Wpływ temperatury i czasu sterylizacji termicznej na generowanie

&ARM0RZEGL.AUK†
7PŒYWTEMPERATURYICZASUSTERYLIZACJITERMICZNEJ
NAGENEROWANIEWOLNYCHRODNIKÌWWDIAZOTANIEIZOSORBITOLU
%FFECTOFTEMPERATUREANDTIMEOFTHERMALSTERILIZATIONONFORMATION
OFFREERADICALSINISOSORBIDEDINITRATE
0AWEŒ2AMOS"ARBARA0ILAWA
+ATEDRAI:AKŒAD"IOFIZYKI7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJW3OSNOWCU
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Abstract
Wolne rodniki generowane są w substancjach leczniczych
podczas sterylizacji termicznej. Celem niniejszej pracy
jest określenie wpływu warunków sterylizacji termicznej
na koncentrację i właściwości wolnych rodników w diazotanie izosorbitolu. W pracy zbadano również wpływ czasu
przechowywania leku na koncentrację wolnych rodników
w diazotanie izosorbitolu. Porównano oddziaływania magnetyczne w leku sterylizowanym w różnych warunkach.
Metodą ciągłego nasycenia mikrofalowego wyznaczono
rodzaj poszerzenia linii EPR testowanego leku. Sterylizację termiczną przeprowadzono zgodnie z obowiązującymi normami. Wolne rodniki w diazotanie izosorbitolu
zbadano z zastosowaniem spektroskopii elektronowego
rezonansu paramagnetycznego (EPR) na pasmo X (9.3
GHz). Dla wszystkich ogrzewanych próbek diazotanu izosorbitolu rejestrowano widma EPR. Wykazano, że układ
wolnych rodników w sterylizowanym termicznie leku
ma charakter złożony. Wolne rodniki w sterylizowanym
termicznie leku rozmieszczone są jednorodnie. W diazotanie izosorbitolu sterylizowanym zachodzą szybkie procesy relaksacji spin-sieć. Koncentracja wolnych rodników
w diazotanie izosorbitolu sterylizowanym termicznie jest
z zakresu 2.5x1016-5.4x1016 spin/g, a jej wartość zależy
od temperatury i czasu sterylizacji. Koncentracja wolnych
rodników w diazotanie izosorbitolu zmienia się wraz
z czasem przechowywania próbki po sterylizacji.
Free radicals are formed in drugs during thermal sterilization. The aim of this work is to determine influence of
thermal sterilization on concentration and properties of
free radicals in the analyzed isosorbide dinitrate. Effect of
the storage time on free radical concentration in the drug
sterilized at different conditions was tested. Magnetic
interactions in the drug sterilized at different conditions
were studied. Type of broadening of EPR lines for the
thermally sterilized drug was analyzed by continuous microwave saturation method. Sterilization was performed
according to the norms. Free radicals were studied by the
use of an X-band (9.3 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. EPR spectra were obtained for
the all heated samples. Complex character of free radical
system in the analysed drug was proved. Free radicals in
the sterilized drug are homogeneously distributed. Fast
spin-lattice relaxation processes exist in the isosorbide dinitrate. Free radical concentrations in isosorbide dinitrate
are in the range 2.5x1016-5.4x1016 spin/g. Free radical
concentration depends on temperature and time of sterilization. Free radical concentration depends on storage
time of the drug after sterilization.
Key words: isosorbide dinitrate, thermal sterilization,
free radicals, EPR spectroscopy
Słowa kluczowe: diazotan izosorbitolu, sterylizacja termiczna, wolne rodniki, spektroskopia EPR
Wstęp
Wolne rodniki mogą powstawać podczas rozpadu homolitycznego wiązań chemicznych w cząsteczkach, co
prowadzi do występowania niesparowanych elektronów
w układzie [1]. Wolne rodniki generowane są w wyniku działania światła, promieniowania jonizującego, wysokiej temperatury i niektórych katalizatorów [1-5]. Trwałość wolnych
rodników organicznych jest zróżnicowana [1-5]. Stabilność
wolnych rodników zależy od ich struktury chemicznej oraz
od warunków fizykochemicznych charakteryzujących otoczenie próbki. Wysoką trwałość stwierdzono w przypadku
wolnych rodników w jednostkach aromatycznych [1]. Czas
życia wolnych rodników rośnie wraz z obniżeniem temperatury oraz po usunięciu tlenu z otoczenia próbki [1].
