS
Samoutlenienie Mn2+, gdy Eh (potencjał oksydacyjno-redukcyjny) jest większy niż 500 mV lub pH większe niż 8. Warunki
samoutleniania manganu trudniej osiągnąć niż warunki samoutleniania żelaza.
Mikroorganizmy magnetotaktyczne
Bakteria magnetotaktyczna jest mikroaerofilem, który produkuje wewnątrz komórki
magnetyczne nanocząstki Fe3O4 lub Fe3S4 poprzez kompleksowy proces biomineralizacji.
Należą do nich: Magnetospirillum magnetotacticum, Magnetospirillum gryphiswaldense i
Magnetobacterium bavaricum.
W komórkach tych bakterii dochodzi do biosyntezy magnetosomów. Są to łańcuchy
nanocząstek magnetytu (Fe3O4) lub greigitu (Fe3S4) otoczone błoną złożoną
z fosfolipidów, białek i glikolipidów. Rozmiar magnetycznych nanocząstek mieści się w
zakresie od 30 do 120 nm. Łańcuszki są ułożone wzdłuż osi komórki bakteryjnej dzięki
czemu staje się ona dipolem i może reagować na działanie pola magnetycznego Ziemi.
W mechanizmie transportu żelaza przez błonę cytoplazmatyczną do wnętrza komórki,
biorą czynny udział syderofory (związki chemiczne o charakterze chelatującym) oraz białka
peryplazmatyczne i białka receptorowe, które są zlokalizowane po obu stronach błony
cytoplazmatycznej. Proces transportu zaczyna się od utworzenia kompleksu żelaza z
syderoforem wydzielonym przez komórkę. Następnie kompleks żelazo-syderofor łączy się z białkiem receptorowym. Żelazo
oddziela się od syderoforu i przechodzi przez błonę cytoplazmatyczną. Wewnątrz komórki następuje redukcja żelaza(III) do
żelaza(II).
Nieenzymatyczne utlenianie jonów żelaza
Wiele mikroorganizmów może utleniać żelazo(II) w sposób nieenzymatyczny w wyniku zmiany potencjału redoks (Eh) lub pH
środowiska. Wszystkie mikroorganizmy, których działanie powoduje wzrost pH środowiska przez zużywanie soli kwasów
organicznych lub tworzenie soli amonowych z białek, sprzyjają procesowi utleniania żelaza(II).
Przykładem są następujące reakcje:
R – CH(NH2)COOH + H2O + 1/2O2 = R – C(O) – COOH + NH4+ + OHaminokwas
ketonokwas
-
C3H5O3 + 3O2 = 3CO2 + 2H2O + OHmleczan
Działanie mikroorganizmów światłolubnych, takich jak cyjanobakterie (sinice) i algi może sprzyjać procesowi utleniania żelaza(II)
przez dostarczenie dodatkowej ilości tleniu powstającego w procesie fotosyntezy lub przez zwiększenie pH środowiska.
Obserwowany wzrost wartości pH można wyjaśnić następującymi reakcjami:
2HCO3- = CO32- + CO2 + H2O
CO32- + H2O = HCO3- + OH-
Wykonanie ćwiczenia
1. Hodowla bakterii At. ferrooxidans
Hodowlę prowadzi się w pożywce 9K Silvermana i Lundgrena - zwanej inaczej pożywką 9K, która zawiera 9 g żelaza w 1dm3
roztworu. Pożywkę Silvermana i Lundgrena sporządza się mieszając dwa oddzielnie przygotowane i wyjałowione roztwory, w
proporcji 7: 3 (I i II roztwór).
I roztwór w 70 cm 3 H2O
(NH4)2SO4
- 0,3 g
KCl
- 0,01 g
K2HPO4
- 0,05 g
MgSO4 x 7H2O - 0,05 g
Ca(NO3)2
- ślad
Pożywkę sterylizuje się przez 20 min. w autoklawie.
II roztwór w 30 cm3 H2O
FeSO4 x 7H2O
- 4,42 g
10n H2SO4
- 0,1 cm3
Pożywkę sterylizuje się filtrując przez sączek celulozowy 0,45 µm..
2.
