Biotechnologia ogólna dla kierunku biotechnologia wersja 1.2

Biotechnologia ogólna dla kierunku biotechnologia wersja 1.2
OCENA AKTYWNOŚCI UTLENIAJĄCEJ BAKTERII ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS
Reakcje żelaza z udziałem mikroorganizmów
-
Żelazo i mangan występują zarówno w związkach
nieorganicznych (minerały) jak i związkach organicznych. Oba
te pierwiastki są ważnymi składnikami litosfery.
Mikroorganizmy, które biorą udział w reakcjach
utleniania/redukcji żelaza można podzielid na następujące
grupy:
- Acidofilne
chemoautotroficzne
mikroorganizmy
utleniające żelazo w kwaśnym środowisku (Acidithiobacillus
ferrooxidans, Leptospirillum ferrooxidans, Sulfolobus i
Gallionella),
- Mikroorganizmy utleniające zarówno żelazo, jak i mangan
w środowisku słabo kwaśnym (Metallogenium, Leptothrix,
Siderocapsa) – nazywane również bakteriami żelaza,
żelazobakteriami lub bakteriami żalazowo-manganowymi, gdyż odkładają utlenione formy żelaza i manganu w postaci
tlenków lub wodorotlenków na zewnątrz bądź wewnątrz komórki. Złogi te nadają komórkom lub koloniom tych bakterii
zabarwienie czerwonobrązowe (kolor rdzy). Warstwa wodorotlenku chroni komórkę przed dużym stężeniem jonów żelaza.
Uważa się, że mikroorganizmy te wytwarzają nadtlenek wodoru, który utlenia jony żelaza i manganu. Proces przebiega w
obecności katalazy, również wydzielanej przez te bakterie.
3+
Bakterie powodujące redukcję jonów Fe (Bacillus, Pseudomonas, Desulfovibrio i Thiobacillus).
Bakterie chemoautotroficzne utleniające żelazo
Gram-ujemne bakterie wyodrębnione przez Colmera i Hinkla w 1947r. Kształt krótkich pałeczek o rozmiarach 0,5z1,0 μm z jedną
polarną rzęską. Błona komórkowa ma liczne wewnątrzkomórkowe wgłębienia. Bakterie te posiadają zdolnośd utleniania różnych
22związków siarki, a nawet siarki elementarnej do jonów siarczanowych. Spośród związków siarki jony S 2O3 i S są utleniane
+
najszybciej. Najbardziej charakterystyczne dla tych bakterii jest utlenianie jonów żelaza(II) w środowisku H do żelaza(III) gdyż
ilośd energii wydzielająca się w tej reakcji jest większa od ilości energii wydzielającej się w czasie utleniania siarczków i
tiosiarczków.
ΔH 300C = -38 kJxmol-1
4FeSO4 + 2H2SO4 + O2 → 2Fe2(SO4)3 + 2H2O
2-
2-
Bakterie te utleniają również siarczki metali, w których utlenieniu ulega zarówno S do SO4 jak i jon metalu. At. ferrooxidans
2+
2należą do chemoautotrofów. Reakcje utleniania jonów Fe i jonów S sprzężone są z reakcjami fosforylacji i energia
magazynowana jest w wysokoenergetycznych wiązaniach ATP. Energia ta jest następnie wykorzystywana do chemolizy wody.
Powstający przy tym czynnik zredukowany *H+, redukuje produkt asymilacji CO 2 . Czynnik utleniony [OH], redukowany jest przez
ten sam związek nieorganiczny. Rozwój At. ferrooxidans najlepiej przebiega przy pH około 2,0-2,5 a zanika przy pH = 4,5 .
0
Optymalna temperatura wzrostu około 30 C. Ponieważ są to bakterie aerobowe ich hodowla wymaga ciągłego napowietrzania .
Utlenianie jonów żelaza (II) może byd reakcją
enzymatyczną. Enzymatyczny mechanizm utleniania
żelaza (II) przez Acidithiobacillus ferrooxidans wymusza
2+
bezpośredni kontakt jonów Fe
z komórką
mikroorganizmu. Dla wyjaśnienia tego zjawiska przyjęto
hipotezę chemiosmotyczną. Zakłada ona, że elektrony
2+
zostają przekazane od jonów Fe
do Fe (II)
oksydoreduktazy
cytochromowej
następnie
do
cytochromu C. Kolejnym nośnikiem elektronów jest
cząsteczka białka rustycyjanina, która może przenosid
elektrony z oksydoreduktazy cytochromowej i
cytochromu c do oksydazy cytochromowej. Mechanizm
ten umożliwia transport elektronów przez błonę
cytoplazmatyczną
ściany
komórkowej.
