instrukcja 2

LABORATORIUM 2
Oczyszczanie oksydazy polifenolowej (PPO) wyizolowanej z pieczarek – proces wysalania
siarczanem amonu oraz wytrącania acetonem
CEL ĆWICZENIA: Zapoznanie się z przykładową procedurą oczyszczania enzymu poprzez
selektywne wysalanie surowego ekstraktu enzymatycznego z zastosowaniem siarczanu amonu oraz
wytrącanie acetonem.
PRZEBIEG DOŚWIADCZENIA
I. WYSALANIE SIARCZANEM AMONU
Roztwór z poprzednich ćwiczeń = surowy ekstrakt enzymu do wysalania objętość V1=30 mL
(próbka 1)
UWAGA!!!
Przed rozpoczęciem wysalania pobrać próbkę z roztworu wyjściowego (ok. 5 mL), a do procesu
odmierzyć dokładnie 30 mL.
1. I wysolenie przy użyciu NH2SO4 (30% wysycenia)  na 1 L supernatantu dodać 176 g
NH2SO4 i mieszać na mieszadle magnetycznym (4 oC) przez 30 minut;
2. Po tym czasie mieszaninę wirować przez 20 min przy 8000 obr/min w temp. 4oC;
3. Po odwirowaniu OSAD I (próbka 2) rozpuścić w minimalnej ilości (ok. 5-10 mL) 0,1 M
buforu fosforanowego o pH 7.0 i trzymać w lodzie do analityki;
4. SUPERNATANT I (próbka 3) wysalać ponownie NH2SO4;
5. II wysolenie (60% wysycenia)  na 1 L supernatantu dodać 195 g NH2SO4 i mieszać na
mieszadle magnetycznym (4 oC) przez 30 minut;
6. Po tym czasie mieszaninę wirować przez 20 min przy 8000 obr/min w temp. 4oC;
7. Po odwirowaniu OSAD II (próbka 4) rozpuścić w minimalnej objętości 0,1 M buforu
fosforanowego o pH 7.0 (max. 10 – 12 mL !!!);
8. SUPERNATANT II pozostawić do oznaczeń;
9. Wszystkie próbki do momentu oznaczeń przechowywać w lodzie;
10. Koniecznie zapisać objętości wszystkich roztworów !!!;
11. We wszystkich próbkach oznaczyć aktywność tyrozynazy, stężenie białka metodą Lowry’ego
oraz absorbancję przy 280 nm.
Próbka 1  surowy ekstrakt enzymu – aktywność tyrozynazy do oznaczenia;
Próbka 2  osad w buforze po I wysoleniu – brak lub b. niska aktywność tyrozynazy;
Próbka 3  supernantant po I wysoleniu – aktywność tyrozynazy wyższa niż w próbce I –
jest to r-r tyrozynazy do II wysolenia;
Próbka 4  osad w buforze po II wysoleniu – w tej próbce powinna być najwyższa
aktywność tyrozynazy (r-r enzymu oczyszczony ok.2 – 4 razy);
Próbka 5  supernatant po II wysoleniu – brak lub b.b. niska aktywność tyrozynazy.
II. WYTRĄCANIE ACETONEM
Do procesu odmierzyć dokładnie 30 mL.
1. Do surowego ekstraktu enzymu (próbka 1’) dodać acetonu schłodzonego do temperatury
około -20 ºC w proporcji 1:1,5 (enzym:aceton) i umieścić tak sporządzony roztwór w
zamrażalce do czasu utworzenia się wyraźnego osadu (40 minut).
2. Powstałą zawiesinę białka odwirować (20 min przy 8000 obr/min w temp. 4oC).
3. Supernatant odrzucić, a osad rozpuścić w minimalnej objętości 0,1 M buforu fosforanowego o
pH 7.0 (max. 10 – 12 mL !!!)  (próbka 2’).
4. Wszystkie próbki do momentu oznaczeń przechowywać w lodzie;
5. Koniecznie zapisać objętości wszystkich roztworów !!!;
6. We wszystkich próbkach oznaczyć aktywność tyrozynazy, stężenie białka metodą Lowry’ego
oraz absorbancję przy 280 nm.
Próbka 1’ surowy ekstrakt enzymu– aktywność tyrozynazy do oznaczenia;
Próbka 2’ osad w buforze uzyskany po wytrącaniu w acetonie w tej próbce powinna być
najwyższa aktywność tyrozynazy
PRZYGOTOWANIE KOLUMNY DO FILTRACJI ŻELOWEJ (Sephadex G-50, kolumna o obj. 50
mL) – szczegółowe dane poda prowadząca ćwiczenia.
OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ
Pomiar aktywności enzymu natywnego prowadzić w temperaturze pokojowej, w 0,1 M
buforze fosforanowym o pH 7,0 i w obecności 1 mM L-Tyrozyny lub L-DOPA jako substratu. W
procedurze standardowej do 1,0 ml substratu dodać 100 μl roztworu enzymu, szybko zmieszać i
przenieść do kuwety. Następnie przy użyciu spektrofotometru UV/Vis monitorować zmiany
absorbancji w czasie przy długości fali λ= 475 nm.
Przed pomiarami aparat wyzerować na roztwór substratu.
Aktywność enzymu wyrazić liczbą jednostek aktywności w 1 mL roztworu tyrozynazy według
wzoru:
1000
1
U 