Wolne rodniki w organizmach żywych występują
zarówno w stanach prawidłowych jak i patologicznych
[6]. W naturalnych warunkach w zdrowym organizmie,
wolne rodniki powstają podczas procesu utleniania biologicznego w łańcuchu oddechowym w mitochondriach,
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
w przebiegu niektórych reakcji enzymatycznych katalizowanych przez enzymy, podczas autooksydacji związków biologicznie czynnych oraz w procesach fagocytozy
[6]. Reakcje wolnorodnikowe towarzyszą przemianom
ksenobiotyków w organizmie [7]. Wolne rodniki powstają w procesach enzymatycznej hydroksylacji niektórych
leków [7].
Warunkiem prawidłowego funkcjonowania organizmu
jest regulacja poziomu wolnych rodników w tkankach [7].
Brak równowagi pomiędzy powstawaniem i usuwaniem
wolnych rodników z organizmu może stanowić przyczynę
destrukcji struktur biologicznych. Wolne rodniki oddziałują
negatywnie na białka, kwasy nukleinowe, inaktywują enzymy oraz niszczą błony komórkowe [7].
Reakcje wolnorodnikowe mają duże znaczenie w wielu
stanach chorobowych i procesach zachodzących w organizmach [7]. Wolne rodniki odgrywają rolę w stanach zapalnych, chorobie niedokrwiennej serca, chorobach genetycznych i nowotworowych, niewydolności oddechowej, chorobach neurologicznych, chorobach przewodu pokarmowego
oraz w procesach starzenia się organizmów [7].
Metodą stosowaną do badania wolnych rodników jest
spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) [6]. W niniejszej pracy metodę EPR wykorzystano w poszukiwaniu optymalnych warunków sterylizacji
termicznej diazotanu izosorbitolu. Celem wykonanych badań jest określenie wpływu temperatury i czasu sterylizacji
termicznej na koncentrację i właściwości wolnych rodników
w diazotanie izosorbitolu. Wyznaczono warunki sterylizacji
termicznej diazotanu izosorbitolu, którym towarzyszy generowanie minimalnej ilości wolnych rodników w próbce.
Materiały i metody
O2N
O
O
O
O
NO2
Ryc. 1. Wzór strukturalny diazotanu izosorbitolu [10].
W pracy wyznaczano następujące parametry widm EPR
(Ryc. 2): amplitudę (A), intensywność integralną (I), szerokość linii (∆Bpp) oraz współczynnik rozszczepienia spektroskopowego g.
Jako wzorzec koncentracji wolnych rodników zastosowano ultramarynę, wykazującą wysoką stabilność występujących w niej centrów paramagnetycznych. W celu zwiększenia dokładności pomiaru zastosowano również kryształ
rubinu, jako tzw. wzorzec wewnętrzny. Dla każdej analizowanej próbki i ultramaryny rejestrowano sygnał EPR rubinu. Dla linii EPR kryształu rubinu wyznaczono amplitudę.
Koncentracja wolnych rodników w badanych próbkach
N (spin/g) została wyznaczona według wzoru:
N = nu(IpAruWu)/(IuArpWpm)
gdzie: nu - ilość centrów paramagnetycznych w ultramarynie (1.2 x 1019 spin); Ip, Iu – intensywność integralna
dla krzywej absorpcji rezonansowej próbki i ultramaryny;
Arp, Aru - amplituda linii EPR rubinu rejestrowanej przy tym
samym wzmocnieniu dla próbki i ultramaryny; Wp, W u
- wzmocnienie dla próbki i ultramaryny; m - masa próbki.
W pracy analizowano kształt widm EPR w celu potwierdzenia hipotezy o złożonym układzie wolnych rodników w sterylizowanym termicznie diazotanie izosorbitolu.
Dla widm rejestrowanych w zakresie mocy mikrofalowej
2.2-70 mW wyznaczono następujące parametry asymetrii
linii EPR: A1/A2, A1-A2, B1/B2 oraz B1-B2 (Ryc. 2). Parametry te określają asymetrię w różnych kierunkach widma
EPR.
