Chromatograficzne metody oczyszczania peptydów

Chromatografia
Chromatograficzne metody oczyszczania peptydów
Wojciech Kamysz
Laboratorium Badawczo-Rozwojowe, Lipopharm.pl
Poszukiwanie skutecznych substancji o znaczeniu terapeutycznym i diagnostycznym w ostatnich latach w dużej części skupia
się wokół syntetycznych oligo- i
polipeptydów. Peptydy stanowią
wielce obiecującą grupę substancji. Mnogość tworzonych przez
nie struktur powoduje, że związki te wykazują rozmaite działania
biologiczne. W badaniach znajdują się tysiące nowych naturalnych jak i typowo syntetycznych
peptydów. Pozyskiwanie tych
związków na skalę laboratoryjną
oraz przemysłową stanowi jednak ciągle duże wyzwanie. Jednym z najważniejszych etapów
jest oczyszczanie wyizolowanego
lub otrzymanego syntetycznie
produktu. Metody oczyszczania peptydów były udoskonalane
przez ponad pół wieku od historycznego otrzymania syntetycznej oksytocyny przez Vigneaud
(1954 r.), czy opracowania syntezy
na stałym nośniku polimerowym
(Merrifield, 1961 r.). Mimo to nie
ma nadal jednej, uniwersalnej
techniki pozyskiwania czystych
związków. Zmiana czasem jednego aminokwasu w sekwencji
peptydu na inny zmienia do tego
stopnia właściwości związku, że
zawodzą dotychczas stosowane
metody. Zdarza się, że najbardziej
wytrwali syntetycy mają problemy z niepozornie wyglądającymi
peptydami. Sytuacje takie powodują, że oczyszczanie peptydów
jest jednym z najtrudniejszych
22
etapów pozyskiwania tych związ
ków. Sposób izolacji oraz oczyszczania peptydów przez lata był
podyktowany dostępnymi metodami rozdziału oraz możliwościami analitycznymi. Rozwój technik
analitycznych opartych o spektrometrię mas oraz wysokorozdzielczych metod chromatograficznych
i elektroforetycznych narzucił też
nowe standardy badania czystości
peptydów. Peptydy, które kiedyś
analizowane wyłącznie metodą
chromatografii cienkowarstwowej
(TLC) były uważane za czyste, nie
spełniały by współczesnych wymagań czystości.
Nietrwałość peptydów
U podstaw problemów związanych
z czystością peptydów leży najczęściej podatność ich struktury na
zmiany chemiczne. Obecność w
strukturze łańcucha peptydowego
łańcuchów bocznych aminokwasów zawierających różne reaktywne grupy funkcyjne powoduje, że
peptydy są podatne na różne czynniki zewnętrzne zarówno podczas
syntezy chemicznej, oczyszczania
surowych produktów jak i późniejszego przechowywania. Jest
wiele różnych typów reakcji chemicznych zachodzących podczas
syntezy i oczyszczania peptydów.
Już podczas syntezy zachodzić
może agregacja lub racemizacja. Peptydy nawet oczyszczone
mogą w roztworach wodnych
ulegać hydrolizie, deamidacji, czy
utlenianiu.
Rozwój metod otrzymywania
peptydów
Od wczesnych lat 60-tych XX wieku peptydy w dużej mierze otrzymywane są metodą na stałym
nośniku polimerowym. Technika
ta polega na przyłączeniu pierwszego aminokwasu do nierozpuszczalnego nośnika i dobudowywaniu kolejnych aminokwasów z
pominięciem konieczności kłopotliwej krystalizacji produktów pośrednich. Przez lata metoda ta była
uważana za bardzo drogą jednak
czynniki ekonomiczne związane
z kosztami personelu oraz ograniczeniami czasowymi skłoniły nawet przemysł do przejścia na syntezę na nośniku. W chwili obecnej
stosuje się dwie metody syntezy.
Metodę z wykorzystaniem chemii
Boc- oraz nowszą chemię Fmoc.
Otrzymane w wyniku syntezy
metodą Boc peptydy charakteryzują się wysokim stopniem zanieczyszczenia produktami różnych
reakcji zachodzących podczas
kondensacji kolejnych aminokwasów oraz deprotekcji finalnego
produktu z nośnika polimerowego. Rozwój nowych technik syntezy w oparciu o chemię Fmoc
spowodował, że związki już po
syntezie są przyzwoitej jakości.
Czystość surowych produktów sięga nawet 90%, a oczyszczanie takich próbek jest
stosunkowo proste i tanie.
Biorąc pod uwagę fakt, że peptydy należą do substancji o bardzo
wysokiej aktywności biologicznej,
Laborant Nr 1/2010
Chromatografia
zwykle nie ma potrzeby budowania chromatografów procesowych. Do oczyszczania peptydów
w laboratorium wystarczy prosty
chromatograf preparatywny wyposażony w pompę gradientową
i detektor spektrofotometryczny.