Ze
zredukowanego
cytochromu
c
elektrony
są
przekazywane do oksydazy cytochromowej aa3, która
+
reaguje z O2 i jonami H , co prowadzi do utworzenia cząsteczki wody *rysunek 7.3+
Proces adsorpcji jonów żelaza lub manganu przebiega po zewnętrznej stronie błony komórkowej. Anionowe polimery
wytwarzane przez wiele bakterii mogą adsorbowad jony żelaza(II), a w środowisku obojętnym także powstałe hydroksykationy
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba; dr Teresa Farbiszewska
Biotechnologia ogólna dla kierunku biotechnologia wersja 1.2
OCENA AKTYWNOŚCI UTLENIAJĄCEJ BAKTERII ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS
2+
+
2+
Fe (III): Fe(OH) i Fe(OH)2 . Szybkośd procesu bioutleniania wzrasta wraz ze wzrostem stężenia jonów Fe , maleje zaś ze
3+
wzrostem stężenia jonów Fe .
Mikroorganizmy, które są w stanie wiązad jony żelaza we wnętrzu komórki nazywamy mikroorganizmami magnetotaktycznymi.
Należą do nich: Magnetospirillum magnetotacticum, Magnetospirillum gryphiswaldense i Magnetobacterium bavaricum. W
komórkach tych bakterii dochodzi do biosyntezy nanocząstek magnetytu (Fe 3O4). Kryształ tych nanocząstek przypomina
regularne sześciany. Są one ułożone wzdłuż komórki, co sprawia, że komórki bakterii reagują na działanie ziemskiego pola
magnetycznego. W mechanizmie transportu żelaza przez błonę cytoplazmatyczną do wnętrza komórki, oprócz syderoforów
biorą czynny udział białka peryplazmatyczne i białka receptorowe, które są zlokalizowane po obu stronach błony
cytoplazmatycznej. Proces transportu zaczyna się od utworzenia kompleksu żelaza z syderoforem wydzielonym przez komórkę.
Następnie kompleks żelazo-syderofor łączy się z białkiem receptorowym. Żelazo oddziela się od syderoforu i przechodzi przez
błonę cytoplazmatyczną. Wewnątrz komórki następuje redukcja żelaza(III) do żelaza(II).
Nieenzymatyczne utlenianie jonów żelaza
Wiele mikroorganizmów może utleniad żelazo(II) w sposób nieenzymatyczny w wyniku zmiany potencjału redoks lub pH
środowiska. Wszystkie mikroorganizmy, których działanie powoduje wzrost pH środowiska przez zużywanie soli kwasów
organicznych lub tworzenie soli amonowych z białek, sprzyjają procesowi utleniania żelaza(II).
Przykładem są następujące reakcje:
+
R – CH(NH2)COOH + H2O + 1/2O2 = R – C(O) – COOH + NH4 + OH
aminokwas
ketonokwas
C3H5O3
mleczan
-
+ 3O2 = 3CO2 + 2H2O + OH
Działanie mikroorganizmów światłolubnych, takich jak cyjanobakterie (sinice) i algi może sprzyjad procesowi utleniania żelaza (II)
przez dostarczenie dodatkowej ilości tleniu powstającego w procesie fotosyntezy lub przez zwiększenie pH środowiska.
Obserwowany wzrost wartości pH można wyjaśnid następującymi reakcjami:
-
2-
2HCO3 = CO3 + CO2 + H2O
2CO3 + H2O = HCO3 + OH
Wykonanie dwiczenia
1. Nastawienie hodowli bakterii At. ferrooxidans
3
Hodowlę prowadzi się w pożywce 9K Silvermana i Lundgrena - zwanej inaczej pożywką 9K, która zawiera 9 g żelaza w 1dm
roztworu. Pożywkę Silvermana i Lundgrena sporządza się mieszając dwa oddzielnie przygotowane i wyjałowione roztwory, w
proporcji 7: 3 (I i II roztwór).
3
I roztwór w 70 cm H2O
(NH4)2SO4
- 0,3 g
KCl
- 0,01 g
K2HPO4
- 0,05 g
MgSO4 x 7H2O - 0,05 g
Ca(NO3)2
- ślad
Pożywkę sterylizuje się przez 20 min. w autoklawie.
3
II roztwór w 30 cm H2O
FeSO4 x 7H2O
10n H2SO4
Pożywkę sterylizuje się przez filtrację
- 4,42 g
3
- 0,1 cm
3
1.1. Sporządzid roztwór II w kolbie stożkowej o pojemności 100 cm . Do tak przygotowanego roztwór II wlad odpowiednią ilośd
roztworu I (dostarczonego przez prowadzącego) – tak aby proporcja roztworu I do II wynosiła 7: 3.
Wymieszane roztwory wysterylizowad w zestawie do filtracji próżniowej przez sączek celulozowy 0,45µm.
W tym celu należy zamontowad zestaw do filtracji na kolbie filtracyjnej. Przy zamkniętym przepływie nałożyd pincetą
filtr celulozowy jak na rysunku obok. Zamontowad lejek i podłączyd wężem kolbę filtracyjną z pompą próżniową.
