Pobierz bezpłatnie artykuł w formie PDF

Krzysztof Chiżyński, *Tadeusz Pietrucha
Klinika Kardiologii Instytutu Kardiologii Akademii Medycznej w Łodzi
*Pracownia Biotechnologii Medycznej Zakładu Biochemii Akademii Medycznej w Łodzi
Hemostatyczne czynniki ryzyka
choroby niedokrwiennej serca (cz. IV).
Gen PAI-1. Polimorfizmy w genie PAI-1
Hemostatic risk factors in ischaemic heart disease (p. IV).
PAI-1 gene. PAI-1 polymorphisms
PAI-1 gene is localisated in chromosome 7 in locus
7q21,3–22 and has the length 12,5 103 base pairs.
The most interesting polymorphism is the 4G/5G
polymorphism. PAI-1 4G/5G promoter genotype is
established by polymerase chain reaction (PCR) amplification of genomic DNA using the allele specific
primers: insertion 5G allele; 5´-GTC TGG ACA GGG
GG-3`, deletion 4G allele; 5´-GTC TGG ACA GGG GA-3`
each in a separate PCR reaction together with common downstream primer 5´-TGC AGC CAG CCA CGT
GAT TGT CTA G-3’ and a control upstream primer
5´-AAG CTT TTA CCA TGG TAA CCC CTG GT-3` to verify the occurence of DNA amplification in the absence of the allele on the genomic DNA.
´
Key words: PAI-1 gene, PAI-1 polymorphisms,
ischemic heart disease, myocardial infarction
GEN PAI-1
Gen dla PAI-1 jest zlokalizowany w chromosomie 7.
w locus 7q21,3–22 i ma długość około 12,5 kilo par zasad [1]. Poznanie jego sekwencji rozpoczęło się od sklonowania i sekwencjonowania cDNA przez kilka niezależnych grup badawczych [2–5].
Na podstawie zapisu cDNA ustalono sekwencję aminokwasową białka. Dwa lata później poznano sekwencję pełnego genu z flankami około 2 kpz po obu stronach [6] (GenBank ID: J03764), określając jego rzeczywiste i potencjalne
regiony funkcyjne, wewnątrzgenowe powtórzenia i inne
szczególne sekwencje. Między sekwencjami otrzymanymi
przez różne zespoły istnieją pewne niezgodności dotyczące pojedynczych zasad, przynajmniej niektóre z nich odzwierciedlają rzeczywisty polimorfizm genu PAI-1.
Gen struktury zawiera 9 egzonów poprzedzielanych
8 intronami. Egzony mają długość od 84 do 1871 par zasad. W najdłuższym, 9. egzonie pierwsze 33 zasady ulegają jeszcze translacji (C-koniec białka i kodon stop TGA),
reszta to nieulegający procesowi translacji region 3'.
Komputerowa analiza regionu promotorowego ujawniła istnienie wielu sekwencji wykazujących podobieństwo
do sekwencji wzmacniających (enhancerowych) innych
genów [6]. Wykazano potencjalny udział części z nich
w transkrypcji poprzez wiązanie swoistych białek, które są
być może specyficznymi czynnikami transkrypcyjnymi lub
represorami. Bardzo interesujący jest odcinek między zasadami –1520 i –1008 ze względu na wysoką (81%) homologię z fragmentem (od –3491 do –2977 zasady) genu
tkankowego aktywatora plazminogenu (t-PA, tissue plasminogen activator) [7]. Uwzględniając powiązanie funkcjonalne tych dwóch białek, można wnioskować o wzajemnym powiązaniu regulacji ekspresji ich genów. Być może
jest to jeden z mechanizmów utrzymywania równowagi
w hemostazie. Jak dotąd, nie wykazano jednak udziału
tego regionu w regulacji transkrypcji genu PAI-1 [8].