Większość znanych leków peptydowych otrzymuje się bowiem
zaledwie w skali do 100kg w roku.
Laboratoria badawcze mogą z sukcesem korzystać z jednego, wspólnego dla analizy i oczyszczania
peptydów w skali semipreparatywnej chromatografu cieczowego. Większość bowiem dostępnych urządzeń HPLC umożliwia
przepływy w zupełności wystarczające do obsługi kolumn o średnicy nawet do 16 mm. Jedynym
ograniczeniem może być objętość
pętli nastrzykowej dozownika,
która do naniesienia oczyszczanej
próbki musi posiadać większą objętość. Pętla stanowi jednak jeden
www.czasopismolaborant.pl
z najtańszych elementów zesta- chromatografia metalopowinowu. HPLC i może być bez wiel- wactwa oraz filtracja żelową z pokiego nakładu pracy zamieniana. -wodzeniem nadal są stosowane
w oczyszczaniu dużych białek.
Współczesne oczyszczanie pep- Oczyszczanie w ten sposób peptydów przez niektóre zespoły naukotydów
Wraz z rozwojem metod syntezy we podyktowane jest jednak nadal
rozwijały się metody oczyszcza- brakiem dostępu do współczenia tych związków. Do dziś dnia snych (dostępnych od lat 70-tych!)
w niektórych laboratoriach moż- metod opartych o wysokosprawną
na spotkać eksperymentatorów chromatografię cieczową (HPLC)
czyszczących peptydy na typo- z wykorzystaniem chromatograwym żelu krzemionkowym czy fów gradientowych. Powszechnie
preparatywnych płytkach TLC. wiadomo, że peptydy należą do
Z chromatografii kolumnowej struktur o niskiej trwałości chestosuje się nadal chromatografię micznej podczas otrzymywania
jonowymienną oraz sączenie na oraz późniejszego przechowyżelach (filtrację żelową) na zło- wania. Gotowe (czyste) związki z
żach dekstranowych. Należy tutaj sukcesem zabezpiecza się przed
wspomnieć, że skuteczny rozdział utratą trwałości poprzez suszepeptydu na złożu Sephadex od po- nie liofilizacyjne oraz pakowanie
dobnych strukturalnie zanieczysz- w atmosferze gazów obojętnych.
czeń uzyskuje się podczas rozdzia- HPLC, szczególnie oparte o układ
łu trwającego nawet kilka dni. faz odwróconych, jest obecnie
Chromatografia jonowymienna, uważane za standard zarówno
23
Chromatografia
w laboratorium naukowym, ale
i przemysłowym. Próby zastosowania innych metod oczyszczania peptydów na przełomie
ostatnich lat zwykle kończyły się
powrotem do HPLC. Separacja
peptydu od często bardzo podobnych zanieczyszczeń (zwykle
też peptydów), wymaga bowiem
metod wysokorozdzielczych. Z
pomocą przychodzą też metody
masowe, które potwierdzają tożsamość, ale też często zgrubnie czystość analizowanych związków.
modyfikatorów należy też kwas nieorganicznej soli. Samo złoże
heptafluoromasłowy (HFBA) oraz niewiele różni się od wymieniaczy
fosforan trietylominy (TEAP). jonowych stosowanych powszechJako fazę stacjonarną w oczysz- nie w przemyśle do zmiękczania
czaniu peptydów stosuje się po- wody, tym samym jonowymieniadobne złoża jak w rozdziałach cze te nie mogą być drogie. Ziaranalitycznych. Różnica w kolum- na jonitu zbudowane są zwykle z
nach analitycznych i preparatyw- polistyrenu sieciowanego diwinynych polega na większej średnicy lobenzenem a w tą matrycę wbukolumny oraz większej średnicy dowuje się różne ugrupowania joziaren sorbentu (zwykle 7 lub 10 nowe (kationowe lub anionowe).
µm). Jako wypełnienia kolumn Same ziarna jonitów wykazują
stosuje się krzemionkę modyfi- dużą porowatość a co za tym idzie
kowaną łańcuchami alkilowymi dużą zdolność wymiany jonów.