Przy otwartym przepływie wlewamy pożywkę (II roztwór) do lejka i włączamy pompę. Po zakooczeniu filtracji należy
przelad zawartośd kolby filtracyjnej do kolby użytej wcześniej do sporządzenia roztworu 9K.
Cały zestaw do filtracji należy dokładnie umyd i pozostawid do wyschnięcia na bibule.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba; dr Teresa Farbiszewska
Biotechnologia ogólna dla kierunku biotechnologia wersja 1.2
OCENA AKTYWNOŚCI UTLENIAJĄCEJ BAKTERII ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS
3
1.2. Połowę objętości wystarylizowanej pożywki 9K (50 cm ) przelad do drugiej kolbki stożkowej takiej samej pojemności.
Do nalewania pożywki używad cylindrów miarowych.
1.3. Do jednej kolby wprowadzid 1 cm³ aktywnej hodowli bakterii A. ferrooxidans dostarczonej przez prowadzącego. Do drugiej
kolby wprowadzid kryształek, lub niewielką ilośd sproszkowanego tymolu – będzie to układ kontrolny.
Do pobierania hodowli bakteryjnej używad sterylnych pipet szklanych lub jednorazowych.
Kolby zatkad korkami z waty lub ligniny, które należy wykonad samemu
1.4. Opisad kolby wg wzoru:
HODOWLA: imię i nazwisko; nr grupy, kierunek i rok studiów; data nastawienia hodowli; rodzaj użytych bakterii.
KONTROLA: imię i nazwisko; numer grupy, kierunek i rok studiów; data nastawienia hodowli.
2+
3+
1.5. W obydwu kolbach oznaczyd zawartośd jonów Fe i Fe metodą podaną poniżej. Po wykonaniu pomiarów, opisane kolby
odstawid na miejsce wskazane przez prowadzącego
1.6. Oznaczenie powtórzyd po tygodniu. Po zakooczeniu dwiczenia należy umyd używane szkło laboratoryjne.
1.7. Wyniki muszą byd podpisane przez prowadzącego. Dopiero po ich zaakceptowaniu można wylad zawartośd kolb i umyd je.
2+
3+
2. Oznaczenie zawartości jonów Fe i Fe
2.1. Oznaczenie przeprowadzid metodą kompleksometryczną, miareczkując roztwór z jonami żelaza roztworem EDTA wobec
wskaźnika, którym jest roztwór kwasu sulfosalicylowego.
3
3
2.2. Do dwóch kolb stożkowych o pojemności 50 cm (kolbki do miareczkowania) wprowadzid po 1 cm hodowli (pipeta
3
3+
automatyczna) i po 10cm wskaźnika (jeżeli w roztworze są obecne jony Fe to powinien się on zabarwid na kolor bordowy).
0
Kolby ogrzewad do temp. 80 C (widoczne pęcherzyki gazu), a następnie gorące roztwory miareczkowad 0,025M roztworem
3
EDTA do odbarwienia na kolor słomkowy. Zanotowad ilości a cm EDTA. Następnie do kolb dodad niewielką ilośd
3
nadsiarczanu amonu do zmiany barwy na bordową i powtórnie miareczkowad EDTA – b cm .
Ilośd nadsiarczanu amonu powinna byd tak dobrana, żeby po zakooczonym miareczkowaniu i wprowadzeniu śladowej ilości
utleniacza barwa roztworu nie uległa zmianie.
2.3. Powyższe czynności powtórzyd dla próby kontrolnej.
2+
3+
3
2.4. Ze wzorów obliczyd zawartośd jonów Fe i Fe w 1 dm badanego roztworu:
3
3+
3
3
2+
3
A g/dm Fe = a cm x 1.396
B g/dm Fe = b cm x 1.396
UWAGA!!!
roztwory pobierad sterylnymi pipetami
3. Opracowanie wyników.
2+
3+
Na podstawie uzyskanych wyników wykreślid zmianę zawartości jonów Fe i Fe w obydwu układach metodą słupkową.
Znając ilośd utlenionego żelaza wyliczyd ilośd energii zmagazynowanej w ATP, w oparciu o równanie reakcji utleniania żelaza.
4.
Zagadnienia teoretyczne:
-
Reakcje żelaza i manganu z udziałem mikroorganizmów
Chemosynteza i autotrofizm.
Charakterystyka bakterii At. ferrooxidans
Miareczkowanie kompleksometryczne.
Umiejętnośd wyliczania ilości utlenionego żelaza.
Nieenzymatyczne utlenianie jonów żelaza
5.
Literatura:
-
Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; 1998
Russel S.; Biotechnologia; Wyd. PWN; Warszawa; 1990
Kowal K., Libudzisz Z.; Mikrobiologia techniczna, Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000
Ostrowski M., Sokołowska A., Małe bakterie wielka miedź – czytelnia (B.W. ul. Oleska).
Sadowski Z., Biogeochemia – wybrane zagadnienia, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2005.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba; dr Teresa Farbiszewska