W pracy zbadano wolne rodniki w diazotanie izosorbitolu, który został poddany sterylizacji termicznej zgodnie z obowiązującymi normami [8-9]. Lek sterylizowano
w temperaturze 160 oC, 170 oC i 180 oC w czasie ogrzewania
wynoszącym odpowiednio 120 minut, 60 minut i 30 minut.
Sterylizację przeprowadzono w suszarce z wymuszonym
termoobiegiem powietrza. Wzór
strukturalny diazotanu izosorbitolu
przedstawia Rycina 1 [10]. Lek zakupiono w Firmie SIGMA. Próbki
miały postać sproszkowaną.
Widma leku rejestrowano z wykorzystaniem spektrometru elektronowego rezonansu paramagnetycznego na pasmo X (9.3 GHz) Firmy
RADIOPAN-Poznań. Częstotliwość
promieniowania mikrofalowego rejestrowana była miernikiem MCM
101 Firmy EPRAD-Poznań.
Widma EPR mierzono w postaci
pierwszej pochodnej absorpcji przy
wysokim tłumieniu 15 dB (2.2 mW),
aby uniknąć nasycenia mikrofalowego linii. Całkowita moc mikrofalowa Ryc. 2. Widmo EPR zarejestrowane w postaci pierwszej pochodnej absorpcji
wytwarzana przez klistron wynosiła z zaznaczoną amplitudą linii (A), szerokością linii (ΔB ), rezonansową indukcją
pp
70 mW.
magnetyczną (B ) oraz parametrami asymetrii linii: A , A , B i B .
r
1
2
1
2
&ARM0RZEGL.AUK
wają na amplitudę (A), szerokość
(ΔBpp) i intensywność integralną
(I) linii EPR. Zależność amplitudy,
szerokości i intensywności integralnej linii EPR od temperatury i czasu
sterylizacji termicznej diazotanu izosorbitolu przedstawiono w Tabeli 1.
Amplituda (A) linii EPR rośnie
wraz ze wzrostem temperatury sterylizacji dla stosowanych czasów tego
procesu (Tabela 1). Szerokość linii
(ΔBpp) maleje wraz ze wzrostem temperatury sterylizacji dla stosowanych
czasów ogrzewania leku (Tabela 1).
Intensywność integralna (I) maleje
wraz ze wzrostem temperatury sterylizacji dla stosowanych czasów
ogrzewania (Tabela 1).
Stwierdzono, że koncentracja
Ryc. 3. Widmo EPR diazotanu izosorbitolu sterylizowanego w temperaturze
wolnych
rodników w diazotanie izo180 °C przez 30 minut zarejestrowane w temperaturze pokojowej z mocą mikrofasorbitolu
maleje wraz ze wzrostem
lową wynoszącą 2.2. mW.
temperatury sterylizacji dla stosowanych czasów ogrzewania (Tabela I).
Analizie poddano również wpływ mocy mikrofalowej
Średnia wartość współczynnika rozszczepienia spektrona amplitudę i szerokość linii EPR w celu określenia spo- skopowego g (+0.0002) dla badanych próbek diazotanu izosobu rozmieszczenia wolnych rodników w sterylizowanym sorbitolu wynosiła odpowiednio: 1.9980 (dla 160 °C i 120
termicznie leku.
minut), 1.9970 (dla 170 °C i 60 minut) oraz 2.0082 (dla 180
°C i 30 minut).
Wyniki
Badano również wpływ czasu przechowywania leku
na parametry widm EPR i koncentrację wolnych rodniDla wyjściowych nieogrzewanych próbek diazotanu ków w diazotanie izosorbitolu sterylizowanym termicznie.
izosorbitolu nie rejestrowano widm EPR. Widma EPR reje- W Tabeli I porównano parametry widm EPR oraz koncenstrowano dla wszystkich próbek diazotanu izosorbitolu ste- trację wolnych rodników w diazotanie izosorbitolu sterylirylizowanych termicznie. Widma EPR otrzymano dla leku zowanym termicznie w temperaturach 160 °C (120 minut),
sterylizowanego w temperaturze 160 °C przez 120 minut, 170 °C (60 minut) oraz 180 °C (30 minut) dla pomiarów
w temperaturze 170 °C przez 60 minut oraz w temperaturze wykonanych 10 minut po sterylizacji, 5 dni oraz 10 dni po
180 °C przez 30 minut. Przykładowe widmo EPR diazotanu sterylizacji. Stwierdzono, że parametry widm EPR i koncenizosorbitolu sterylizowanego w 180 °C przez 30 minut dla tracja wolnych rodników w badanym leku zależą od czasu
pomiaru wykonanego przy niskiej mocy mikrofalowej po- przechowywania próbki. Koncentracja wolnych rodników
kazano na Rycinie 3.