Ekspresję genu PAI-1 można regulować na poziomie
transkrypcji [9]. Do czynników stymulujących zmiany
w poziomie ekspresji PAI-1 należą różnorodne związki
endo- i egzogenne. Są to między innymi: czynnik wzrostu
EGF (endothelial growth factor) [10, 11], glukokortykoidy
[12], estrogeny [13], insulina [14], cytokiny –– TGF-b [15],
Adres do korespondencji: dr med. Krzysztof Chiżyński
Klinika Kardiologii IK AM, Szpital im. Sterlinga
ul. Sterlinga 1/3, 91– 425 Łódź, e-mail: [email protected]
Copyright „ 2001 Via Medica, ISSN 1425–3674
[email protected]
59
Forum Kardiologów 2001, tom 6, nr 2
TNF-a [16,17], niektóre interleukiny [15, 18, 19], trombina [20, 21], cholesterol frakcji LDL i VLDL [22, 23], nienasycone kwasy tłuszczowe [24], estry forbolu [25, 26], kwas
masłowy [27], endotoksyna [19], prostaglandyny [28].
Dzięki zastosowaniu techniki EMSA (electrophoresis
mobility shift assay) zaobserwowano, że elementem
genu PAI-1 wiążącym białka z rodziny NFkB podczas stymulacji TGF-b jest odcinek we fragmencie od –680 do
–670 zasady, będący miejscem występowania polimorfizmu 4G/5G. Ta sama sekwencja jest zaangażowana
w pobudzenie ekspresji przez IL-1 (interleukine-1) [15].
Z przeprowadzonych badań wynika, że TGF-b i IL-1 są
ważnymi mediatorami zwiększonej ekspresji genu PAI1 w reakcji ostrej fazy [15, 18]. Aktywowanie ekspresji
genu PAI-1 przez trombinę (wywołującą również ekspresję t-PA) angażuje właśnie IL-1, która zapoczątkowuje
proces transkrypcji [21].
Zmienność molekularna genu PAI-1 może być jednym
z czynników wyjaśniających zróżnicowaną reakcję poszczególnych osobników na warunki środowiska. Do chwili obecnej wykryto 8 rodzajów polimorfizmu w genie PAI-1.
POLIMORFIZMY W GENIE PAI-1
1. Polimorfizm w pozycji –844 (G/A)
Pozycja –844 znajduje się w obrębie sekwencji, która jest charakterystyczna dla miejsca wiązania białka jądrowego Ets (CGAGGAAGTG). Rodzina białek Ets uczestniczy w regulacji ekspresji genów biorących udział w licznych i różnorodnych procesach biologicznych, między
innymi takich, jak: kontrola wzrostu, transformacja, aktywacja limfocytów T [29]. Badania przeprowadzone
przez Grubic i wsp. [30] potwierdziły, że obszar, w którym występuje ten polimorfizm, oddziałuje z białkami
ekstraktu jądrowego pochodzącego z ludzkich naczyniowych komórek endotelialnych (HUVEC, human vascular
endothelial cells). Mimo że wykazano specyficzność tego
oddziaływania, nie zidentyfikowano białka, które tworzy kompleks z tym obszarem DNA. Oddziaływanie to
zachodziło w porównywalny sposób z allelami zawierającymi zarówno G, jak i A w pozycji –844. Jak dotąd, nie
stwierdzono widocznego wpływu zmienności w pozycji
–844 na aktywność PAI-1 [31].
2. Polimorfizm w pozycji –675 (4G/5G)
Badania przeprowadzone in vitro wskazują, że osobniki homozygotyczne, które posiadają allele 4G, charakteryzują się podwyższonym stężeniem PAI-1 w osoczu [32, 33].
Wpływ polimorfizmu 4G/5G na regulację ekspresji wynika
prawdopodobnie z faktu, iż znajduje się on w miejscu oddziaływania DNA z układem wzmacniacz (enhancer)-represor [33]. Badania przeprowadzone za pomocą techniki
EMSA wykazały, że allele zawierające sekwencję 4G i 5G
wiążą niezidentyfikowane białko pochodzące z ekstraktu
60
jądrowego komórek linii HepG2. Dodatkowe białko jest
wiązane w tym regionie do alleli zawierających sekwencję
5G, nie jest ono natomiast obecne w del allelach, to znaczy
w allelach pozbawionych 5. nukleotydu guaninowego.
Pewne wstępne dane sugerują, że białka te należą prawdopodobnie do rodziny białek regulatorowych NFkB. Allele del
wytwarzają 6 razy więcej mRNA PAI-1 po stymulacji interleukiną-1 (IL-1) w porównaniu z allelami zawierającymi sekwencję 5G. Dane te sugerują, że polimorfizm 4G/5G może
bezpośrednio wpływać na kontrolę procesu regulacji ekspresji genu PAI-1. Polimorfizm PAI-1 4G/5G wykrywa się
techniką polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR — polymerase chain protection). Startery reakcji PCR są tak dobrane, że proces amplifikacji DNA następuje w zależności od
tego, czy występuje genotyp 4G lub 5G. Jeśli badany pacjent
posiada genotyp będący homozygotą 4G, to reakcja PCR
zachodzi wyłącznie w probówce zawierającej starter dla 4G,
nie zachodzi natomiast w probówce zawierającej starter 5G.
Analogicznie dzieje się w przypadku homozygoty 5G. Jeśli
badany pacjent posiada genotyp będący heterozygotą,
wówczas reakcja amplifikacji zachodzi w obu probówkach.
Stosuje się primery: 5G: 5’-GTCTGGACACGTGGGGG i 4G:
5’-GTCTGGACACGTGGGGA-, a także wspólny downstream
primer: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTTGTCTAG- i kontrolny upstream primer: AAGCTTTTACCATGGTAACCCCTGGT-.
3. Powtarzające się sekwencje CA w promotorze
Zmienna ilość powtórzeń sekwencji CA w promotorze występuje w pozycji –156, rozpoczynając od miejsca
startu transkrypcji. Polimorfizm ten odkryli Mansfield
i wsp. [34]. Przypuszcza się, że może on wywierać wpływ
na ekspresję PAI-1, stymulowaną takimi czynnikami jak
glukokortykoidy, jednak sugestia ta wymaga potwierdzenia dalszymi badaniami [34].
4. Powtarzające się sekwencje CA w intronie 4.
Sekwencje powtarzające się (CA)n po raz pierwszy
w intronie 4. wykryli Dawson i wsp. [35]. Zmienność ta nie
wpływa znacząco na stężenie PAI-1 w przypadku cukrzycy
i jej powikłania, jakim jest retinopatia [34], nie stanowi też
genetycznego wskaźnika tych zaburzeń [34]. Badania obejmujące grupę pacjentów z przebytym zawałem serca
(przed 45 rż.) wykazały, że również w tym przypadku częstość zmienności jest podobna jak w grupie kontrolnej [35].
Jednakże jej występowaniu towarzyszyło podwyższenie
stężenia PAI-1 w osoczu chorych, jak również, chociaż
w mniejszym zakresie, u osób z grupy kontrolnej [35].
5. Polimorfizm w pozycji +9785 G/A
Miejsce występowania zmienności +9785A/G znajduje się w intronie 7. genu PAI-1, w odległości 82 zasad przed
alternatywnym (próbnym) miejscem wycinania sekwen-
[email protected]
Gen PAI-1. Polimorfizmy w genie PAI-1
cji niekodujących w procesie dojrzewania mRNA (splicing)
i w odległości 111 zasad od pierwszego nukleotydu kodującego aminokwas wchodzący w skład centrum aktywnego PAI-1 [36]. Nie wydaje się jednak, aby ten polimorfizm wpływał na poziom i regulację ekspresji genu.
Słowa kluczowe: gen PAI-1, polimorfizmy genu
PAI-1, choroba niedokrwienna serca, zawał serca
6. Polimorfizm w pozycji +11053 G/T
PIŚMIENNICTWO
1. Klinger K.W., Winqvist R., Riccio A., Andreasen P.A., Sartorio R., Nielsen L.S., Stuart N., Stanislovitis P., Watkins P.,
Douglas R. Plasminogen activator inhibitor type 1 gene is
located at region q21.3–q22 of chromosome 7 and genetically linked with cystic fibrosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1987; 84: 8548–8552.
2. Pannekoek H., Veerman H., Lambers H., Diergaarde P., Verweij C.L., van Zonneveld A.J., van Mourik J.A. Endothelial
plasminogen activator inhibitor (PAI): a new member of the
Serpin gene family. EMBO J 1986; 5: 2539–2544.
3. Ny T., Sawdey M., Lawrence D., Millan J.L., Loskutoff D.J.
Cloning and sequence of a cDNA coding for the human
beta-migrating endothelial-cell-type plasminogen activator
inhibitor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986; 83: 6776–6780.
4. Ginsburg D., Zeheb R., Yang A.Y., Rafferty U.M., Andreasen
P.A., Nielsen L., Dano K., Lebo R.V., Gelehrter T.D. cDNA
cloning of human plasminogen activator-inhibitor from
endothelial cells. J. Clin. Invest 1986; 78: 1673–1680.
5. Wun T.C., Kretzmer K.K. cDNA cloning and expression in E. coli
of a plasminogen activator inhibitor (PAI) related to a PAI produced by Hep G2 hepatoma cell. FEBS Lett 1987; 210: 11–16.
6. Bosma P.J., van den Berg E.A., Kooistra T., Siemieniak D.R.,
Slightom J.L. Human plasminogen activator inhibitor-1
gene. Promoter and structural gene nucleotide sequences.
J. Biol. Chem. 1988; 263: 9129–9141.
7. Strandberg L., Lawrence D., Ny T. The organization of the
human-plasminogen-activator-inhibitor-1 gene. Implications on the evolution of the serine-protease inhibitor family. Eur. J. Biochem. 1988; 176: 609–616.
8. Bosma P.J., Kooistra T., Siemieniak D.R., Slightom J.L. Further characterization of the 5'-flanking DNA of the gene
encoding human plasminogen activator inhibitor-1. Gene
1991; 100: 261–266.
9. Ginsburg D. Regulation of PAI-1 gene expression. Thromb.
Haemost. 1991; 65: 740.
10. Thalacker F.W., Nilsen-Hamilton M. Opposite and independent actions of cyclic AMP and transforming growth factor beta in the regulation of type 1 plasminogen activator
inhibitor expression. Biochem. J. 1992; 287: 855–862.
11. Hopkins W.E., Westerhausen D.R., Fujii S., Billadello J.J.,
Sobel B.E. Mediators of induction of augmented expression
of plasminogen activator inhibitor type-1 in Hep G2 cells by
platelets. Thromb. Haemost. 1991; 66: 239–245.
12. Heaton J.H., Kathju S., Gelehrter T.D. Transcriptional and
posttranscriptional regulation of type 1 plasminogen activator inhibitor and tissue-type plasminogen activator gene
expression in HTC rat hepatoma cells by glucocorticoids and
cyclic nucleotides. Mol. Endocrinol. 1992; 6: 53–60.
13. Fujimoto J., Hori M., Ichigo S., Tamaya T. Sex steroids regulate the expression of plasminogen activator inhibitor-1 and
its mRNA in fibroblasts derived from uterine endometrium.
Ann. Clin. Biochem. 1996; 33: 545–550.
14. Fattal P.G., Schneider D.J., Sobel B.E., Billadello J.J. Posttranscriptional regulation of expression of plasminogen
activator inhibitor type 1 mRNA by insulin and insulin-like
growth factor 1. J. Biol. Chem. 1992; 267: 12412–12415.
15. Dawson S.J., Wiman B., Hamsten A., Green F., Humphries
S., Henney A.M. The two allele sequences of a common polymorphism in the promoter of the plasminogen activator
Występuje w końcu 3' genu, w obszarze nieulegającym
procesowi translacji [31]. Ponieważ wykryto go na podstawie porównania sekwencji genu PAI-1 uzyskanego przez
różne zespoły badawcze, nie wiadomo, czy jest to rzeczywisty polimorfizm, czy też błąd sekwencyjny. W sekwencji
genu w tej pozycji występuje według zespołu Stranberga T
[7], natomiast według Bosmy i wsp. — G [6].
7. +11319 insercja/delecja 9-nukleotydowej
sekwencji
Zmienność ta znajduje się również w końcu 3' genu,
w obszarze nieulegającym procesowi translacji [31].
8. RFLP Hind III (Restriction Fragment Lenght
Polymorphism)
Znajduje się w końcu 3' genu [35]. Wykrywa się go za
pomocą metody Southern blotting. Rozdzielone na żelu
poliakrylamidowym lub agarozowym fragmenty genomu
ludzkiego, powstałe w wyniku trawienia enzymem restrykcyjnym Hind III, hybrydyzuje się ze znakowaną sondą dla
genu PAI-1. W zależności od obecności lub braku dodatkowego miejsca restrykcyjnego w końcu 3' genu PAI-1,
wykrywa się fragmenty o różnej długości [34].
Gen dla PAI-1 jest zlokalizowany w chromosomie 7.
w locus 7q21.3–22 i ma długość ok.12,5 kpz. Jednym
z najbardziej interesujących polimorfizmów PAI-1 jest
polimorfizm typu 4G/5G, zlokalizowany w promotorze genu. Polimorfizm PAI-1 4G/5G wykrywa się techniką polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR). Startery reakcji PCR są tak dobrane, że proces amplifikacji DNA następuje w zależności od tego, czy występuje genotyp 4G lub 5G. Jeśli badany pacjent posiada genotyp będący homozygotą 4G, to reakcja PCR
zachodzi wyłącznie w probówce zawierającej starter
dla 4G, nie zachodzi natomiast w probówce zawierającej starter 5G. Analogicznie dzieje się w przypadku homozygoty 5G. Jeśli badany pacjent jest heterozygotą, wówczas reakcja amplifikacji zachodzi
w obu probówkach. Stosuje się primery: 5G:
5’-GTCTGGACACGTGGGGG i 4G: 5’-GTCTGGACACGTGGGGA-, a także wspólny downstream primer:
5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTTGTCTAG- i kontrolny upstream primer: AAGCTTTTACCATGGTAACCCCTGGT-.
[email protected]
Praca finansowana przez AM w Łodzi z pracy własnej
nr 502–11–527
61
Forum Kardiologów 2001, tom 6, nr 2
inhibitor-1 (PAI-1) gene respond differently to interleukin-1
in HepG2 cells. J. Biol. Chem. 1993; 268: 10739–10745.
16. Medcalf R.L., Kruithof E.K., Schleuning W.D. Plasminogen
activator inhibitor 1 and 2 are tumor necrosis factor/cachectin-responsive genes. J. Exp. Med. 1988; 168: 751–759.
17. Georg B., Helseth E., Lund L.R., Skandsen T., Riccio A., Dano K., Unsgaard G., Andreasen P.A. Tumor necrosis factoralpha regulates mRNA for urokinase-type plasminogen activator and type-1 plasminogen activator inhibitor in human
neoplastic cell lines. Mol. Cell. Endocrinol. 1989; 61: 87–96.
18. Seki T., Gelehrter T.D. Interleukin-1 induction of type-1 plasminogen activator inhibitor (PAI- 1) gene expression in the
mouse hepatocyte line, AML 12. J. Cell. Physiol. 1996; 168:
648–656.
19. Samad F., Bergtrom G., Amrani D.L. Regulation of plasminogen activation by interleukin-6 in human lung fibroblasts. Biochim. Biophys. Acta 1994; 1221: 307–314.
20. Cockell K.A., Ren S., Sun J., Angel A., Shen G.X. Effect of
thrombin on release of plasminogen activator inhibitor-1
from cultured primate arterial smooth muscle cells. Thromb.
Res. 1995; 77: 119–131.
21. Heaton J.H., Dame M.K., Gelehrter T.D. Thrombin induction
of plasminogen activator inhibitor mRNA in human umbilical vein endothelial cells in culture [see comments]. J. Lab.
Clin. Med. 1992; 120: 222–228.
22. Sironi L., Mussoni L., Prati L., Baldassarre D., Camera M., Banfi C., Tremoli E. Plasminogen activator inhibitor type-1 synthesis and mRNA expression in HepG2 cells are regulated by
VLDL. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1996; 16: 89–96.
23. Etingin O.R., Hajjar D.P., Hajjar K.A., Harpel P.C., Nachman R.L.
Lipoprotein (a) regulates plasminogen activator inhibitor-1
expression in endothelial cells. A potential mechanism in
thrombogenesis. J. Biol. Chem. 1991; 266: 2459–2465.