C8 lub C18. Ilość peptydu możli- Droższe jonity typu „fast flow” stoChromatografia preparatywna
wa do oczyszczenia na tego typu sowane głównie w laboratoriach
Zwykle stosuje się układ faz od- kolumnach przedstawia tabela 1. naukowych otrzymuje się na bazie
wróconych. Fazę ruchomą staagarozy. Niewątpliwą wadą wynowi układ rozpuszczalników Inne
przemysłowe
metody mieniaczy jonowych jest niska odwoda-acetonitryl. Wykorzystanie oczyszczania peptydów
porność na wysokie temperatury.
acetonitrylu niesie ze sobą wiele Poza typowymi rozdziałami pep- Na innej zasadzie działa filtracja
zalet. Jest on łatwy do odparowa- tydów z użyciem HPLC jako me- żelowa. Stosuje się ja głównie do
nia z próbek (frakcji), wykazuje tody uniwersalnej i dającej bardzo oczyszczenia peptydów ze składbardzo niską absorbancję w ba- dobre efekty przemysł nadal ko- ników niskocząsteczkowych (np.
danym zakresie UV (dla pepty- rzysta z metod starszych i spraw- cukrów) lub typowego odsolenia
dów zwykle 214 nm) oraz posiada dzonych. Do metod tych należą próbek po syntezie lub oczyszniską lepkość, co znajduje swo- przede wszystkich chromatografia czaniu na jonicie. Selektywność
je odbicie w niskich ciśnieniach jonowymienna stosowana jako rozdziału jest uzyskiwana poprzez
wstecznych podczas rozdziału. jedna z pierwszych metod chro- różnice w wielkości cząsteczek
Nie bez znaczenia jest tez przy- matograficznych oraz filtracja oczyszczanych substancji. Małe
zwyczajenie eksperymentatorów, żelowa. Podstawową zaletą chro- związki wnikają do środka ziaren,
którzy stosują ten rozpuszczal- matografii jonowymiennej jest duże „omijają” ziarna i przemiesznik od samego początku historii cena eluentów. Zwykle stosuje czają się wraz z roztworem rozHPLC. Alternatywnie, chociaż się roztwory wodne soli nieorga- puszczalnika ku dołowi kolumny.
niezmiernie rzadko stosuje się nicznych a rozdziały prowadzi się Ponieważ niskocząsteczkowe pepalkohole metylowy lub etylowy. w gradiencie pH lub gradiencie tydy po pewnym czasie opuszczają
Do fazy ruchomej dodaje się jeden
z długiej listy modyfikatorów, któ- Tabela 1. Typy kolumn stosowanych w oczyszczaniu peptydów metodą HPLC
re mają za zadanie hamowanie odTeoretyczna
Maksymalna
Wymiary
Możliwy przepływ zdolność
ilość możliwa do
działywań nieselektywnych anali- Typ kolumny
kolumny
rozdzielcza
oczyszczenia *
zowanych związków chemicznych
z wolnymi grupami silanolowymi Kolumna
4,6 x 250 mm
0,5-2 ml/min
1-100µg
1-10 mg
analityczna
na powierzchni sorbentu. Najczęściej stosuje się 0,1% kwas tri- Kolumna
10 x 250 mm
2-5 ml/min
1-10 mg
50-200 mg
semipreparatywna
fluorooctowy (TFA), który ma
32 x 250 mm
20-50 ml/min
10-50 mg
200-1000 mg
podobne zalety jak acetonitryl. Kolumna
preparatywna
Przede wszystkim jest on łatwy do
50 x 250 mm
50-100 ml/min
50-100mg
1000-5000 mg
usunięcia z próbki. Do znanych Kolumna
procesowa
*na podstawie danych doświadczalnych Laboratorium syntezy peptydów (Lipopharm.pl)
24
Laborant Nr 1/2010
Chromatografia
ziarna obserwuje je się w kolejnych frakcjach eluatu. W zależności jakie masy cząsteczkowe
posiadają składniki mieszaniny
stosuje się różne żele Sephadex.
Najmniejsze peptydy oczyszcza się na złożu Sephadex G-10
(rozdziela masy mniejsze od 700
Da), większe na G-15, G-20 lub
LH-20 (hydroxypropylowany żel
G-15). Duże polipeptydy i białka nanosi się na kolumny typu
G o wyższych numerach. Główne zasady stosowane podczas
rozdziałów na żelach to mała
www.czasopismolaborant.pl
objętość próbki (najlepiej maksymalnie 1ml), stosunkowo powolny przepływ fazy ruchomej,
tak aby cały rozdział trwał 1-2
dni oraz długa kolumna chromatograficzna (zwykle 100 cm).
Techniką filtracji żelowej na klasycznej kolumnie o średnicy 2
cm można oczyścić stosunkowo
niewielką ilość substancji (50100mg) i to jest niewątpliwie jedna z ważniejszych wad tej metody.
Podsumowanie
Dobór odpowiedniej
oczyszczania peptydów jest trudny
i od tego etapu zależy finalny sukces otrzymania peptydu o wymaganej czystości. Wiedza na temat
współczesnych, ale i czasem historycznych metod oczyszczania
jest konieczna celem opracowania
odpowiedniej strategii oczyszczania i późniejszego zatężania frakcji peptydowej przed procesem
suszenia. Zwykle oczyszczanie
jest dwuetapowe i wykorzystuje chromatografie jonowymienną, a finalny produkt doczysztechniki cza się z wykorzystaniem HPLC.
25