Wykonanie ćwiczenia.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Biotechnologia ogólna dla kierunku biologia, inżynieria środowiska od 2014/2015
ĆWICZENIE 3, 4 OCENA AKTYWNOŚCI UTLENIAJĄCEJ BAKTERII ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS
2.1. Sporządzić roztwór II - w ilości wskazanej przez prowadzącego, używając kolby stożkowej o pojemności 100 cm3. Do tak
przygotowanego roztwór II wlać odpowiednią ilość roztworu I (dostarczonego przez prowadzącego) – tak aby proporcja
roztworu I do II wynosiła 7: 3.
Wymieszane roztwory wysterylizować w zestawie do filtracji próżniowej przez sączek celulozowy 0,45µm.
2.2. Do dwóch sterylnych kolb o pojemności 100 cm3 wlać po 50 cm3 przygotowanej wcześniej pożywki 9K
Do nalewania pożywki używać cylindrów miarowych.
2.3. Do jednej kolby wprowadzić 1 cm³ aktywnej hodowli bakterii A. ferrooxidans dostarczonej przez prowadzącego. Do drugiej
kolby wprowadzić kryształek, lub niewielką ilość sproszkowanego tymolu – będzie to układ kontrolny.
Do pobierania hodowli bakteryjnej używać sterylnych pipet szklanych lub jednorazowych.
Kolby zatkać korkami z waty lub ligniny, które należy wykonać samemu.
2.4. Opisać kolby wg wzoru:
HODOWLA: imię i nazwisko; nr grupy, kierunek i rok studiów; data nastawienia hodowli; rodzaj użytych bakterii.
KONTROLA: imię i nazwisko; numer grupy, kierunek i rok studiów; data nastawienia hodowli.
2.5. W obydwu kolbach oznaczyć zawartość jonów Fe2+ i Fe3+ metodą podaną poniżej. Po wykonaniu pomiarów, opisane kolby
odstawić na miejsce wskazane przez prowadzącego
2.6. Oznaczenie powtórzyć po tygodniu. Po zakończeniu ćwiczenia należy umyć używane szkło laboratoryjne.
2.7. Wyniki muszą być podpisane przez prowadzącego. Dopiero po ich zaakceptowaniu można wylać zawartość kolb i umyć je.
2.8. Opracowanie wyników.
Na podstawie uzyskanych wyników wykreślić zmianę zawartości jonów Fe2+ i Fe3+ w obydwu układach metodą słupkową.
Znając ilość utlenionego żelaza wyliczyć ilość energii zmagazynowanej w ATP, w oparciu o równanie reakcji utleniania żelaza.
3. Oznaczanie zawartości jonów Fe2+ i Fe3+.
3.1. Oznaczenie przeprowadzić metodą kompleksometryczną, miareczkując roztwór z jonami żelaza roztworem EDTA wobec
wskaźnika, którym jest roztwór kwasu sulfosalicylowego.
3.2. Do dwóch kolb stożkowych o pojemności 50 cm3 (kolbki do miareczkowania) wprowadzić po 1 cm3 hodowli (pipeta
automatyczna) i po 10cm3 wskaźnika (jeżeli w roztworze są obecne jony Fe3+ to powinien się on zabarwić na kolor bordowy).
Kolby ogrzewać do temp. 800C (widoczne pęcherzyki gazu), a następnie gorące roztwory miareczkować 0,025M roztworem
EDTA do odbarwienia na kolor słomkowy. Zanotować ilości a cm3 EDTA. Następnie do kolb dodać niewielką ilość nadsiarczanu
amonu do zmiany barwy na bordową i powtórnie miareczkować EDTA – b cm3.
Ilość nadsiarczanu amonu powinna być tak dobrana, żeby po zakończonym miareczkowaniu i wprowadzeniu śladowej ilości
utleniacza barwa roztworu nie uległa zmianie.
3.3. Powyższe czynności powtórzyć dla próby kontrolnej.
3.4. Ze wzorów obliczyć zawartość jonów Fe2+ i Fe3+ w 1 dm3 badanego roztworu:
A g/dm3 Fe3+ = a cm3 x 1.396
B g/dm3 Fe2+ = b cm3 x 1.396
UWAGA!!!
4.
-
roztwory pobierać sterylnymi pipetami
Literatura:
Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; 1998
Russel S.; Biotechnologia; Wyd. PWN; Warszawa; 1990
Kowal K., Libudzisz Z.; Mikrobiologia techniczna, Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000
Ostrowski M., Sokołowska A., Małe bakterie wielka miedź – czytelnia (B.W. ul. Oleska).
Sadowski Z., Biogeochemia – wybrane zagadnienia, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2005.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba