instrukcja 1

LABORATORIUM 1
Izolacja oksydazy polifenolowej (PPO) z pieczarek
CEL
ĆWICZENIA:
Zapoznanie
się
z
przykładową
procedurą
izolowania
enzymu
wewnątrzkomórkowego z materiału pochodzenia roślinnego.
WSTĘP
Oksydaza polifenolowa (PPO, tyrozynaza EC 1.14.18.1) jest endogennym enzymem,
szeroko rozpowszechnionym w środowisku naturalnym, produkowanym zarówno przez bakterie,
grzyby, jak i rośliny wyższe, zwierzęta oraz człowieka [1-4]. Aktywność PPO powiązana jest z
wieloma, biologicznie istotnymi, funkcjami. Na przykład u roślin i grzybów odpowiada za
brązowienie tkanek, powstałe wskutek mechanicznego ich uszkodzenia, a u owadów bierze udział
w procesie sklerotyzacji egzoszkieletu i ochronie przed mikroorganizmami. Natomiast u ssaków
jest odpowiedzialna za pierwsze dwa etapy melanogenzy i prawidłową pigmentację skóry oraz
uczestniczy w podstawowej odpowiedzi immunologicznej organizmu. Oksydazę polifenolową
charakteryzuje szeroka specyficzność substratowa (m. in.: chlorofenole, aminofenole, krezole,
katechole, aminy aromatyczne), dzięki czemu posiada wiele potencjalnych zastosowań
praktycznych, takich jak: produkcja o-difenoli o właściwościach przeciwutleniających (np.
hydroksytyrozol), biosynteza leków (np. L-DOPA), otrzymywanie polimerów, detekcja oraz
biokonwersja związków fenolowych i ich pochodnych [2]. Ogólnie, enzym ten, w obecności tlenu
cząsteczkowego, posiada zdolność katalizowania dwóch typów reakcji: hydroksylacji monofenoli
do o-difenoli (aktywność monofenolazowa, krezolazowa) oraz utleniania o-difenoli do o-chinonów
(aktywność difenolazowa, katecholazowa), które następnie, w obecności związków nukleofilowych,
podlegają nieenzymatycznym przekształceniom z wytworzeniem różnorodnych pigmentów
(Rysunek 1).
Rysunek 1. Uproszczony schemat reakcji katalizowanych przez tyrozynazę.
1
PROCEDURA IZOLACJI OKSYDAZY POLIFENOLOWEJ Z PIECZAREK [5]
1. wszystkie etapy prowadzić w 4 °C (łaźnia lodowa) !!!;
2. do 150 g drobno pokrojonych pieczarek dodać 250 mL zmrożonego acetonu (-20 °C) i
homogenizować przez 2 min, aż do uzyskania jednolitej zawiesiny;
3. otrzymaną zawiesinę umieścić na mieszadle magnetycznym i ekstrahować przez 30 min;
4. przefiltrować pod próżnią na lejku Buchnera;
5. supernatant odrzucić, a pozostałą biomasę roztworzyć przy użyciu bagietki w 100 mL 0,1 M
buforu fosforanowego o pH 7,0 z dodatkiem 1% poliwinylopirolidonu (PVP), przenieść do
kolby ssawkowej i pod próżnią (zastosowanie pompki wodnej) usuwać pozostałości
acetonu, aż do zaniku charakterystycznego zapachu (ok. 1 h);
6. następnie zawiesinę odwirowywać (20 min, -2 °C, 7 000 rpm) i odrzucić osad;
7. natomiast supernatant traktować jako surowy ekstrakt enzymu, w którym należy oznaczyć
aktywność względem 1 mM L-Tyrozyny jako substratu oraz stężenie białka.
Surowy preparat enzymatyczny przechowywać do dalszych badań w -20 °C (na jedną grupę 2
pojemniki po ok. 40-50 mL preparatu oraz przynajmniej 2 plastikowe probówki po 10 mL).
OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ
Pomiar aktywności enzymu natywnego prowadzić w temperaturze pokojowej, w 0,1 M
buforze fosforanowym o pH 7,0 i w obecności 1 mM L-Tyrozyny lub L-DOPA jako substratu.
W procedurze standardowej do 1,0 ml substratu dodać 100 μl roztworu enzymu, szybko zmieszać
i przenieść do kuwety. Następnie przy użyciu spektrofotometru UV/Vis monitorować zmiany
absorbancji w czasie przy długości fali λ= 475 nm.
Przed pomiarami aparat wyzerować na roztwór substratu.
Aktywność enzymu wyrazić liczbą jednostek aktywności w 1 mL roztworu tyrozynazy według
wzoru:
1000
1
U 