 1000 
Aktywność 
 min mL mL 
A475 nm VR

t
VE
(1)
gdzie: ΔA475nm – zmiana absorbancji w czasie Δt, w liniowym zakresie pomiaru przy długości fali
475 nm [min-1]; VR – całkowita objętość analizowanego roztworu (1,1 mL) [mL]; VE – objętość
enzymu użytego w pomiarach (0,1 mL) [mL].
OZNACZANIE STĘŻENIA BIAŁKA
Ilość białka w badanych preparatach tyrozynazy oznaczano metodą Lowry’ego [6] przy
użyciu testu Sigma 5656. Stężenie białka w badanych próbkach wyznaczano na podstawie krzywej
standardowej, wykonanej dla albuminy wołowej w zakresie stężeń od 10 do 400 μg.mL-1.
Procedura postępowania:
- 0.5 ml próbki enzymu odpowiednio rozcieńczonej w wodzie + 0.5 ml odczynnika Lowry’ego;
- przygotować również próbkę zerową 0.5 ml H2O + 0.5 ml odczynnika Lowry’ego;
- tak przygotowane próbki wymieszać i zostawić na 20 min w temperaturze pokojowej;
- po 20 minutach dodać 0,25 ml odczynnika Follina i natychmiast po dodaniu każdą próbkę
dokładnie wymieszać!!!! i odstawić na 30 min;
- po upływie 30 min od dodania odczynnika Follina zmierzyć Abs próbek przy λ=750 nm;
- wynik w [mg.mL-1] obliczyć na podstawie krzywej wzorcowej:
Cbiałka=[(214,1.A750 + 114,6).A750.R]/1000, gdzie R – rozcieńczenie próbki enzymu
PRZYGOTOWANIE ROZTWORÓW
0,1 M bufor fosforanowy o pH 7.0
 5,28 g KH2PO4
 21,91 g Na2HPO4
 Dopełnić wodą destylowaną do 1 L
1 mM L-Tyrozyna (M=181,2 g/mol)
1 mM L-DOPA (M=197,19 g/mol)
NA KOLEJNEJ STRONIE ARKUSZ WYNIKÓW
ARKUSZ WYNIKÓW
WYSALANIE SARCZANEM AMONU
Pomiary aktywności
.
Próbka
Rpróbki
Pomiary stężenia białka
Metoda Lowry’ego
Absorbancja A280
(dA475/min) R
Aktywność
[min-1]
[U.mL-1]
Rpróbki
Cbiałka
.
A280 R
Rpróbki
A750
[mg.mL-1]
1
2
3
4
5
WYTRĄCANIE ACETONEM
Pomiary aktywności
Próbka
Rpróbki
1’
2’
Pomiary stężenia białka
Metoda Lowry’ego
Absorbancja A280
(dA475/min).R
Aktywność
[min-1]
[U.mL-1]
Rpróbki
A280.R
Cbiałka
Rpróbki
A750
[mg.mL-1]