24. Kariko K., Rosenbaum H., Kuo A., Zurier R.B., Barnathan E.S.
Stimulatory effect of unsaturated fatty acids on the level of
plasminogen activator inhibitor-1 mRNA in cultured human
endothelial cells. FEBS Lett. 1995; 361: 118–122.
25. Arts J., Grimbergen J., Bosma P.J., Rahmsdorf H.J., Kooistra T. Role of c-Jun and proximal phorbol 12-myristate-13-acetate-(PMA)-responsive elements in the regulation
of basal and PMA-stimulated plasminogen-activator inhibitor-1 gene expression in HepG2. Eur. J. Biochem. 1996;
241: 393–402.
26. Knudsen H., Olesen T., Riccio A., Ungaro P., Christensen L.,
Andreasen P.A. A common response element mediates differential effects of phorbol esters and forskolin on type-1
plasminogen activator inhibitor gene expression in human
breast carcinoma cells. Eur. J. Biochem. 1994; 220: 63–74.
62
27. Smith T.J, Piscatelli J.J., Andersen V., Wang H.S., Lance P.
n-Butyrate induces plasminogen activator inhibitor type 1
messenger RNA in cultured Hep G2 cells. Hepatology 1996;
23: 866–871.
28. DiBattista J.A., Martel-Pelletier J., Morin N., Jolicoeur F.C.,
Pelletier J.P. Transcriptional regulation of plasminogen activator inhibitor-1 expression in human synovial fibroblasts
by prostaglandin E2: mediation by protein kinase A and role
of interleukin-1. Mol. Cell. Endocrinol. 1994; 103: 139–148.
29. Wasylyk B., Hahn S.L., Giovane A. The Ets family of transcription factors [published erratum appears in Eur. J. Biochem.
1993 Aug 1; 215 (3): 907]. Eur. J. Biochem. 1993; 211: 7–18.
30. Grubic N., Stegnar M., Peternel P., Kaider A., Binder B.R.
A novel g/a and the 4g/5g polymorphism within the promoter of the plasminogen activator inhibitor-1 gene in patients
with deep vein thrombosis. Thromb. Res. 1996; 84: 431–443.
31. Henry M., Chomiki N., Scarabin P.Y., Alessi M.C., Peiretti F.,
Arveiler D., Ferrieres J., Evans A., Amouyel P., Poirier O.,
Cambien F., Juhan Vague I. Five frequent polymorphisms
of the PAI-1 gene: lack of association between genotypes,
PAI activity, and triglyceride levels in a healthy population.
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1997; 17: 851–858.
32. Ye S., Green F.R., Scarabin P.Y., Nicaud V., Bara L., Dawson S.J., Humphries S.E., Evans A., Luc G., Cambou J.P., Arveiler D., Henney A.M., Cambien F. The 4G/5G Genetic Polymorphism in the Promoter of the Plasminogen Activator Inhibitor-1 (PAI-1) Gene Is Associated with Differences in Plasma
PAI-1 Activity but not with Risk of Myocardial Infarction in
the ECTIM Study. Thromb. Haemost. 1995; 74: 837–841.
33. Eriksson P., Kallin B., van ’t Hooft F.M., Bavenholm P., Hamsten A. Allele-specific increase in basal transcription of the
plasminogen-activator inhibitor 1 gene is associated with
myocardial infarction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92:
1851–1855.
34. Mansfield M.W., Stickland M.H., Carter A.M., Grant P.J.
Polymorphism of the plasminogen activator inhibitor-1
gene in type1 and type 2 diabetes, and in patients with diabetic retinopathy. Thromb. Haemost. 1994; 71: 731–736.
35. Dawson S., Hamsten A., Wiman B., Henney A., Humphries S.
Genetic variation at the plasminogen activator inhibitor-1
locus is associated with altered levels of plasma plasminogen activator inhibitor-1 activity. Arterioscler. Thromb.
1991; 11: 183–190.
36. Andreasen P.A., Riccio A., Welinder K.G., Douglas R., Sartorio R., Nielsen L.S., Oppenheimer C., Blasi F., Dano K. Plasminogen activator inhibitor type-1: reactive center and
amino-terminal heterogeneity determined by protein and
cDNA sequencing. FEBS Lett. 1986; 209: 213–218.
[email protected]