 1000 
Aktywność 
 min mL mL 
A475 nm VR

t
VE
(1)
gdzie: ΔA475nm – zmiana absorbancji w czasie Δt, w liniowym zakresie pomiaru przy długości fali
475 nm [min-1]; VR – całkowita objętość analizowanego roztworu [mL]; VE – objętość enzymu
użytego w pomiarach [mL].
Aktywność właściwą wyrazić jako ilość jednostek aktywności, przypadającą na 1 mg białka
i obliczyć według następującego wzoru:
2
A
V
U 
1
1000 1


 1000 475nm  R 

t
VE C B
 min mL mL 
Aktywność właściwa 
(2)
gdzie: CB – stężenie białka w próbce badanego enzymu [mg.mL-1].
OZNACZANIE STĘŻENIA BIAŁKA
Ilość białka w badanych preparatach tyrozynazy oznaczano metodą Lowry’ego [6] przy
użyciu testu Sigma 5656. Stężenie białka w badanych próbkach wyznaczano na podstawie krzywej
standardowej, wykonanej dla albuminy wołowej w zakresie stężeń od 10 do 400 μg.mL-1 (krzywą
standardową należy sporządzić samodzielnie na zajęciach w trzech powtórzeniach).
Procedura testu na białko:
- 0.5 ml albuminy wołowej o danym stężeniu (lub enzymu odpowiednio rozcieńczonego w wodzie)
+ 0.5 ml odczynnika Lowry’ego;
- przygotować również próbkę zerową 0.5 ml H2O + 0.5 ml odczynnika Lowry’ego;
- tak przygotowane próbki wymieszać i zostawić na 20 min w temperaturze pokojowej;
- po 20 minutach dodać 0,25 ml odczynnika Follina i natychmiast po dodaniu każdą próbkę
dokładnie wymieszać!!!! i odstawić na 30 min;
- po upływie 30 min od dodania odczynnika Follina zmierzyć Abs próbek przy λ=750 nm;
- wynik w [mg.mL-1] obliczyć na podstawie krzywej wzorcowej.
PRZYGOTOWANIE ROZTWORÓW
0,1 M bufor fosforanowy o pH 7.0  5,28 g KH2PO4 + 21,91 g Na2HPO4  dopełnić wodą
destylowaną do 1 L
1 mM L-Tyrozyna (M=181,2 g/mol)
1 mM L-DOPA (M=197,19 g/mol)
BIBLIOGRAFIA
1.
Claus H., Decker H., Bacterial tyrosinases, Syst. Appl. Microbiol. 29 (2006), 3-14;
2.
Halaouli S., Asther M., Sigoillot J.C., Hamdi M., Lomascolo A., Fungal tyrosinases: new prospects in molecular
characteristics, bioengineering and biotechnological applications, J. Appl. Microb. 100 (2006) 219-232;
3.
Marusek C.M., Trobaugh N.M., Flurkey W.H., Inlow J.K., Comparative analysis of polyphenol oxidase from plant
and fungal species, J. Inorg. Biochem. 100 (2006) 108-123;
4.
Hearing V.J., Nicholson J.M., Montague P.M., Ekel T.M., Tomecki K.J., Mamalian tyrosinase: structural and
functional interrelationship of isozymes, Biochim. Biophys. Acta 522 (1978) 327-339;
5.
Zynek K., Bryjak J., Dobór warunków izolacji i oczyszczania tyrozynazy z Agaricus bisporus, Inż. Aparat. Chem.
3 (2009) 125-126;
6.
Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol.
Chem. 193 (1951) 265-275.
3