w leku sterylizowanym w temperaturze 160 °C maleje wraz
Stwierdzono, że warunki sterylizacji termicznej wpły- z czasem przechowywania próbki (Tabela 1). W przypadTab. I. Amplituda (A), intensywność integralna (I) i szerokość (ΔBpp) linii EPR oraz koncentracja (N) wolnych rodników
w sterylizowanym termicznie diazotanie izosorbitolu. Dane dotyczą widm EPR rejestrowanych 10 minut, 5 dni oraz 10 dni
po sterylizacji termicznej. Pomiary wykonano w temperaturze pokojowej przy mocy mikrofalowej wynoszącej 2.2 mW
Parametry widm EPR i
koncentracja wolnych
rodników
A [j.wzgl.]
(+ 0.1)
I [j.wzgl.]
(+ 0.1)
ΔBpp [mT]
(+ 0.02)
N x 1016 [spin/g]
(+ 0.1 x 1016)
160 °C (120minut)
Czas po sterylizacji
Warunki sterylizacji
170 °C (60minut)
Czas po sterylizacji
180 °C (30minut)
Czas po sterylizacji
10
minut
5 dni
10 dni
10 minut
5 dni
10 dni
10 minut
5 dni
10 dni
2.6
1.9
1.7
3.1
3.4
3.7
4.1
5.3
4.5
1.7
1.3
1.3
1.2
1.4
1.8
0.9
1.9
1.5
0.53
0.50
0.60
0.38
0.50
0.62
0.43
0.57
0.53
5.4
3.4
4.4
3.1
2.5
4.1
2.9
4.1
3.1
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
DIAZOTAN IZOSORBITOLU
1,2
1
A1/A2
0,8
160°C/120min.
0,6
170°C/60min.
180°C/30min.
0,4
0,2
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
M/Mo
DIAZOTAN IZOSORBITOLU
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
-0,005
A1-A2 [j.wzgl.]
-0,01
-0,015
160°C/120min.
170°C/60min.
-0,02
180°C/30min.
-0,025
-0,03
-0,035
-0,04
M/Mo
DIAZOTAN IZOSORBITOLU
1,2
1
B1/B2
0,8
160°C/120min.
170°C/60min.
0,6
180°C/30min.
0,4
0,2
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0,8
0,9
1
M/Mo
DIAZOTAN IZOSORBITOLU
0,05
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
ku diazotanu izosorbitolu sterylizowanego
w temperaturach 170 °C i 180 °C koncentracja wolnych rodników po kilku dniach od sterylizacji jest większa aniżeli kilka minut po
przeprowadzeniu tego procesu (Tabela 1).
Przeprowadzona analiza kształtu widm
EPR diazotanu izosorbitolu sterylizowanego termicznie pozwoliła stwierdzić iż niezależnie od warunków sterylizacji widma EPR
wykazują zawsze dużą asymetrię kształtu
(Ryc. 3). Kształt widm EPR wszystkich badanych próbek silnie zależy od mocy mikrofalowej.
Wszystkie analizowane parametry kształtu linii EPR: A1/A2 (a), A1-A2 (b), B1/B2 (c),
oraz B1-B2 (d) dla sterylizowanego diazotanu izosorbitolu zależą od mocy mikrofalowej. Zależności parametrów A1/A2 (a), A1A2 (b), B1/B2 (c) oraz B1-B2 (d) kształtu linii
EPR diazotanu izosorbitolu sterylizowanego
w temperaturach 160 °C, 170 °C i 180 °C
pokazano na Rycinie 4. Zmiana parametrów
kształtu widm EPR wraz z mocą mikrofalową wskazuje na złożony charakter układu
wolnych rodników w próbkach diazotanu
izosorbitolu sterylizowanego termicznie.
Zbadano również wpływ mocy mikrofalowej na amplitudę i szerokość linii EPR
diazotanu izosorbitolu sterylizowanego
termicznie. Parametry widm EPR wszystkich badanych próbek diazotanu izosorbitolu zależą od mocy mikrofalowej. Wpływ
mocy mikrofalowej na amplitudę (A) linii
EPR diazotanu izosorbitolu sterylizowanego w temperaturach 160 °C (120 minut),
170 °C (60 minut) oraz 180 °C (30 minut)
przedstawiono na Rycinie 5. Wpływ mocy
mikrofalowej na szerokość (ΔBpp) linii EPR
diazotanu izosorbitolu sterylizowanego
w temperaturach 160 °C (120 minut), 170
°C (60 minut) oraz 180 °C (30 minut) przedstawiono na Rycinie 6.
Amplituda linii EPR diazotanu izosorbitolu sterylizowanego termicznie, niezależnie od temperatury i czasu sterylizacji,
rośnie wraz ze wzrostem mocy mikrofalowej (Ryc. 5). Nie obserwowano nasycenia mikrofalowego linii EPR (Ryc. 5).
Oznacza to, że w próbkach testowanego
leku zachodzą szybkie procesy relaksacji
spin-sieć.
B1-B2 [mT]
-0,05
160°C/120min.
170°C/60min.
-0,1
180°C/30min.
-0,15
-0,2
-0,25
M/Mo
Ryc. 4. Zależność parametrów asymetrii A1/
A2 (a), A1-A2 (b), B1/B2 (c) orza B1-B2 (d)
widm EPR diazotanu izosorbitolu sterylizowanego w temperaturze 160 °C przez 120
minut, 170 °C przez 60 minut i 180 °C przez
30 minut od mocy mikrofalowej (M). Mo –
maksymalna moc mikrofalowa (70 mW).
&ARM0RZEGL.AUK
[11]. Struktura chemiczna diazotanu izosorbitolu pokazana na Rycinie 1 [10] nie posiada niesparowa0,08
nych elektronów.
0,07
W wysokiej temperaturze dochodzi
do zerwania wiązań che0,06
micznych w leku, co prowadzi do
0,05
160°C/120min.
wytworzenia wolnych rodników
170°C/60min.
0,04
i rejestracji widm EPR (Ryc. 3).
180°C/30min.
Poziomy energetyczne niespa0,03
rowanych elektronów wolnych
0,02
rodników ulegają rozszczepieniu
0,01
zeemanowskiemu w polu magnetycznym wytworzonym przez elek0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
tromagnes [11]. Po dostarczeniu
(M/Mo )1/2
energii promieniowania mikrofalowego do leku sterylizowanego
Ryc. 5. Wpływ mocy mikrofalowej (M) na amplitudę (A) linii EPR diazotanu izoumieszczonego między biegunami
sorbitolu sterylizowanego w temperaturze 160 °C przez 120 minut, 170°C przez
elektromagnesu zachodzi rezonan60 minut i 180 °C przez 30 minut. Mo – maksymalna moc mikrofalowa (70 mW).
sowe pochłanianie promieniowania
elektromagnetycznego, elektrony
wolnych rodników są przenoszone
DIAZOTAN IZOSORBITOLU
na wyższe poziomy energetyczne,
1
a następnie powracają na poziomy
0,9
podstawowe w wyniku zjawisk relaksacji [11]. Rezonansowe pochła0,8
nianie mikrofal przez wolne rodniki
0,7
leku pozwala określić lokalizację
0,6
160°C/120min.
niesparowanych elektronów w wol0,5
170°C/60min.
nych rodnikach próbki, ich koncen180°C/30min.
0,4
trację oraz właściwości.
0,3
W przypadku diazotanu izosor0,2
bitolu stwierdzono, że energia ter0,1
miczna w temperaturze 160 °C jest
0
już wystarczająca do wytworzenia
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
wolnych rodników w leku (Ryc. 3,
(M/Mo )1/2
Tabela 1). Wraz ze wzrostem temperatury sterylizacji dostarczamy
Ryc. 6. Wpływ mocy mikrofalowej (M) na szerokość (ΔBpp) linii EPR diazotanu
próbce więcej ciepła w jednostce
izosorbitolu sterylizowanego w temperaturze 160 °C przez 120 minut, 170 °C przez
czasu, powstaje więc większa ilość
60 minut i 180 °C przez 30 minut. Mo – maksymalna moc mikrofalowa (70 mW).
wolnych rodników, jednakże wzrasta równocześnie prawdopodobieńSzerokość linii EPR diazotanu izosorbitolu sterylizo- stwo ich spotkania, a więc prawdopodobieństwo rekombiwanego termicznie dla wszystkich stosowanych temperatur nacji. Reakcje rekombinacji dużej ilości wolnych rodników
lekko rośnie wraz ze wzrostem mocy mikrofalowej (Ryc. 5). w diazotanie izosorbitolu sterylizowanym w temperaturach
Jest to zależność charakterystyczna dla wolnych rodników 170 °C i 180 °C prowadzą poprzez sparowanie elektronów do
rozmieszczonych jednorodnie w próbce [11].
spadku koncentracji wolnych rodników w próbce (Tabela 1).
Zjawisko spadku koncentracji wolnych rodników w diaDyskusja
zotanie izosorbitolu ogrzewanym w temperaturach 170 °C
i 180 °C jest zdecydowanie korzystne dla procesu jego steryPrzeprowadzone badania diazotanu izosorbitolu nie- lizacji. Lek zawierający mniejsze ilości wolnych rodników
ogrzewanego i poddanego obróbce termicznej z zastosowa- będzie powodował zdecydowanie mniejsze efekty uboczne
niem spektroskopii elektronowego rezonansu paramagne- w organizmie człowieka podczas farmakoterapii. Biorąc pod
tycznego wykazały, że analizowany lek wyjściowy nie jest uwagę wykonane w pracy analizy spektroskopowe diazotaparamagnetyczny, a lek sterylizowany termicznie niezależ- nu izosorbitolu sterylizowanego zgodnie z normami [8-9]
nie od warunków procesu posiada właściwości paramagne- w różnych warunkach można wskazać optymalne warunki
tyczne. Zgodnie z oczekiwaniami nie otrzymano widm EPR sterylizacji tego leku. Zgodnie z norami [8-9] w diazotanie
w przypadku leku niesterylizowanego. W zjawisku EPR po- izosorbitolu sterylizowanym we wszystkich trzech analizolegającym na rezonansowym pochłanianiu promieniowania wanych warunkach (160 °C i 120 minut, 170 °C i 60 mimikrofalowego biorą udział jedynie niesparowane elektrony nut oraz 180 °C i 30 minut) nie występują mikroorganizmy,
∆Bpp [mT]
A [j.wzgl.]
DIAZOTAN IZOSORBITOLU
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
a więc produkt jest sterylny. Jednakże optymalnymi warunkami sterylizacji diazotanu izosorbitolu jest ogrzewanie
leku w temperaturze 180 °C w czasie 30 minut, ponieważ w
tak otrzymanej próbce występuje najmniejsza koncentracja
wolnych rodników (Tabela 1).
W niniejszej pracy stwierdzono, że podczas przechowywania diazotanu izosorbitolu sterylizowanego termicznie
zachodzą zmiany koncentracji wolnych rodników w leku
(Tabela 1) oraz zmiany parametrów widm EPR przechowywanego leku (Tabela 1). Zmiany te mogą być spowodowane
oddziaływaniami z tlenem.
Badania EPR z ciągłym nasyceniem mikrofalowym linii
wykazały, że wolne rodniki w sterylizowanym termicznie diazotanie izosorbitolu są rozmieszczone jednorodnie. Obserwowano
charakterystyczne dla takiego rozmieszczenia wolnych rodników w próbce zależności amplitudy (Ryc. 5) i szerokości linii
EPR (Ryc. 6) od mocy mikrofalowej. Można więc stwierdzić, że
proces sterylizacji termicznej przeprowadzono prawidłowo, lek
ogrzewany był w całej swojej objętości równomiernie. Nasycenie mikrofalowe widm EPR można zaproponować jako test do
sprawdzenia przebiegu procesu sterylizacji w próbce.
We wszystkich próbkach analizowanego leku występują
głównie wolne rodniki z niesparowanym elektronem zlokalizowanym na atomie tlenu o charakterystycznych wysokich
wartościach współczynnika rozszczepienia spektroskopowego g (1.9970-2.0082).
W diazotanie izosorbitolu sterylizowanym w temperaturze
160 °C (120 minut), 170 °C (60 minut) i 180 °C (30 minut) wolne rodniki są rozmieszczone blisko siebie. Rejestrowano szerokie
linie EPR (Ryc. 3) charakterystyczne dla niewielkich odległości
pomiędzy niesparowanymi elektronami, co daje silne oddziaływania dipolowe spin-spin poszerzające widma EPR.
W diazotanie izoserbitolu zachodzą szybkie procesy
relaksacji spin-sieć, ponieważ nie obserwowano nasycenia
mikrofalowego linii EPR nawet przy mocy mikrofalowej
wynoszącej 70 mW (Ryc. 5).
Układ wolnych rodników diazotanu izosorbitolu sterylizowanego termicznie ma charakter złożony, tzn. występuje w leku kilka rodzajów wolnych rodników. Obserwowano zmiany parametrów kształtu linii EPR diazotanu
izosorbitolu wraz ze wzrostem mocy mikrofalowej (Ryc. 4).
W przypadku próbki zawierającej kilka rodzajów wolnych
rodników linie składowe pochodzące od poszczególnych
grup wolnych rodników zmieniają się z mocą mikrofalową
w odmienny sposób, co w efekcie daje zmianę kształtu sumarycznego widma EPR ze wzrostem mocy mikrofalowej.
Wyniki badań diazotanu izosorbitolu metodą EPR, które
zostały przeprowadzone w niniejszej pracy poszerzyły wiedzę o wolnych rodnikach generowanych w procesie sterylizacji termicznej substancji leczniczych. Po raz pierwszy
zbadano wolne rodniki powstające w sterylizowanym termicznie diazotanie izosorbitolu. Zaproponowano spektroskopię EPR jako metodę przydatną do optymalizacji warunków procesu sterylizacji termicznej leków.
Wnioski
Przeprowadzone badania diazotanu izosorbitolu z zastosowaniem spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego wykazały, że:
1. Sterylizacja termiczna diazotanu izosorbitolu w temperaturach 160 oC (120 minut), 170 oC (60 minut)
oraz 180 oC (30 minut) prowadzi do generowania
wolnych rodników, a ich koncentracja w leku maleje
wraz ze wzrostem temperatury sterylizacji.
2. Wykazano, że w sterylizowanym termicznie diazotanie izosorbitolu układ wolnych rodników ma charakter złożony, wolne rodniki rozmieszczone są jednorodnie zachodzą silne oddziaływania dipolowe oraz
szybkie procesy relaksacji spin-sieć.
3. Spektroskopię EPR można zaproponować jako technikę przydatną do optymalizacji warunków sterylizacji termicznej diazotanu izosorbitolu.
Praca wykonana w ramach badań statutowych (umowa
nr KNW-1-142/09) w Śląskim Uniwersytecie Medycznym
w Katowicach.
Piśmiennictwo
1. Bartosz G. Druga twarz tlenu. Wydawnictwo naukowe
PWN. Warszawa 2006.
2. Ramos P i wsp. Effect of heating at 180 oC on paramagnetic properties of diclofenac – EPR studies. Eng of
Biomater 2009; XII(87): 7-12.
3. Ramos P, Pepliński P, Pilawa B. Free radicals in thermally sterilized verapamil. Eng of Biomater 2009;
XII(89-91): 162-164.
4. Krztoń i wsp. FT-IR and EPR studies of changes of chemical structure of ampicyline during thermal sterilization. Eng of Biomater 2009; XII(89-91): 153-156.
5. Wilczyński S i wsp. Application of EPR spectroscopy to
examination of gamma-irradiated erythromycin. Farm
Przegl Nauk 2009; 9(56): 9-11.
6. Jóźwiak Z, Bartosz G. Biofizyka. Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa 2005.
7. Jaroszyk F. Biofizyka. Wydawnictwo Lekarskie PZWL.
Warszawa 2001.
8. Farmakopea Polska, wydanie VIII. PTFarm. Warszawa
2009.
9. PN-EN 556. Sterylizacja wyrobów medycznych. Wymagania wyrobów medycznych określanych jako sterylne.
10. Zejca A. Chemia leków. Wydawnictwo Lekarskie
PZWL. Warszawa 2004.
11. Wertz JE, Bolton JR. Electron Spin Resonance Theory
and Practical Applications. New York, London 1986.
data otrzymania pracy: 24.02.2010 r.
data akceptacji do druku: 13.05.2010 r.
Adres do korespondencji:
dr n. med. Paweł Ramos
Katedra i Zakład Biofizyki
ul. Jedności 8, 41-200 Sosnowiec
tel. 792 280 882
e-mail: [email protected]